Биосенсорные материалы на основе полимерных пленок с иммобилизованными производными краун-эфиров 03. 01. 04-биохимия 03. 01. 06-биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Вид материала

Автореферат

Содержание Научные руководители Царькова Марина Сергеевна Ведущая организация Общая характеристика работы Научная новизна работы Теоретическая и практическая значимость. Основные положения, выносимые на защиту Апробация работы. Личный вклад автора. Структура и объем работы. Собственные исследования Результаты собственных исследований и их обсуждение 1. Разработка модифицированной методики полива пленок и экспериментально-расчетного метода. 2. Спектральные характеристики КЭ №5, иммобилизованного в полимерные матрицы, при взаимодействии с аминокислотами 3. Спектральные характеристики КЭ №3, КЭ №4, КЭ №6 с катионами кальция. Кэ №3+цагф 4. Разработка метода контролируемой диффузии для изучения процессов комплексообразования КЭ с катионом кальция 5. Исследование комплексобразования КЭ №3 в матрице на основе желатина с перхлоратом и хлоридом кальция Практические предложения

Подобный материал:

• Программа кандидатского экзамена послевузовского профессионального образования (аспирантура), 424.16kb.
• Реферат по научно-исследовательской работе г 08 Нано- и микроструктурная модификация, 64.1kb.
• Разработка идентификации bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических, 373.19kb.
• «Обзор методов получения пленок и их свойств», 131.51kb.
• Наночастицы металлов в растворах: биохимический синтез, свойства и применение 03. 01., 843.88kb.
• Характеристика новых свойств пробиотических препаратов серии «экофрэнд» 03. 01., 302.88kb.
• Научно-образовательный комплекс по кредитной технологии обучения опорные конспекты, 358.84kb.
• Учебное пособие по курсу "Биотехнология" для студентов фармацевтического факультета, 1364.67kb.
• Общая биология и микробиология, 206.6kb.
• Изменение ферментативной активности нативного и иммобилизованного солода под влиянием, 360.17kb.

На правах рукописи


Тимонин Андрей Николаевич


Биосенсорные материалы на основе полимерных пленок с иммобилизованными производными краун-эфиров


03.01.04-биохимия

03.01.06-биотехнология (в том числе бионанотехнологии).


Автореферат


диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук


Москва - 2010

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Московская государственная

академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

(ФГОУ ВПО МГАВМиБ)


Научные руководители: доктор биологических наук,

доктор химических наук,

профессор Зайцев Сергей Юрьевич;


доктор химических наук,

профессор

Царькова Марина Сергеевна


Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Еремец Владимир Иванович

доктор ветеринарных наук, профессор Преображенский Сергей Николаевич


Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ "ВГНКИ")


Защита диссертации состоится « 2 » марта 2011 г. в 12 ³⁰ часов

на заседании диссертационного совета Д 220.042.04 в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел.: (495) 377-93-83


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»


Автореферат разослан «_31__» _января_2011 г. и размещен на

сайте br />

Ученый секретарь

диссертационного совета В.Д. Фомина

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Использование принципов организации и функционирования биологических мембран для создания хемосенсорных материалов (ХМ) с целью оптического контроля биохимически активных веществ в настоящее время является одной из активно развивающихся областей науки, «на стыке» биологической и биоорганической химии, физической и коллоидной химии, биомедицины и бионанотехнологии [Штильман М.И., 2006; Зайцев С. Ю., 2010 и др.]. Одним из подходов для создания хемосенсорных материалов является приготовление композиций на основе ряда необходимых компонентов (хромоионофора и одного или нескольких полимеров и/или сополимеров) для конкретных применений. Действие оптических хемосенсоров основано на измерении поглощения и флуоресценции фоточувствительного реагента при контакте сенсора с определяемым биологически-активным веществом, так называемым «аналитом» [Алфимов М.В., 1997; Громов С.П., 2007 и др.]. Мониторинг как окружающей среды, так и физиолого-биохимического статуса живых организмов становится все более актуальной и важной задачей по мере развития промышленности, производства медицинских и ветеринарных препаратов [Алыкова, Т.В., 2002; Ермаков В.В., 2008 и др.]. Еще одной актуальной проблемой является создание материалов диагностических систем для «микроробота», работающего непосредственно внутри сосудов человека и животных.

