Совершенствование способов повышения воспроизводительных качеств свиней и овец 06. 02. 07 Разведение, селекция и генетика сельскохозяйственных животных

Вид материала

Лекция

Содержание Кабанов Виктор Данилович Скрипниченко Георгий Григорьевич Общая характеристика работы Цель исследований Научная новизна исследований. Теоретическая и практическая значимость. Реализация результатов исследований. Апробация работы. Основные положения выносимые на защиту Публикации результатов исследований. Объем и структура диссертации. Материалы и методы исследований Результаты исследований 3.2 Изучение защитного влияния различных веществ в составе синтетических сред для разбавления и хранения спермы хряков в охлажде Изучение защитного влияния различных веществ в составе синтетических сред для разбавления и хранения спермы баранов Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на биологическую полноценность и фертильность спермы баранов и хряков 3.5. Разработка технологии оттаивания спермы баранов 3.6. Эффективность применения физических и биологических способов стимуляции эструса у свиней Практические предложения Список основных работ, опубликованных по теме диссертации ... Полное содержание

Подобный материал:

• Программа минимум кандидатского экзамена по специальности 06. 02. 01 Разведение, селекция,, 74.53kb.
• Влияние генотипических и паратипических факторов на формирование продуктивных и воспроизводительных, 335.91kb.
• Способы повышения воспроизводительной функции свиней 06. 02. 01 разведение, селекция,, 568.29kb.
• Прогнозирование воспроизводительных способностей баранов в раннем возрасте 06. 02., 373.64kb.
• Влияние генотипа на мясную продуктивность и естественную резистентность свиней 06., 327.83kb.
• Селекционно-генетические аспекты повышения плодовитости овец породы казахский архаромеринос, 997.96kb.
• Разработка и совершенствование биотехнологических методов и технических приемов воспроизводства, 871.79kb.
• Программа-минимум кандидатского экзамена по специальности, 80.52kb.
• Эффективность хозяйственного использования животных разных генотипов в холмогорской, 304.53kb.
• Естественная резистентность, воспроизводительные и мясные качества свиней в связи, 413.2kb.

На правах рукописи

ЕПИШИНА ТАТЬЯНА МИХАЙЛОВНА

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБОВ ПОВЫШЕНИЯ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫХ КАЧЕСТВ

СВИНЕЙ И ОВЕЦ


06.02.07 - Разведение, селекция и генетика

сельскохозяйственных животных


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Москва - 2011


Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина»


Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук,

член-корреспондент РАСХН, профессор

Кабанов Виктор Данилович


Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Решетникова Нина Михайловна

доктор биологических наук, профессор

Скрипниченко Георгий Григорьевич

доктор биологических наук, профессор

Абилов Ахмедага Имаш оглы

Ведущая организация (предприятие): ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева».


Защита диссертации состоится « 15 » июня 2011 г в 10⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.03 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Автореферат разослан « 14 » мая 2011г.


Ученый секретарь

диссертационного совета Н.Н. Шумилина

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
   

Актуальность темы. Среди фундаментальных проблем зоотехнической науки одной из наиболее актуальных является повышение эффективности воспроизводства стада путем максимального использования высокоценных племенных производителей, что имеет большое значение для обеспечения дальнейшего прогресса в животноводстве. Важное направление улучшения репродукции – применение метода искусственного осеменения. Одним из определяющих факторов результативности искусственного осеменения является совершенствование методов хранения спермы животных в охлажденном или глубокозамороженном состоянии.

