Биофункциональные полимерно-неорганические носители для инженерии костной ткани 02. 00. 06 высокомолекулярные соединения
| Вид материала | Автореферат |
- Носители противоопухолевых препаратов на основе синтетических полипептидов 02. 00., 548.13kb.
- Ется снижением костной массы, нарушением микроархитектоники костной ткани и сопровождается, 317.69kb.
- Анализ ассоциации костной массы у спортсменов с биохимическими и молекулярно-генетическими, 218.76kb.
- Название факультета, 245.29kb.
- Реферат до последнего времени основным пластическим материалом для замещения костных, 105.35kb.
- Рубрикатор общие вопросы аналитической химии, 36.93kb.
- Тверской государственный технический университет реферат на тему, 430.37kb.
- Природные красители, 84.69kb.
- Н. М. Эмануэля ран защита состоится 27 сентября 2011, 701.9kb.
- Термические превращения полиариленфталидов и их производных 02. 00. 06 Высокомолекулярные, 622.74kb.
На правах рукописи
КОРЖИКОВ Виктор Александрович
БИОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОЛИМЕРНО-НЕОРГАНИЧЕСКИЕ
НОСИТЕЛИ ДЛЯ ИНЖЕНЕРИИ КОСТНОЙ ТКАНИ
02.00.06 – высокомолекулярные соединения
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
САНКТ-ПЕТЕРБУРГ
2009
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте
высокомолекулярных соединений РАН
Научный руководитель: доктор химических наук
Тенникова Татьяна Борисовна
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор
Власов Геннадий Петрович
кандидат химических наук, доцент
Домнина Нина Семёновна
Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный
технологический институт (технический
университет)
Защита диссертации состоится « 9 » апреля 2009 года в 10.00 час. на заседании
диссертационного совета Д 002.229.01 при Учреждении Российской академии наук Институте высокомолекулярных соединений РАН по адресу: 199004, г. Санкт-Петербург, Большой пр. В. О., д. 31, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской
академии наук Института высокомолекулярных соединений РАН.
Автореферат разослан « 2 » марта 2009 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 002.229.01
к
андидат физ.-мат. наук Долотова Н. А. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В настоящее время высокомолекулярные соединения широко используются в различных областях биологии и медицины благодаря возможности варьировать свойства материала в зависимости от состава и структуры используемых макромолекул. Разработано огромное количество полимерных биоматериалов, удовлетворяющих требованиям биосовместимости и выполняющих различные функции, в частности, имплантантов для замены поврежденного или утраченного участка костной ткани. Особый интерес представляет использование высокомолекулярных соединений в методе инженерии костной ткани, основанном на помещении клеток, полученных из тканей пациента, на трехмерный носитель (скаффолд), где происходит образование ткани за счет роста и дифференциации клеток. Развитие данного метода продемонстрировало, что для направления процесса в сторону образования костной ткани скаффолды должны функционировать в качестве системы контролируемой доставки биологических сигналов, управляющих поведением клеток. Поэтому возникает фундаментальный интерес изучения условий прочного связывания биологических молекул (лигандов) с поверхностью скаффолда. Несмотря на интенсивные исследования различных полимерных носителей на основе синтетических полимеров (полилактид, полигликолид) и природных биополимеров (хитозан, коллаген), к настоящему моменту не существует скаффолдов, удовлетворяющих как требованиям механической прочности, так и предоставляющих возможности биофункционализации. Кроме полимеров, в качестве каркасов для инженерии костной ткани используются макропористые керамические матрицы, обладающие достаточной механической прочностью и сходством со структурой неорганической составляющей костей.
В связи с вышесказанным, актуальной задачей представляется создание нового типа скаффолдов, сочетающих в себе керамическую и полимерную составляющие. При этом использование в качестве последней гидрофильных полимеров-носителей, ковалентно модифицированных специальными биологическими молекулами, открывает новые возможности применения полимеров в инженерии костной ткани. Подобный подход является оригинальным и не имеет описанных в литературе аналогов.
Предложенный в работе подход к созданию «интеллигентных» гибридных носителей клеток основан на идее адсорбционного покрытия трехмерной макропористой керамической матрицы биосовместимым полимером, способным к ковалентному связыванию биологических молекул (лигандов) без разрушения основной цепи. Биологическая полифункциональность должна обеспечиваться связыванием с полимерной составляющей конструируемого скаффолда лигандов различной специфичности. Минеральная составляющая, в данном случае, обеспечивает механическую прочность и поддержку трехмерного роста клеток, в то время как биофункционализированный полимерный компонент ответствен за передачу клеткам сигналов, управляющих их поведением на поверхности гибридной матрицы.