Данная работа проводилась в рамках проекта «2007-3-2.3-11-02-003» по федеральной научно-технической целевой программе ФНТЦП Минобрнауки РФ «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2012 годы» по теме «Создание системы очувствления внутрисосудистого микроробота для сбора информации о ситуации внутри полости биообъекта» на 2007-2009 г.г. кафедры органической и биологической химии ФГОУ ВПО МГАВМиБ (совместно с МГТУ имени Н.Э. Баумана и ЦФ РАН).

Цель работы – разработка методики, получение и исследование хемосенсорных наноструктурированных материалов на основе фоточувствительных производных краун-эфиров для детекции аминокислот и катионов кальция.

Исходя из этой цели, были поставлены задачи:

1. Получить и исследовать хемосенсорные материалы (ХМ) на основе синтетических и биологических полимеров, в том числе — с включением биоорганических соединений типа азокраун-эфирных производных стириловых красителей (КЭ). Изучить оптические свойства этих соединений в различных биополимерных матрицах. Оптимизировать методы получения и свойства ХМ.

2. Провести спектральный анализ хемосенсорных материалов с КЭ №5 в присутствии ряда аминокислот.

3. Разработать экспериментально-расчетные подходы и методики исследования комплексообразования производных краун-эфиров с катионами кальция.

4. Разработать рецептуру получения хемосенсорных материалов на основе желатина и иммобилизованных в него производных краун-эфиров.

5. Оценить перспективность полученных монослоев и краун-содержащих композитных материалов с основой из биополимерной матрицы и для создания сенсорных элементов устройств оптического контроля щелочноземельных металлов (на примере кальция) и малых органических молекул (на примере аминокислот).

Научная новизна работы. Разработан экспериментально-расчетный метод (ЭРМ) для математического описания процессов при исследовании и получении ХМ. Разработана новая методика исследования производных краун-эфиров, селективных к катионам кальция, названная «методом контролируемой диффузии» (МКД). Посредством данной методики были изучены особенности процесса комплексообразования некоторых производных краун-эфиров с катионами кальция. Предложена новая рецептура получения сенсорных материалов на основе двух типов краун-эфиров, иммобилизованных в пленку из желатина.

Теоретическая и практическая значимость.

Получены фундаментальные результаты по фоточувствительным свойствам краунсодержащих стириловых красителей в полимерных матрицах при взаимодействии с катионами кальция и рядом аминокислот. Получены краунсодержащие композитные материалы для создания сенсорных элементов устройств оптического контроля катионов кальция и ряда аминокислот. Результаты диссертационной работы используются для обучения студентов 3, 4 и 5 курсов и магистров ветеринарно-биологического факультета и в рамках НОЦ (ГК № 02.740.11.0270 и ГК № 02.740.11.0718) ФГОУ ВПО МГАВМиБ в учебных курсах «Биохимия», «Физическая и коллоидная химия», «Спектральные методы исследования» и «Бионанотехнологии».

Результаты работы использованы совместно с МГТУ имени Н.Э. Баумана и ЦФ РАН в рамках гос. контракта №02.523.12.3009 «Создание микророботехнического комплекса на основе внутрисосудистого микроробота для осуществления диагностических, терапевтических (доставка лекарственных препаратов) и хирургических процедур при атеросклеротических заболеваниях трубчатых органов», включая совместный патент РФ № 2389745 (см. список работ).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Методики получения оптимальных по составу и свойствам матриц из синтетических и биологических полимеров.
   
2. Методики изучения поведения биоорганических молекул в растворах и матричном окружении на модели фотохромных производных краун-эфиров.
   
3. Данные по спектральным характеристикам комплексов биоорганического азакраун-содержащего соединения (КЭ №5) с аминокислотами: глицином, фенилаланином, аланином, серином, аргинином, изолейцином, лизином.
   
4. Спектральные характеристики комплексов биоорганических азакраун- содержащих соединений (КЭ №3, №4, №6) с катионами кальция.
   