При технологической обработке спермы, разбавлении ее синтетическими средами и хранении в охлажденном или глубокозамороженном состоянии происходят значительные структурные и биологические повреждения сперматозоидов, которые приводят к нарушению проницаемости плазматических мембран и выхода из сперматозоидов ряда ферментов и других компонентов клеточного метаболизма, что значительно снижает фертильность спермы (Курбатов А.Д., Платов Е.М., и др., 1988; Ерохин А.С., 1995;1996; Шапиев И.Ш., 1998; Нарижный А.Г. и др. 1995; 2005). В качестве нашей рабочей гипотезы служило предположение, что степень выхода ферментов из сперматозоидов зависит от вида животных, локализации фермента и прочности связывания его со структурами сперматозоида, состава используемой среды, режимов хранения и др. Поэтому выяснение состояния аминокислотно-белкового, углеводного, липидного и липопротеидного обмена, системы ферментативной антиоксидантной защиты, развитие процессов пероксидного окисления липидов в процессе хранения разбавленной спермы, позволит наметить новые пути повышения биологической полноценности сперматозоидов при краткосрочном и долговременном хранении спермопродукции. Решению этой важной проблемы могут послужить сравнительные исследования межвидовых особенностей сперматозоидов хряков и баранов, по-разному реагирующих на термодинамические процессы, а, следовательно, на формирование защитных реакций и адаптационных свойств при хранении вне организма.

В этой связи представляется перспективным разработать по результатам биохимических исследований более эффективные синтетические среды для краткосрочного и долговременного хранения спермы хряков и баранов с применением антиоксидантов, биологически активных веществ и других криопротекторов.

Приобретает большое значение применение физических способов обработки спермы, в частности, с использованием низкоинтенсивного лазерного излучения, и улучшение технологии оттаивания спермы баранов.

Актуальной и важной задачей является совершенствование методов повышения воспроизводительной способности свиноматок. В условиях промышленных технологий нередко отмечается замедление полового созревания свинок и задержка наступления эструса у свиноматок после очередного отъема поросят. Результативность осеменения и многоплодие маток в данных условиях тоже понижены.

Кроме того, в летнее время у большинства свиноматок наступает депрессия половой функции, что проявляется длительным анэструсом и снижением результативности осеменения животных. Это приводит к нарушению ритмичности циклов производства продукции в крупных свиноводческих комплексах. В этой связи, необходимы дальнейшие исследования по совершенствованию способов стимуляции эструса у основных свиноматок и ремонтных свинок.

Цель исследований: совершенствование методов краткосрочного и длительного хранения спермы хряков и баранов, повышение эффективности стимуляции эструса у свиноматок и разработка на этой основе результативных способов улучшения репродуктивных качеств свиней и овец.

Достижение поставленной цели осуществлялось путем решения следующих задач:

- изучить видовые особенности изменения активности ферментов аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы (АСТ, АЛТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), содержания общего белка, альбумина, мочевины, триглицеридов, холестерина и системы ферментативной антиоксидантной защиты – супероксид-дисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионредуктазы (ГР) и каталазы в семенной плазме нативной спермы хряков и баранов, а также влияние хранения разбавленной спермы на выход указанных высокомолекулярных биохимических соединений из сперматозоидов в семенную плазму;

- определить концентрацию продуктов пероксидного окисления липидов в нативной, а затем в разбавленной и сохраняемой при температуре 16⁰С сперме сравниваемых видов животных, и в оттаянной после глубокого замораживания до -196⁰С сперме баранов;

- осуществить поиск и изучить влияние на сперму хряков и баранов новых синтетических и натуральных антиоксидантов, биологически активных веществ и других криопротекторов;

- разработать синтетические среды для долговременного и краткосрочного хранения спермы хряков, сохраняемой при температуре 16-17⁰С;

- разработать более эффективные криозащитные среды для сперматозоидов баранов при глубоком замораживании спермы;

- провести сравнительное исследование криопротективного влияния низкоинтенсивного излучения гелий-неонового и арсенид-галлиевого лазеров на биологическую полноценность сперматозоидов хряков и баранов;

- разработать технологию оттаивания спермы баранов в модифицированных электрооттаивателе ОГСБ-2М и гидрооттаивателе ОГСБВ;

- выяснить эффективность стимуляции эструса у основных свиноматок и ремонтных свинок с помощью однократной электропунктуры биологически активных точек с применением аппарата «ДЭНАС», или однократной внутримышечной инъекции антиоксиданта амбиола.

