Характеристика микробиоценоза кишечника животных при инвазии balantidium coli 03. 02. 03 микробиология

Вид материала

Автореферат

Содержание Ильина Наталья Анатольевна Щербаков Анатолий Анисимович Общая характеристика работы В соответствии с целью были поставлены следующие задачи Научная новизна работы. Ascaris iumbrieoides Balantidium coli Основные положения, выносимые на защиту Работа выполнена Апробация работы. Структура и объем диссертации Собственные исследования Balantidium coli Результаты исследований и их обсуждение Balantidium coli Культуральные свойства инфузорий Balantidium coli Вирулентность изолятов Balantidium coli Характеристика качественного и количественного состава микробиоценоза кишечника свиней Lactobacillus spp Escherichia spp ... Полное содержание

Подобный материал:

• Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 284.11kb.
• Чувствительность микробиоты кишечника к бактериофагам и пробиотикам у детей с заболеваниями, 77.27kb.
• Функциональная и рецепторная характеристика белков суперсемейства иммуноглобулинов, 1127.13kb.
• Сновано на изучении особенностей протекания биохимических процессов в органах и тканях, 141.37kb.
• Контрольная работа по дисциплине Микробиология По теме Общая и специальная микробиология, 208.97kb.
• Хронические в оспалительные заболевания кишечника у детей (лекция), 306.18kb.
• Лекция тема: протозойные инвазии кишечника, 115.66kb.
• «Микробиология мяса и мясопродуктов» Специальность 110401 «Зоотехния» Пояснительная, 71.71kb.
• Календарно-тематический план лекций по биологии для студентов факультета медицинской, 44.56kb.
• Пробиотики: характеристика препаратов и выбор в педиатрической практике, 273.26kb.

На правах рукописи


Карпеева Евгения Александровна


ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА ЖИВОТНЫХ ПРИ ИНВАЗИИ BALANTIDIUM COLI


03.02.03 – микробиология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Саратов – 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова»

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Ильина Наталья Анатольевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Щербаков Анатолий Анисимович доктор биологических наук, профессор Романова Елена Михайловна

Ведущая организация:

ФГОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет»

Защита состоится «17» февраля 2011 года в 14⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.


Автореферат разослан «__» __________ 2011 года и размещен на сайте университета www.sgau.ru.


Отзывы на реферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная площадь, 1, ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертационного совета.


Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы. В настоящее время хорошо известна важная роль нормальной микробиоты пищеварительного тракта в целом, и кишечника в частности, в создании резистентности макроорганизма к колонизации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, действию токсинов, ферментов защиты и агрессии, формировании иммунного гомеостаза и витаминного баланса, участии в метаболических и ферментативных процессах, антимутагенной активности (Красноголовец, 1989; Куваева, Ладодо, 1991; Воробьев, 1997; Акбаева, 1998; Шендеров, 1998; Ардатская, Дубинин, Минушкин, 2001; Ильина, 2008). В свою очередь, микробиота кишечника является индикатором состояния макроорганизма и целый ряд факторов приводит к изменению ее качественного и количественного состава. При снижении резистентности макроорганизма представители микробиоценоза кишечника могут проявлять свою патогенность (Шендеров, 2000; Потатуркина-Нестерова с соавт., 2004; Ильина, 2006; Красноперова, 2009).

Среди условно-патогенных микроорганизмов, способствующих возникновению и поддержанию дисбиотического процесса в кишечнике животных, помимо бактерий и грибов, значительное место занимают кишечные простейшие, которые в небольшом количестве встречаются в кишечнике практически всех здоровых животных (Walker, 2005). Естественным резервуаром возбудителей многих паразитарных инвазий, в том числе балантидиаза, являются домашние животные – ­свиньи.

В последние годы в России особенно напряженной стала эпидемиологическая обстановка по паразитарным болезням животных. В стране ежегодно официально регистрируется более 1,3 миллионов больных различными паразитозами сельскохозяйственных животных, среди которых отмечается рост заболеваемости кишечными протозоозами (Романенко, 2001). Особый интерес вызывает балантидиаз, который очень широко распространен у свиней. По данным ряда авторов зараженность свиней балантидиями составляет от 21 % до 100 % , так в Великобритании – 36 %, в Египте – 70 %, в Болгарии от 14 до 81 %, в Греции – 74,6 %, в Новой Гвинее – 100 % (Жордания, 1971; Хамцов, 1972; Рочкене, 1977). Носителями балантидий могут быть также крысы, мыши, дикие кабаны, обезьяны (Kobayashi et al., 1995; Hussain et al., 1997; Кипайкин, Рубашкина, 2002).