5. Хемосенсорные материалы с иммобилизированными биоорганическими соединениями как элементы сенсорных устройств оптического контроля катионов кальция и некоторых аминокислот.
   

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на III международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике (МГУ, Москва, 2008); на международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (ФГОУ ВПО МГАВМиБ, Москва, 2008); на конференциях молодых ученых и семинарах в ФГОУ ВПО МГАВМиБ (2006-2009); на V Каргинской конференции (МГУ, Москва, 2010); на V Международной научной конференции «Актуальные проблемы в животноводстве» (ГНУ ВНИИФБиП с./х. животных, Боровск, 2010);на 2-й международной молодежной школе-конференции по физической химии краун-соединений, порфиринов и фталоцианинов (Туапсе, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 6 статей (в т.ч. 2 - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК), 7 тезисов докладов на российских и международных конференциях, 1 патент РФ.

Личный вклад автора. Все этапы работы, включая разработку методик, проведение эксперимента, обработку и анализ полученных результатов были проведены лично автором или при его непосредственном участии.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Материалы диссертационной работы изложены на 125 страницах машинописного текста и включают 34 рисунка и 18 таблиц. Список литературы содержит 87 источников (из них 30 отечественных и 57 зарубежных).

Собственные исследования

Материалы и методы

В работе использовали следующие реактивы:

Биоорганические соединения на основе фоточувствительных краун-эфиров (КЭ), синтезированные в Центре Фотохимии РAH (табл. 1).

Таблица 1. Фоточувствительные биоорганические соединения.

Название	Структура	Молекулярная масса
КЭ №3		570
КЭ №4		607
КЭ №5		1113
КЭ №6		613

Полимеры: целлюлозы ацетатгидрофталат (ЦАГФ), целлюлозы ацетатбутират (ЦАБ), поливинилбутираль (ПВБ), полистирол (ПС), поливинилхлорид (ПВХ); также в работе использовались, помимо полимерных, гелевые матрицы на основе желатина. Растворители: ацетон, хлороформ, ацетонитрил, дихлорэтан, метанол. Соли: перхлораты кальция и натрия СaClO₄₂, NaClO₄, хлориды кальция и натрия NaCl, CaCl₂. Аминокислоты: глицин, фенилаланин, аланин, серин, аргинин, изолейцин, лизин.

Методики получения полимерных пленок: из приготовленных растворов полимеров и КЭ по стандартной и модифицированной методикам готовили тонкие пленки ХМ на стеклянных и кварцевых подложках (для получения спектров поглощения и флуоресценции).

Спектры поглощения получали на спектрофотометрах «Hitachi 330» и «Helios β», спектры флуоресценции - на спектрофлуориметрах «Hitachi 550» и «Shimadzu RF 5000». Сравнивали спектры поглощения и флуоресценции чистого полимера и полимера с добавлением КЭ в области 300-700 нм. В пленке, где присутствует КЭ, наблюдали появление характерного выраженного пика, максимум которого регистрировали при соответствующей длине волны. Затем пленки, содержащие КЭ, подвергали воздействию водных растворов солей катионов кальция или аминокислот с разной концентрацией в течение от 10 до 60 мин. Снова записывали спектры поглощения и флуоресценции и фиксировали изменения интенсивности и длины волны максимума поглощения и флуоресценции. Монослои КЭ-5 в смеси со стеариновой кислотой (С18) в соотношении КЭ-5:С18, равном 1:2 получали и исследовали методами Ленгмюра-Блоджет и Вильгельми. Для исследования фоточувствительных свойств монослоев применяли спектральные методы.

Статистическую обработку проводили с помощью пакета программ "Статистика". Значения критерия достоверности определяли на основе распределения Стьюдента с учётом принятого для научных экспериментов уровня значимости 0,05*, 0,01**, 0,001***.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

В работе использовали полимерные матрицы с иммобилизованными КЭ, которые, при контакте с биогенными «аналитами», дают молекулярные комплексы. Такую систему можно рассматривать как продукт бионанотехнологий, поскольку все реагенты образуют наноразмерные комплексы, а процесс получения хемосенсорного материала проводится по оригинальной технологии.