Таким образом, целью работы являлось создание полимерной системы, несущей биолиганды, и адсорбированной на поверхности неорганической матрицы с образованием материала, пригодного для использования в качестве скаффолдов для инженерии костной ткани, обеспечивающих интенсивную адгезию и рост клеток.
Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:
- синтез и исследование полимеров-носителей, содержащих контролируемое количество реакционноспособных групп, способных к ковалентному связыванию биолигандов;
- контролируемое ковалентное связывание биолигандов различной функциональности с полученными полимерами-носителями;
- получение полифункционального полимерного «вектора», содержащего биолиганды различных типов;
- изучение гидродинамических характеристик исходных полимеров-носителей и их конъюгатов с биолигандами различных молекулярных размеров;
- сравнительное исследование адсорбции полученных полимеров-носителей на различных неорганических материалах и выбор матрицы для создания гибридных скаффолдов;
- изучение адсорбции и десорбции синтезированных полимеров-носителей и их конъюгатов с биолигандами на выбранной неорганической матрице;
- оценка цитотоксичности полимеров-носителей и их конъюгатов с целевыми биологическими молекулами, а также исследование влияния введения различных биолигандов в полимерную составляющую гибридного скаффолда на поведение живых клеток.
В качестве методов исследования использовались свободно-радикальная полимеризация и сополимеризация, периодатное окисление α-гликолей и снятие диэтилацетальной защиты, N-алкилирование; вискозиметрия и светорассеяние; ЯМР спектроскопия, а также спектроскопия в ИК-, УФ- и видимой областях; полиакриламидный гель-электрофорез, флуоресцентный и фотометрический анализ, рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия; аффинная хроматография; специальные биологические методы работы с культурами клеток, а также методы обработки данных, полученных в биологических экспериментах.
Научная новизна.
- Разработана новая стратегия создания биофункциональных полимерно-неорганических скаффолдов для инженерии костной ткани, заключающаяся в использовании гидрофильного полимера-носителя в качестве подвижного макромолекулярного спейсера, адсорбционно связанного с поверхностью неорганической макропористой подложки и модифицированного биомолекулами, способными интенсифицировать процессы адгезии и роста клеток.
- Впервые получены гидрофильные полимеры-носители на основе поливинилсахаридов, содержащие контролируемое количество реакционноспособных альдегидных групп.
- Впервые проведено контролируемое ковалентное связывание биолигандов различной функциональности с полученными полимерами-носителями и доказана возможность создания полифункциольнального полимерного «вектора», содержащего несколько биолигандов различной специфичности.
- Показано наличие адсорбции полученных полимеров и конъюгатов на поверхности керамических матриц.
- Методами вискозиметрии и светорассеяния определены гидродинамические параметры полученных конъюгатов поливинилсахаридов с лигандами различного молекулярного размера.
- На основании тестов на цитотоксичность полученных полимеров в растворе и адсорбированном состоянии, а также гибридных скаффолдов, в полимерную составляющую которых были введены биомолекулы различной функциональности, показана возможность использования конъюгированных с биолигандами выбранных полимеров-носителей в качестве фактора, управляющего поведением клеток.
Практическая значимость. Разработан и экспериментально апробирован технологический принцип создания нового типа скаффолдов для инженерии костной ткани. На примере синтезированных альдегидсодержащих поливинилсахаридов показана перспективность контролируемой модификации полимеров-носителей специальными биомолекулами с возможностью получения моно-, би- и полифункциональных конъюгатов и последующем введением их путем адсорбции в состав гибридных скаффолдов для интенсификации процессов адгезии и роста клеток.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Создано первое поколение гибридных скаффолдов, включающих в себя полимер-носитель, несущий лиганды, управляющие поведением клеток.
- Путем полимераналогичных превращений, а также методом сополимеризации с защищенным альдегидным мономером, возможно контролируемое введение в поливинилсахариды альдегидных групп.
- Разработаны условия контролируемого введения биолигандов различной функциональности и молекулярного размера в альдегид-содержащие поливинилсахариды с различной структурой реакционноспособного звена, а также условия получения полифункционального полимерного «вектора», содержащего несколько лигандов различной биологической специфичности.