В настоящее время достаточно хорошо изучены вопросы биологии балантидий, пути и способы заражения ими животных, дана общая оценка инвазированности разных хозяев (Рочкене, 1977; Лаптева, 1970; Лысенко, 1993). Однако, практически отсутствуют данные о состоянии микробиоценоза кишечника животных при инвазии Balantidium coli, об особенностях межмикробных взаимодействий при формировании паразитоценоза. Малочисленность и фрагментарность работ, дающих представление о стабильности адаптационных и функциональных возможностях кишечника, не отражают характер изменения его микробного статуса при балантидиазе, а также не направлены на изучение нарушений паразитоценоза в целом. В этой связи сравнительное изучение состояния микробиоценоза кишечника свиней при инвазии балантидиями и оценка характера взаимоотношений микроорганизмов, определяющего тяжесть заболевания, представляют научный и практический интерес.


Цель работы – изучить качественный и количественный состав микробиоценоза кишечника свиней и оценить характер межмикробных взаимодействий при инвазии Balantidium coli.


В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать структуру паразитоценоза кишечника свиней города Ульяновска и Ульяновской области, оценить частоту встречаемости
   B. coli.
   
2. Изучить биологические свойства выделенных балантидий в условиях
   in vivo и in vitro.
   
3. Провести сравнительные исследования состава микробиоценоза кишечника свиней в норме и при инвазии B. coli.
   
4. Выявить зависимость состояния облигатной и транзиторной микрофлоры кишечника свиней от степени вирулентности балантидий.
   
5. Оценить характер межмикробных взаимодействий в кишечнике свиней в условиях инвазии B. coli.
   

Научная новизна работы. Установлен широкий спектр представителей паразитоценоза кишечника свиней города Ульяновска и Ульяновской области, включающий 11 видов кишечных паразитов, из которых 8 видов представлены простейшими и 3 вида – гельминтами. Видовой спектр простейших включает инфузории (Balantidium coli), саркодовые (Blastocystis sp., E. hartmanni, E. coli, E. nana, Iodamoeba butschlii), жгутиковые (Lamblia intestinalis) и кокцидии (Cryptosporidium parvum). Показано, что инвазивность свиней простейшими составляет 81,7 %, из них балантидиями – 18,78 %.

Гельминты, представленные 1 видом трематод (Opisthorchis felineus),
1 видом цестод (Hymtnolepis nana) и 1 видом нематод ( Ascaris iumbrieoides), выявлены у 12,18 % обследованных свиней.

Впервые проведен комплексный сравнительный анализ состояния микробиоценоза кишечника свиней при балантидиазной инвазии. Охарактеризован видовой состав и выявлены качественные и количественные изменения в составе микрофлоры кишечника животных, инвазированных Balantidium coli.

Впервые установлено, что балантидии обладают различной степенью вирулентности, показана зависимость дисбиотических изменений в составе микробиоценоза кишечника от степени вирулентности балантидий.

Впервые определены особенности межмикробных взаимодействий в кишечнике свиней при инвазии Balantidium coli, которые сопровождаются сменой абсолютных доминант Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Bacteroides spp. и появлением Escherihia coli с гемолитической активностью и грибов рода Candida.


Практическая значимость работы. Подобранная оптимальная питательная среда для культурального метода диагностики балантидиаза позволяет дополнить имеющиеся сведения о влиянии B. coli на межмикробные взаимодействия в кишечнике свиней, что обоснованно указывает на необходимость широкого внедрения в ветеринарную практику методов выделения и идентификации B. coli.

По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации по межмикробным взаимодействиям в кишечнике свиней при инвазии Balantidium coli» для студентов старших курсов, аспирантов, специалистов микробиологических лабораторий, рекомендованные редакционно-издательским советом и одобренные Ученым советом естественно-географического факультета (протокол № 10 от 23 апреля 2010 г.), монография «Экологические параметры микробиоты кишечника при протозойных инвазиях» (в соавторстве с Н.А. Ильиной, Н.М. Касаткиной, Н.И. Потатуркиной – Нестеровой, Ю.Ю. Красноперовой, 2009). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, паразитологии и экологии микроорганизмов, проведении лабораторно-практических занятий и написании дипломных работ в Ульяновском государственном педагогическом университете имени И.Н. Ульянова.


Основные положения, выносимые на защиту:

1. Паразитофауна кишечника свиней г. Ульяновска и Ульяновской области представлена 11 видами кишечных паразитов, из которых 8 видов – простейшие и 3 вида – гельминты. Инвазированность свиней простейшими составляет 81,7 % , балантидиями – 18,78 %.
   