1. Разработка модифицированной методики полива пленок и экспериментально-расчетного метода.

Достоинством получения пленок методом полива является его простота. Однако необходимым условиям метода является растворимость полимера и КЭ в одинаковых растворителях, что не всегда осуществимо. С целью повышения чувствительности ХМ и экономии КЭ была разработана модифицированная методика, суть которой состоит в следующем. При стандартном методе получения пленок из раствора (содержащего одновременно и полимер, и КЭ) КЭ распределяется в полимерной матрице равномерно по всей толщине. Поскольку среда пленки гидрофобна, то это создает препятствия для проникновения катиона растворенного в воде «аналита» вглубь пленки. В модифицированном методе изготавливают двухслойную пленку, первый слой которой получен из раствора полимера, а второй — из раствора КЭ, причем могут быть использованы разные растворители. В такой пленке концентрация КЭ в поверхностном слое возрастает, что приводит к повышению чувствительности ХМ и подтверждается спектральными данными (рис.1).

а

б

Рисунок 1. Спектры поглощения КЭ №5 в пленках ЦАГФ до (кривая 1) и после (кривая 2) контакта с раствором «аналита», полученные по стандартной (а) и модифицированной (б) методике.

Приложение экспериментально-расчетного метода (ЭРМ) для определения глубины иммобилизации КЭ в ЦАФ.

Получение полимерных матриц с иммобилизованными в них КЭ требует информации о характере этого процесса в зависимости от выбранной технологии получения ХМ. В частности, важной информацией является глубина вещественной иммобилизации в матричное окружение.

Принцип ЭРМ состоит в выборе основной модели исследования, целью которой является установление основных закономерностей процессов пленкоформирования, с последующим предложением эмпирической расчетной формулы. Для формирования пленок, ведущим механизмом которого является отношение кинетики испарения растворителя и растворения полимера, была установлена эмпирическая расчетная формула для системы ЦАФ/ацетон:

ω= m:(m+ρ(V₀ -10^-2e^ω% )),

где ω – массовая доля полимера, m – масса полимера, растворенного раствором КЭ, ω% - массовая доля полимера, выраженная в процентах, ρ – плотность растворителя (г/мл), V₀ – начальный объем раствора КЭ (мл). Эта формула связывает массовую долю раствора с массой растворенного полимера, что позволяет рассчитать толщину проникновения КЭ в пленку (толщина активной зоны) h:

h=(m/m₀)·h₀,

где h – толщина активной зоны, m – максимальная масса растворенного полимера, m₀ – общая масса полимера пленки, h₀ – общая толщина полимерной пленки. Для системы ЦАФ/ацетон толщина активной зоны составляет 1,45 мкм.

2. Спектральные характеристики КЭ №5, иммобилизованного в полимерные матрицы, при взаимодействии с аминокислотами

Для получения спектров флуоресценции использовали пленки ЦАФ, содержащие КЭ №5, толщиной 10 мкм, отлитые на кварцевых подложках. Использовались растворы следующих аминокислот с концентрацией 1 мМ: глицин, фенилаланин, аланин, серин, аргинин, изолейцин, лизин. В спектрах флуоресценции ЦАФ с КЭ №5 наблюдается максимум флуоресценции при длине волны λ= 512 нм (на рис. 2 пунктирная кривая 1).

Рисунок 2. Спектр флуоресценции КЭ № 5 в пленке ЦАФ до (кривая 1) и после (кривая 2) выдерживания в растворе фенилаланина с концентрацией 1 мМ.

Данные из спектров флуоресценции ХМ, содержащих КЭ №5, до и после взаимодействия с аминокислотами, приведены в таблице 2.

Таблица 2. Флуоресценция полимерных пленок на основе ЦАФ, содержащих КЭ № 5, до и после выдерживания в водных растворах аминокислот с концентрацией 1 мМ.