Научная новизна исследований. В проведенных впервые сравнительных исследованиях спермы хряков и баранов выявлены видовые особенности изменения метаболизма и защитных свойств гамет, сохраняемых in vitro при различных температурных режимах хранения во времени, выражающиеся в выходе окислительных и гидролитических ферментов и других компонентов клеточного метаболизма из сперматозоидов в семенную плазму, инициацией ПОЛ, и ингибированием ферментативной антиоксидантной активности (АОА).

Выявлено, что активность ферментов АСТ, АЛТ, ЩФ, СОД, ГПО, ГР и содержание общего белка, альбумина, мочевины, триглицеридов, холестерина в семенной плазме нативной спермы баранов выше, чем хряков, активность ЛДГ выше у хряков, чем у баранов. Хранение разбавленной спермы индуцирует выход из сперматозоидов в семенную плазму изученных ферментов и других компонентов клеточного метаболизма и усиливает пероксидное окисление липидов преимущественно в сперме баранов. Замораживание-оттаивание спермы баранов приводит к более глубоким изменениям метаболизма сперматозоидов.

На основе полученных результатов биохимических исследований разработаны усовершенствованные синтетические среды для хранения спермы хряков, охлажденной до температуры 16-17ºС, и спермы баранов, сохраняемой при температуре -196ºС с применением антиоксидантов, биологически активных веществ и других криопротекторов.

В практику свиноводства внедрены новые синтетические среды для долговременного (до 5-ти суток) и краткосрочного хранения спермы хряков при температуре 16-17⁰С (патент № 2370033).

В практику овцеводства внедрены новые усовершенствованные синтетические среды для глубокого замораживания спермы баранов (патенты: № 2048796, № 2083183, № 2323702, № 2198622) и на основании изучения оптимального режима оттаивания спермы баранов внедрены модифицированные электрооттаиватель ОГСВ-2М и гидрооттаиватель ОГСБВ.

Разработан новый способ повышения оплодотворяющей способности спермы баранов после глубокого ее замораживания с применением препарата ФЛПГ (патент № 2297197).

Выявлены видовые различия воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения на сперматозоиды хряков и баранов. При этом установлено, что обработка спермы сравниваемых видов животных оказывает защитное действие на биологическую полноценность спермы баранов и не оказывает влияния на сперму хряков, а действие арсенид-галлиевого лазера более эффективно по сравнению с гелий-неоновым лазером.

Разработан и внедрен в практику свиноводства способ стимуляции эструса у свиней, однократной электропунктурой биологически активных точек, с использованием нового электростимулятора «ДЭНАС» или однократной внутримышечной инъекции синтетического антиоксиданта амбиола.

Теоретическая и практическая значимость.

Полученные результаты на основе биохимических исследований по изучению антиоксидантного статуса гамет с избыточным образованием свободных радикалов и конечных метаболитов типа ТБК (тиобарбитуровая кислота) – реагирующих продуктов положены в основу разработки новых, более эффективных способов усовершенствования синтетических сред, повышающих криорезистентность, биологическую полноценность и фертильность спермы, которые могут быть применены при совершенствовании методов разбавления и хранения спермы других видов животных. Экспериментальное использование полученных научных разработок будет способствовать дальнейшему развитию теории биологии воспроизведения сельскохозяйственных животных на молекулярном уровне с учетом новых достижений в биохимии и генетике.

Усовершенствованные синтетические среды для долговре-менного и краткосрочного хранения спермы хряков при температуре 16-17⁰С, и глубокого замораживания спермы баранов, сохраняемой при температуре -196⁰С, способствуют повышению биологической полноценности и оплодотворяющей способности спермы.

Применение низкоинтенсивного лазерного излучения позволяет повысить результативность искусственного осеменения овец охлажденной спермой.