2. Выделенные из организма животных балантидии имеют типичную морфологию, при культивировании на среде Суреша количество инфузорий с максимальными размерами увеличивается, а с минимальными – уменьшается. Уровень вирулентности балантидий значительно варьирует и является показателем их неодинаковой этиологической значимости в развитии инвазии.
   
3. Балантидиазная инвазия сопровождается значительными изменениями количественных показателей основных эндосимбионтов толстого кишечника животных и увеличением частоты встречаемости представителей транзиторной микрофлоры.
   
4. Выраженные дисбиотические изменения микрофлоры кишечника свиней регистрируются при инвазии высоковирулентными B. coli.
   
5. Межмикробные взаимодействия в кишечнике свиней в условиях инвазии балантидиями характеризуются изменениями, проявляющимися в снижении доминирования и значимости основных симбионтов и увеличении частоты встречаемости транзиторной микрофлоры, свидетельствующие о смене абсолютных доминант микробоценоза.
   

Работа выполнена на кафедре зоологии и на базе научно-исследовательской лаборатории экологии микроорганизмов ГОУ «Ульяновский государственный педагогический университет им. И.Н. Ульянова».


Апробация работы. Результаты работы были представлены на: Международной научной конференции «Современные наукоемкие технологии» (Италия, о. Тенерифе, 2008), III Международной научно-практической конференции «Образование и здоровье. Экономические, медицинские и социальные проблемы» (Пенза, 2008), Международном Форуме по проблемам науки, техники и образования. III тысячелетие – новый мир (Москва, 2008), Всероссийской заочной электронной научной конференции «Современные проблемы науки и образования» (Москва, 2008), Международной научной конференции «General practitioner» (Италия, 2009), Международном Форуме по проблемам науки, техники и образования. III тысячелетие – новый мир (Москва, 2009), Международном молодежном научном форуме «Университетское образование: традиции и инновации» (Ульяновск, 2010), III Всероссийской научно-практической конференции «Экология и здоровье: проблемы и перспективы социально-экологической реабилитации территорий, профилактики заболеваемости и устойчивого развития» (Вологда, 2010).


Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и собственных исследований, включающей объект, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка используемых литературных источников. Работа изложена на 109 страницах, содержит 16 таблиц и 14 рисунков. Список использованных литературных источников включает 166 наименований, в том числе 33 зарубежных.


СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект, материалы и методы исследований

При выполнении работы было обследовано 197 свиней г. Ульяновска и Ульяновской области. Контрольную группу составили 56 свиней, у которых отсутствовали паразитарные инвазии.

Лабораторную диагностику кишечных простейших проводили в соответствии с регламентом (рис. 1). Для выявления кишечных простейших и гельминтов использовали систему «Консервант Турдыева – формалин-эфирное осаждение – центрифугирование (КТ-ФЭО-МЦН)» с последующим микроскопированием. (Сергиев, Гордеева, Рагимов, 1994). Диагностику кишечных протозоозов проводили путем микроскопии нативных и окрашенных мазков и после формалин-эфирного осаждения по Ритчи в модификации Аллена-Ридли. Размеры простейших определяли при помощи окуляр микрометра (Сергиев, 1992).

Для выделения Balantidium coli использовали среды Павловой, Зиерта, Суреша и Райса (Методические указания…, 1999).

Определение вирулентности микроорганизмов проводили путем внутрибрюшинного заражения мышей. Белым мышам массой 14-16 г. вводили по 0,5 мл соответствующего разведения 10¹ - 10⁹ взвеси культуры простейших, выращенной на среде K. Suresh. Учет результатов производили через сутки и определяли величину LD₅₀, в соответствии с которой штаммы Balantidium coli относили к высоковирулентным, умеренно вирулентным и слабовирулентным (Костюкова, Андреева, Игнатов, 1996).

Фекалии

Свежевыделенные

Консервированные

нативный мазок с физиологическим раствором

мазок с раствором Люголя

мазок с раствором Люголя

концентрация формалин- эфирным обогащением

окраска железным гематоксилином по Гейденгайну

окраска по Романовскому- Гимзе

мазок с раствором Люголя

окраска по Романовскому - Гимзе

Рис. 1. Регламент лабораторной диагностики кишечных простейших

Изучение микрофлоры кишечника у инвазированных и здоровых свиней проводили согласно методическим рекомендациям «Бактериологическая диагностика дисбактериоза», 1989.