Аминокислота	, нм, (до пропитки)	, нм, (после пропитки)	сдвиг , нм
глицин	512±1	520±1	+8
фенилаланин	512±1	524±1	+12
аланин	512±1	517±1	+5
серин	512±1	520±1	+8
аргинин	512±1	521±1	+9
изолейцин	512±1	519±1	+7

Видно, что после воздействия на полимерную матрицу ЦАФ с КЭ №5 водными растворами аминокислот в спектрах наблюдаются следующие сдвиги длины волны максимума флуоресценции: для раствора фенилаланина он составляет 12 нм, аргинина - 9 нм, для глицина и серина - 8 нм, изолейцина - 7 нм и аланина - 5 нм. Таким образом, наибольший сдвиг максимума флуоресценции наблюдается для раствора фенилаланина. Эти данные свидетельствуют о возможном использовании ХМ на основе ЦАФ и КЭ № 5 для возможной детекции аминокислот.

Для получения наноразмерных пленок была использована альтернативная технология (Лэнгмюра). Этой технологией были получены монослои КЭ №5 со стеариновой кислотой (мольное соотношение 1:2) в присутствии и в отсутствие водного раствора лизина (концентрации лизина 1 мМ). Из сравнения спектров флуоресценции найден батохромный сдвиг на 2 нм, что не является достоверным доказательством процесса комплексообразования КЭ № 5 с лизином в монослоях.

3. Спектральные характеристики КЭ №3, КЭ №4, КЭ №6 с катионами кальция.

Для получения спектров поглощения и флуоресценции использовали пленки ЦАФ, ЦАГФ, ПВБ, содержащие КЭ №3, КЭ №4, КЭ №6 толщиной 10 мкм, отлитые на кварцевых подложках. Данные по спектрам флуоресценции приведены на рис. 3 — 5.

	Рисунок 3. Спектр флуоресценции КЭ №6 в матрице ЦАФ до (кривая 1) и после (кривая 2) выдерживания в растворе перхлората кальция с концентрацией 1 мМ
	Рисунок 4. Спектр флуоресценции КЭ №3 в пленке ЦАГФ до (кривая 1) и после (кривая 2) выдерживания в растворе перхлората кальция с концентрацией 1 мМ.
	Рисунок 5. Спектр флуоресценции КЭ №4 в пленке ПВБ до (кривая 1) и после (кривая 2) выдерживания в растворе перхлората кальция с концентрацией 1 мМ.

Данные из спектров флуоресценции ХМ, содержащих КЭ №3, до и после взаимодействия с солями кальция, приведены в таблице 3.

Таблица 3. Флуоресценция полимерных пленок на основе ЦАФ, ЦАГФ, ПВБ, содержащих КЭ №3, КЭ №4, КЭ №6 до и после выдерживания в растворах перхлората кальция с концентрацией 1 мМ.

КЭ+ полимер	, нм, (до пропитки)	, нм, (после пропитки)	сдвиг , нм
КЭ №3+ПВБ	592 ±1	596±1	+4
КЭ №3+ЦАГФ	562±1	586±1	+24
КЭ №4+ПВБ	652±1	654±2	+2
КЭ№6+ЦАФ	610±1	632±1	+22

Видно, что природа полимера оказывает существенное влияние на спектральные характеристики образцов. Для ХМ на основе ПВБ в присутствии КЭ № 3 и КЭ № 4 после взаимодействия с раствором перхлората кальция сдвиги не превышают 4 нм. После воздействия на полимерную матрицу ЦАФ с КЭ №6 водных растворов перхлората кальция в спектрах наблюдаются значительные сдвиги длины волны максимума флуоресценции (на 22 нм). Наибольшие изменения после контакта с раствором перхлората кальция наблюдаются для ХМ на основе ЦАГФ и КЭ №3 (_max 24 нм). Наличие таких сдвигов максимума длины волны флуоресценции указывает на перспективность данной композиции для создания оптических сенсоров на катионы кальция.