Улучшенная технология оттаивания замороженной спермы баранов в электро- и гидрооттаивателе оказывает положительное влияние на качество и фертильность спермы.

Однократная стимуляция половых функций свиноматок и ремонтных свинок электропунктурным методом с применением аппарата «ДЭНАС» или внутримышечной инъекцией антиоксиданта амбиола ускоряет наступление эструса и повышает результативность искусственного осеменения.

Широкое использование в зоотехнической практике выполненных в диссертации научных разработок и предложений производству будет способствовать решению важной научно-хозяйственной проблемы повышения биологической полноценности и оплодотворяющей способности спермы хряков и баранов, улучшению воспроизводительных качеств свиней и овец, сохранения и рационального использования генофонда племенных животных, повышению эффективности свиноводства и овцеводства.

Реализация результатов исследований. Материалы, полученные в данной работе, использованы при разработке научно-методических документов:

1. Наставление по применению ГЖУК-трис-буферной среды для разбавления, замораживания, хранения и использования спермы баранов-производителей. – Разработано во ВНИИплем (1992) в соответствии с решением Госагропрома, одобрено и рекомендовано в практику Ветеринарным фармакологическим советом ГУВ Госагропром.

2. Монография «Повышение репродуктивных качеств свиней и овец».- Москва 2009 г.

3. Национальная технология искусственного осеменения овец – Одобрена и рекомендована в практику Ученым Советом ВНИИплем (2010)

4. Синтетические среды для длительного и краткосрочного хранения спермы хряков в охлажденном состоянии внедрены в хозяйствах Владимирской области и республики Мордовия.

5. Усовершенствованные среды для глубокого замораживания спермы баранов применяются в хозяйствах Саратовской области, республики Калмыкия, Ставропольского края и Горного Алтая.

6. Оттаиватель ОГСБ-2М для спермы баранов, замороженной в виде гранул, широко применяется в хозяйствах Саратовской области и республики Калмыкия.

7. Стимуляция эструса у свиней электропунктурным методом аппаратом «ДЭНАС» применяется в хозяйствах Владимирской области и республики Мордовия.

Результаты полученных разработок подтверждены актами производственных испытаний и внедрений.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: - координационных совещаниях по воспроизводству овец на ВДНХ СССР и ВВЦ (1990-1995 г.г.); - совещании зооветспециалистов Хакасского племобъединения (1994); - конференции «Научно-производственные аспекты развития отрасли свиноводства», Бугульма (2000); - 5-ой Европейской конференции по биологии размножения домашних животных, Вена (2001); - Международной научно-практической конференции « К 100-летию со дня рождения академика В.К.Милованова и профессора И.И.Соколовской», Дубровицы (2004); - Международной научно-практической конференции «Прошлое, настоящее и будущее зоотехнической науки», Дубровицы (2004); Международной научно-практической конференции по биологии размножения животных, ВИЖ, Дубровицы (2007); - Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных», ВИЖ, Дубровицы (2008); - Международной научно-практической конференции «Инновационные технологии в свиноводстве», Геленджик (2008); - межкафедральном заседании ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И.Скрябина» (2010).

Основные положения выносимые на защиту:

- результаты биохимических исследований видовых особенностей сперматозоидов хряков и баранов по активности ключевых ферментов и других компонентов клеточного метаболизма, изучение антиоксидантного статуса гамет при хранении спермопродукции;

- разработка и практическое применение усовершенствованных сред для краткосрочного и длительного хранения спермы хряков в охлажденном состоянии и при глубоком замораживании спермы баранов;

- физические способы повышения биологической полноценности спермы хряков и баранов, сохраняемой в охлажденном до плюсовых температур состоянии, с применением низкоинтенсивного излучения арсенид-галлиевого и галий-неонового лазеров, и установление оптимальной технологии оттаивания глубокозомороженной спермы баранов в электро – и гидрооттаивателях ОГСБ-2М и ОГСБВ;

- новые способы стимуляции половой доминанты у свиноматок и ремонтных свинок с применением однократной электропунктуры аппаратом «ДЭНАС» или однократного внутримышечного введения синтетического водорастворимого антиоксиданта амбиола.