Выделение и идентификацию микроорганизмов из состава микробиоценоза кишечника проводили по общепринятым методикам. Содержимое толстого кишечника и разведения фекалий высевали на дифференциально-диагностические среды. Бактерии группы кишечной палочки выделяли на средах Эндо, Плоскирева, Левина и висмут-сульфитном агаре; для выделения стафилококков использовали солевой мясо-пептонный агар (МПА) и кровяной МПА. Выделение анаэробных бифидобактерий проводили посевом больших разведений фекалий в среду Блаурокка. Для выделения клостридий использовали среды Китта-Тароцци, Вильсона-Блер, глюкозо-кровяной агар Цейсслера. Лактобациллы определяли по росту на среде МРС. Proteus vulgaris выделяли на среде Плоскирева и средах с добавлением желчи (МПА с 5 % содержанием желчи). Микроскопические грибы родов Candida, Aspergilus, Peniilium выделяли посевом исследуемого материала на среды Чапека и Сабуро.

Оценивали биохимическую активность выделенных бактерий по способности к разжижению желатина, коагуляции молока, утилизации маннита, лактозы, сахарозы, аммиака, сероводорода на стандартных средах Гисса и с использованием индикаторных полосок.

Рассчитывали качественное и количественное содержание бактерий и грибов в исследуемых пробах, результаты переводили в десятичные логарифмы и определяли относительное соотношение различных групп микроорганизмов в микробиоценозе кишечника животных.

Характер межмикробных взаимодействий оценивали по значению индекса контагиозности (Уиттекер, 1980), вычисляемого по формуле:

_, где UK – индекс контагиозности; S – выборочная дисперсия; Х – средняя арифметическая плотность, и позволяющего определить характер пространственного распределения экологических групп в биотопе.

Для определения значимости экологических групп микробоценоза пользовались индексом, предложенным М.П. Наткевичайте-Иванаускене (1985), и вычисляли по формуле:

_,где V – индекс значимости; g – сумма встречаемости видов данной группы; n – число описанных пробных площадок; m – среднее число видов на пробной площадке; z – число видов в данной группе.

Видовое разнообразие сообщества микроорганизмов, населяющих толстый отдел кишечника, рассчитывали по формуле Р. Уиттекера (1980):

_, где d – видовое разнообразие; S – количество видов;
N – общая плотность бактерий.

Статистическая обработка результатов исследований выполнена на персональном ЭВМ типа IBM «Pentium IV», графическая обработка материалов выполнена с помощью пакета прикладных программ Microsoft Exel-2003. При математической обработке данных использовали пакет CSS3.1 «Компьютерная биометрия» (Лакин, 1990).


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ


Исследование паразитоценоза кишечника свиней

Проведено обследование 197 свиней в г. Ульяновске и Ульяновской области с применением диагностической системы КТ-ФЭО-МЦН. Выявлена общая высокая зараженность кишечными паразитами у обследованных животных. При этом инвазированность простейшими и гельминтами была не одинакова. Так, простейшие были выявлены у 81,7 % свиней, тогда как гельминты – у 12,2 % животных, 6,1 % из обследованных животных были не инвазированы. Получены новые данные, отражающие богатое видовое разнообразие паразитофауны кишечника обследованных животных (табл. 1).

Инфузории Balantidium coli также занимают значительное место в паразитоценозе свиней, они были выявлены у 18,78 % обследованных животных.


Таблица 1 – Встречаемость кишечных паразитов у обследованных свиней

Виды паразитов	Встречаемость паразитов
	абс.	%
Простейшие	161	81,73
1. Саркодовые	145	73,60
1.1. Blastocystis sp.	91	46,19
1.2. Entamoeba hartmanni	15	7,61
1.3. Entamoeba coli	74	37,56
1.4. Endolimax nana	46	23,35
1.5. Iodamoeba butschlii	23	11,68
2. Жгутиковые	49	24,87
2.1. Lamblia intestinalis	73	37,06
3. Инфузории	37	18,78
3.1. Balantidium coli	37	18,78
4. Кокцидии	6	3,05
4.1. Cryptosporidium parvum	6	3,05
Гельминты	24	12,18
1. Трематоды	6	3,05
1.1. Opisthorchis felineus	6	3,05
2. Цестоды	3	1,52
2.1. Hymtnolepis nana	3	1,52
3. Нематоды	17	8,63
3.1. Ascaris iumbrieoides	12	6,09

Паразитоценоз кишечника свиней характеризовался наличием в ряде случаев ассоциаций разных видов паразитов. Были выявлены двухчленные ассоциации: Blastocystis sp. (46,19 %) – Lamblia intestinalis (37,06 %), Balantidium coli (18,78 %) – Blastocystis sp. (46,19 %), Balantidium coli (18,78 %) – Candida spp. (7,39 %); трехчленные ассоциации: Lamblia intestinalis (37,06 %) – Balantidium coli – Candida spp. (7,39 %), протозойно-гельминто-грибковые (7,81 %).