4. Разработка метода контролируемой диффузии для изучения процессов комплексообразования КЭ с катионом кальция

Метод контролируемой диффузии (МКД) заключается в следующем. В пробирку последовательно наслаивают друг на друга три раствора: р1 - водный высококонцентрированный раствор перхлората кальция (раствор должен иметь высокую плотность); р2 - органический, несмешивающийся с водой раствор молекулярного сенсора с известной концентрацией и более низкой плотностью, чем р1; р3 - дистиллированная вода. При этом известны и строго фиксированы объемы данных растворов, а значит и их соотношение. По изменению окраски растворов судят о диффузии катионов кальция из водной среды в органическую и комплексообразовании катионов кальция с молекулярным сенсором. На примере КЭ №3 в хлороформе были поставлены эксперименты на базе МКД. Основные результаты, полученные в ходе разработки метода МКД, следующие. При контакте р2 и р1 цвет р2 из синего переходит в желтый (время полного изменения окраски 45 сек.). После контакта раствора р2 с р3 цвет р2 из желтого постепенно (начиная с контактирующей с р3 части) переходит в синий (время полного изменения окраски 60 сек.). Цвет устойчив и не меняется после 1 часа выдерживания. Однако после 24 часового выдерживания синий цвет р2 вновь переходит в желтый. Из раствора р3 отбирается проба и проводится комплексометрическое титрование, в соответствии с которым концентрация Са²⁺ в растворе равна 0,05М (т.е. 50 мМ).

В процессе постановки данного эксперимента были выявлены два важных наблюдения: последовательное изменение цвета р2 (восстановление первоначального цвета) — эффект ретрохромии, и концентрационная асимметрия (существенная и стабильная во времени разница концентраций катиона кальция в р1 и р3 соответственно).

На основе полученных на базе МКД результатов было выдвинуто предположение о характере комплексообразования КЭ №4 с катионом Са²⁺ – наличию концентрационного порога для Са²⁺, что связано с существенным влиянием водного окружения на комплексообразование между молекулами КЭ №4 и катионами Са²⁺. В случае, когда концентрация катионов кальция уменьшается ниже пороговой (<0,05M), процесс комплексообразования прекращается. Обоснование этого предположения – наличие устойчивой концентрационной асимметрии и эффекта ретрохромии в системе растворов МКД.

5. Исследование комплексобразования КЭ №3 в матрице на основе желатина с перхлоратом и хлоридом кальция

В данном разделе представлены важнейшие результаты исследования взаимодействия КЭ №3 в матрицах на основе желатина с перхлоратом и хлоридом кальция. На базе МКД были получены результаты, ставшие основой по предложению о замене матриц на полимерной основе желатиновыми матрицами. Также в эту систему был добавлен в расчетном соотношении дополнительный компонент – бензо-18-краун-6 (БК). Его функция была сведена к направленному связыванию воды, проникающей в систему вместе с солями кальция в процессе диффузии. Посредством данной технологии был снижен концентрационный кальциевый порог, выявленный на базе МКД для КЭ №3, с 50 мМ до 5 мМ. На рисунке 6 представлен спектр флуоресценции КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров.

	Рисунок 6. Спектр флуоресценции КЭ №3 в желатиновой пленке с системой сопряженных краун-эфиров до (кривая 1) и после (кривая 2) замачивания в растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ.
	Рисунок 7. Спектр флуоресценции желатиновой пленки с готовым иммобилизованным комплексом [КЭ №3+Са].

На рис. 6 приведены данные спектров флуоресценции для КЭ №3, иммобилизованного в желатиновой системе в присутствии БК в отношении к КЭ №3 100:1 в присутствии хлорида кальция при концентрации 5 мМ. Наблюдается выраженный сдвиг максимума флуоресценции в гипсохромную область с 607 до 504 нм (Δλ_max = -103 нм), что однозначно свидетельствует об образовании комплекса между КЭ №3 и кальцием. Также был снят спектр флуоресценции с контрольной желатиновой пленки (рис. 7), в которую иммобилизовали не КЭ №3, а приготовленный заранее его комплекс с кальцием – [КЭ №3+Са].

Из графика спектров флуоресценции (рис. 6,7) видно, что для готового комплекса [КЭ №3+Са], иммобилизованного в желатиновую систему, максимум флуоресценции соответствует 503 нм. Таким образом, значения максимума флуоресценции для желатиновой пленки с системой сопряженных краун-эфиров практически совпадают со значением максимума флуоресценции для желатиновой пленки с иммобилизованным готовым комплексом [КЭ №3+Са] (504 нм и 503 нм соответственно). Полученные результаты указывают на достоверность комплексообразования КЭ №3 в желатиновой системе КЭ№3/БК 1:100 с катионом кальция в водном растворе хлорида кальция с концентрацией 5 мМ.