Публикации результатов исследований. По теме диссертации получено 6 патентов на изобретение; опубликованы: - монография «Повышение репродуктивных качеств свиней и овец» (2009); - статьи в журналах «Зоотехния», «Ветеринария», «Свиноводство», «Овцы, козы, шерстяное дело», «Сельскохозяйственная биология», «Доклады РАСХН», «Ветеринарная патология», «Ветеринария и кормление», в тематических сборниках Международных научно-практических конференций. Рекомендации по технологии замораживания спермы баранов включены в «Наставление по применению ГЖУК-трис-буферной среды для разбавления, замораживания, хранения и использования спермы баранов производителей» (1992), и «Национальная технология искусственного осеменения овец» (2010). Всего по теме диссертации опубликовано 60 работ, из которых 16 в центральных рецензируемых журналах ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 293 стр. машинописного текста и включает 78 таблиц и 30 иллюстраций. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложений. Список литературы включает 467 источников, в том числе 166 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
   

Научно - исследовательская работа проводилась в период 1992-2011 гг. Объектом исследований служила сперма хряков и баранов – животных эволюционно отдаленных видов, имеющих существенные различия в биологических свойствах спермопродукции, изучение которых на субклеточном уровне будет способствовать разработке эффективных способов повышения живучести сперматозоидов in vitro и их фертильности. Научно-производственные опыты по искусствен-ному осеменению свиней и овец проведены на базе хозяйств Московской, Ярославской, Белгородской, Ростовской, Владимирской областей, Мордовской и Хакасской республик осеменено 2860 свиноматок и 2563 овцематки.

В лабораторных и научно – производственных опытах строго соблюдали принцип разделенных эякулятов и аналогичности условий постановки экспериментов.

Работа проведена согласно прилагаемой схеме исследований (рис.1).

Для исследования семенной плазмы неразбавленной спермы хряков и баранов, нативную сперму с подвижностью 80 – 90 %


Повышение результативности искусственного осеменения свиней и овец




Рисунок 1- Общая схема исследований

центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут и анализировали семенную плазму. Затем сперму хряков разбавляли (глюкозо-хелато-цитратно-сульфатной) ГХЦС-средой, сперму баранов - (глюкозо-цитратно-желточной) ГЦЖ средой в два раза и сохраняли в течение 120 часов при температуре 16⁰С. Через определенные интервалы времени хранения (24, 48, 72 и 120 часов) образцы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут и анализировали семенную плазму разбавленной спермы.

Активность ферментов АСТ, АЛТ, ЛДГ, ЩФ и содержание общего белка, альбумина, мочевины, триглицеридов, холестерина определяли по общепринятым методикам против контрольного стандарта на биохимическом анализаторе «АNALYSER/INDUSTRIES» с использованием диагностических наборов реактивов производства «Biocon Diagnostik Cmb H.» (Германия). Активность антиоксидантных ферментов определяли с использованием диагностических наборов реактивов производства «Randox Laboratorirs Ltd» (Англия). Активность каталазы определяли колориметрическим методом по методике Королюк М.А. с соавт. (1988).

Определение концентрации диеновых (кетодиеновых) конъюгатов (ДК), (КД) полиненасыщенных жирных кислот и малонового диальдегида (МДА) в сперме проводили по методу Архипова А.В. (2004). Для определения оптической плотности использовали спектрофотометр Novaspek (Англия).

Исследование антиоксидантной активности препарата ИХФГАН-3 на сперматозоиды баранов в образцах заморожено-оттаянной спермы проводили с помощью метода индуцированной ионами железа хемилюминесценции (Владимиров Ю.А., и др., 1991).