Выводы

1. Разработаны методики, получены и исследованы хемосенсорные материалы на основе синтетических и биологических полимеров, в том числе — с включенными биоорганическими соединениями типа азакраун-эфирных производных стириловых красителей, для детекции катионов кальция и аминокислот в биологических жидкостях. Изучены оптические свойства этих соединений в различных биополимерных матрицах, установлено влияние матрицы на сдвиги максимумов спектров поглощения и флуоресценции. Оптимизированы методы получения и свойства хемосенсорных материалов.

2. Установлено, что при комплексообразовании соединения №5 с рядом аминокислот (с концентрацией 1 мМ) в пленках целлюлозы ацетатфталата наблюдается сдвиг максимума флуоресценции в присутствии раствора аланина в длинноволновую область на 5 нм, изолейцина — на 7 нм, глицина и серина – на 8 нм, аргинина — на 9 нм, фенилаланина – на 12 нм, что перспективно для детекции аминокислот.

3. Разработан экспериментально-расчетный метод и методика исследования комплексообразования производных краун-эфиров с катионами кальция с использованием различных растворителей, названная «методом контролируемой диффузии». Посредством этого метода установлен первый концентрационный порог для определения катионов кальция с помощью исследованных производных краун-эфиров, равный 50 мМ.

4. Впервые получены наноструктурированные хемосенсорные материалы на основе желатина и иммобилизованных в него производного азакраун-эфира №4 и бензо-18-краун-6-эфира в массовом соотношении 1:100, что позволило регулировать молекулярные механизмы комплексообразования. Указанные бионанотехнологические решения позволили достичь в желатиновых матрицах сдвига флуоресценции на 103 нм в гипсохромную область для концентрации катионов кальция в водном растворе 5 мМ.

5. Получены монослои и краун-содержащие композитные материалы с основой из биополимерной матрицы, и показана перспективность последних для создания сенсорных элементов устройств оптического контроля в биологических жидкостях катионов кальция и аминокислот.
   

Практические предложения

По материалам исследования разработаны: «Технологическая инструкция по изготовлению хемосеносрных бионанотехнологических пленок на основе желатина и иммобилизованного КЭ-3 для детекции катионов кальция», утвержденная ВНИТИБП РАСХН (21.10.2010г.); «Методика получения и характеристики лабораторных образцов бионанотехнологических материалов для сенсорных устройств», утвержденная научно-методическим советом ФГОУ ВПО МГАВМиБ (протокол № 22 от 16.12.2010).

Основные результаты диссертации используются для обучения студентов 3, 4 и 5 курсов и магистров ветеринарно-биологического факультета ФГОУ ВПО МГАВМиБ в учебных курсах «Биохимия», «Физическая и коллоидная химия», «Спектральные методы исследования» и «Бионанотехнологии», и в рамках НОЦ ФГОУ ВПО МГАВМиБ (ГК 02.740.11.0270 и ГК 02.740.11.0718).


Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тимонин, А.Н. Модификация методики создания селективных хемосенсорных материалов на основе фоточувствительных производных краун-эфиров / Тимонин А.Н., Зайцев С.Ю., Царькова М.С. // Мат. Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии».- М., 2008.- С. 111-115.

2.* Зайцев, С.Ю. Хемосенсорные оптоматериалы для определения диаминов на основе хромогенного краун-эфира, иммобилизованного в полимерные пленки / Зайцев С.Ю., Варламова Е.А., Царькова М.С., Бондаренко В.В., Тимонин А.Н., Ведерников А.И., Громов С.П., Алфимов М.В. // Известия вузов. Химия и химическая технология - 2009.-Т.52.-Вып.3.- С.65-69.