Оптимальные концентрации препаратов подбирали по подвижности и абсолютному показателю живучести сперматозоидов по методике Милованова В.К. (1962). Концентрацию сперматозоидов у хряков определяли на фотометре SDM-5 (Германия), концентрацию сперматозоидов баранов определяли в камере Горяева.

Для изучения защитного влияния испытуемых веществ при хранении спермы хряков в охлажденном до температуры 4°С или 16-17°С, использовали эякуляты с подвижностью 80-90% и концентрацией сперматозоидов не ниже 0,30 млрд/мл. Искусственное осеменение свиноматок проводили двукратно в течение спонтанного эструса, внутриматочно, дозой 100 мл, содержащей 3 млрд подвижных сперматозоидов.

Для изучения защитного влияния испытуемых веществ, при хранении спермы баранов в охлажденном состоянии и при её замораживании, использовали эякуляты с подвижностью 80 - 90% и концентрацией сперматозоидов не ниже 2 млрд/мл.

Для глубокого замораживания спермы баранов разбавленную ГЖУК-трис-буферной средой сперму с добавлением различных концентраций изучаемых веществ охлаждали в холодильнике в те­чение двух часов до 2-4°С и замораживали в форме открытых гранул объ­емом 0,2 см³ на фторопластовой пластине до (–196⁰С) с использова­нием жидкого азота. После оттаивания через определенные промежутки времени определяли подвижность сперматозоидов и вычисляли абсолютный показа­тель их живучести. Искусственное осеменение овец проводили однократно или двукратно в течение спонтанно­го эструса. Сперму вводили цервикально в объеме 0,2 см³. В дозе со­держалось 80-100 млн подвижных сперматозоидов.

Действие низкоинтенсивного лазерного излучения на живучесть сперматозоидов хряков и баранов при хранении в охлажденном при температуре 4, 16 и 17⁰С изучали с использованием арсенид-галлиевого и гелий-неонового лазеров. Обработку спермы хряков и баранов проводили на лазерном приборе ALIT – 3B. Источниками излучения служили гелий-неоновый (He-Ne, длина волны 0,63 мкм) и арсенид-галлиевый (Ars-Ga, дли­на волны 0,89 мкм) лазеры. Эксперименты проводили в 5 различных режи­мах (R2-R32), отличающихся по частоте излучения лазера (0,6-10 кГц), мощности излучения (0,15-2,4 мВт) и времени экспозиции (30-300 секунд) с определением подвижности абсолютного показателя живучести сперматозоидов и репродуктивных показателей овцематок.

Для определения эффективности оттаивания криоконсервиро-ванной спермы баранов в электро- и гидрооттаивателях конструкции ВНИИплем, изучали модифицированные гидрооттаиватель ОГСБВ и электрооттаиватель ОГСБ-2М с различными диаметрами туб и температурными параметрами оттаивания. При этом анализировали биологическую полноценность и фертильность оттаянного семени.

Стимуляцию эструса у ремонтных свинок и у свиноматок через сутки после отъема поросят двух биологически активных точек 38 и 41 (Hsia I., Lee L., 1988) проводили с применением нового медицинского портативного электростимулятора «ДЭНАС», воздействующего на точки акупунктуры импульсным то­ком с частотой 10 Гц и напряжением в 9 вольт. Сертификат соответствия № РОСС РУ. МЕ27. ВО5035. Производство ООО «РЦ АРТ», Екатеринбург.

При статистической обработке данных использовали компьютерные программы «Microsoft Excel-2007». Всего биометрически обработано 18463 показателя.

Ряд исследований выполнялось совместно с сотрудниками отдела биологии воспроизведения и искусственного осеменения животных ВНИИ племенного дела (руководитель д.б.н., профессор А.С. Ерохин). Вклад автора в организацию и проведение исследований составляет 85%, анализ и обобщение результатов выполнено лично автором в полном объеме.

3.