3. Тимонин, А.Н. Имитационное моделирование биопроцессов для создания сенсорных нанокомпозитных материалов / Тимонин А.Н., Мухамедкулова М.П., Царькова М.С., Бондаренко В.В., Зайцев С.Ю. // Актуальные проблемы ветеринарной биологии.-Сборник научных трудов.-М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2009.-С.52-54.

4. Варламова, Е.А. Получение полимерных матриц для оптических хемосенсоров / Варламова Е.А., Бондаренко В.В., Тимонин А.Н. // Юбилейный сборник трудов кафедры неорганической и аналитической химии, посвященный 90-летию кафедры и Академии «Малые дозы в биологии».-М:. ФГОУ ВПО МГАВМиБ - 2009.-С.41-46.

5.* Тимонин, А.Н. Разработка инновационных хемосенсорных нанокомпонентных материалов на основе фоточувствительных производных краун-эфиров посредством методов имитационного моделирования // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. -2010. Т.201. - С. 108-113.

6. Зайцев, С.Ю. Хемосенсорные нанокомпозитные материалы на основе фоточувствительных производных краун-эфиров: моделирование и применение /Зайцев С.Ю., Царькова М.С., Тимонин А.Н. // Нанотехнологии и охрана здоровья. - 2010. Т. 2. №3. С. 48-51.

7. Варламова, Е.А. Определение катионов щелочно-земельных металлов с помощью краун-эфиров, иммобилизованных в полимерные пленки / Варламова Е.А., Зайцев С.Ю., Царькова М.С., Бондаренко В.В., Тимонин А.Н., Громов С.П., Алфимов М.В. // Мат. Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии».- Сборник тезисов.- М., 2008.- С. 20.

8. Бондаренко, В.В. Супрамолекулярные комплексы «полимер-краун-эфир» для определения диаминов / Бондаренко В.В., Зайцев С.Ю., Царькова М.С., Варламова Е.А., Тимонин А.Н., Громов С.П., Ведерников А.И. // Мат. Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии».- Сборник тезисов.- М., 2008.- С.21.

9. Тимонин, А.Н. Модификация способа получения полимерных хемосенсорных материалов / Тимонин А.Н., Царькова М.С., Зайцев С.Ю., Варламова Е.А., Бондаренко В.В. // Мат. Международной научно-практической конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии».- сборник тезисов.- М., 2008.- С.22.

10. Зайцев, С.Ю. Модифицированные нанокомпозитные материалы для определения катионов бария / Зайцев С.Ю., Царькова М.С., Варламова Е.А., Тимонин А.Н., Ведерников А.И., Громов С.П., Лобова Н.А. // Мат. III Международной конференции по коллоидной химии и физико-химической механике.- М., 2008.- С. 74.

11. Тимонин, А.Н. Определение катионов кальция и стронция с использованием полимерных матриц и модельных систем / Тимонин А.Н., Зайцев С.Ю. // Мат. V Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры 2010», 21 – 25 июня 2010 г.-С. 49.

12. Тимонин, А.Н. Хемосенсорные композитные материалы для определения катионов кальция / Тимонин А.Н., Зайцев С.Ю. // Мат. V Международной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве».-Боровск.-2010.-С. 226-227.

13. Зайцев, С.Ю. Определение катионов кальция посредством желатиновых пленок с иммобилизированными краун-эфирами / Зайцев С.Ю., Царькова М.С., Тимонин А.Н., Зайцев И.С., Дмитриева С.Н., Громов С.П. // 2-я международная молодежная школа-конференция по физической химии краун-соединений, порфиринов и фталоцианинов. Сборник тезисов докладов. Туапсе, 2010. - С. 43-44.

14. Патент РФ № 2389745, опубл. 20.05.2010 г. Громов, С.П. Хемосенсорные оптоматериалы для определения катионов металлов большого ионного радиуса и ионов диаммония на основе краунсодержащих бисстириловых красителей, иммобилизованных в полимерные пленки, и способы их получения / Громов С.П., Зайцев С.Ю., Ведерников А.И., Ушаков Е.Н., Лобова Н.А., Кондратюк Д.В., Царькова М.С., Варламова Е.А., Бондаренко В.В., Тимонин А.Н., Алфимов М.В. (приоритет от 30.07.2008 г.)

* - статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