- Альдегидсодержащие полимеры-носители на основе винилсахарида и их конъюгаты с биолигандами образуют адсорбционное покрытие на поверхности минеральной матрицы, которое не обладает цитотоксичностью и оказывает положительное влияние на адгезию и рост клеток.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались в виде устных и стендовых сообщений на следующих симпозиумах и конференциях: 1-й и 4-й Санкт-Петербургских конференциях молодых ученых с международным участием «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, Россия, 2005 и 2008), The young scientists and students international scientific conference «Modern problems of microbiology and biotechnology» (Одесса, Украина, 2007), International symposium «European BioPerspectives 2007» (Кёльн, Германия, 2007), International symposium «20th Meeting of the European Society for Animal Cell Technology» (Дрезден, Германия, 2007), International conference «Baltic Polymer Symposium 2007» (Друскининкай, Литва, 2007), 6th International Symposium «Molecular Order and Mobility in Polymer Systems» (Санкт-Петербург, Россия, 2008). Кроме того, результаты диссертационной работы обсуждались на научно-практических семинарах в Институте высокомолекулярных соединений РАН (Санкт-Петербург, Россия, 2007) и в Институте технической химии Университета Ганновера (Ганновер, Германия, 2007). Работа была поддержана грантами РФФИ (№ 05-03-32310) и Немецкого Научного Общества (DFG, KA 1784/4–1). Для выполнения части исследования на территории Германии автор получил персональную стипендию Немецкой Службы Академических Обменов (DAAD, 1.09.2006 - 28.02.2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано тринадцать печатных работ, включающих 4 статьи и 9 тезисов докладов.
Вклад автора состоял в выполнении всех представленных в диссертации экспериментов, активном участии в интерпретации и обсуждении полученных результатов, а также в подготовке публикаций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы. Материалы диссертации изложены на 166 страницах, проиллюстрированы 24 таблицами и 61 рисунком, список цитируемой литературы включает 197 источников.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во Введении обоснована актуальность проводимых исследований, сформулированы цели и задачи работы, определена научная новизна, охарактеризована практическая значимость полученных результатов, изложены основные положения, выносимые на защиту, а также приведена структура диссертации.
Глава 1. Литературный обзор состоит из пяти частей. В первой части описан метод тканевой инженерии, приведены литературные данные по материалам, предлагаемым для регенерации костной ткани, и проанализированы различные подходы к созданию скаффолдов. Во второй части рассмотрены методы синтеза и введения реакционно-способных групп в гидрофильные полимеры с целью их использования в качестве полимеров-носителей. Третья часть посвящена описанию основных закономерностей адсорбции полимеров как стадии создания гибридного материала. В четвертой части проведена оценка перспективности использования различных биомолекул (биолигандов) для управления поведением клеток на поверхности скаффолда. Рассмотрены химические методы ковалентного связывания аминосодержащих молекул с реакционно-способными гидрофильными полимерами и особенности иммобилизации белков. В пятой части приведены типы используемых клеточных культур и стадии образования костной ткани. Обзор литературы завершается постановкой задач исследования.
Глава 2. В Экспериментальной части описаны синтез и функционализация альдегид-содержащих полимеров-носителей, методы их исследования, проведения экспериментов по адсорбции и экспериментов в культуре клеток.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Синтез полимеров-носителей
Основной задачей синтетической части работы являлся синтез реакционно-способного полимера-носителя, пригодного для создания на его основе полифункционального полимерного вектора, содержащего несколько типов биомолекул. В качестве основы для получения полимера-носителя был выбран винилсахарид – 2-деокси-N-метакрилоиламидо-D-глюкоза (МАГ). Наличие в его полимерах боковых сахаридных остатков позволяет предполагать проявляемое ими сродство к клеточным мембранам. Для ковалентного введения в полимер биолигандов наиболее перспективными представляются альдегидные группы, так как они позволяют связывать аминосодержащие биологические вещества в мягких условиях без выделения нежелательных побочных продуктов. В связи с этим возникла необходимость синтеза сополимера, содержащего звенья МАГ и звенья, несущие альдегидные группы.
Существует две экспериментальные возможности получения подобных сополимеров (Рис. 1.).
 |
| Рис. 1. Схемы синтезов альдегид-содержащих полимеров-носителей на основе 2-деокси-N-метакрилоиламидо-D-глюкозы (МАГ, I). Реакции: 1 – синтез МАГ; 2а – гомополимеризация МАГ; 2б – периодатное окисление полиМАГ (пМАГ); 3а – сополимеризация МАГ с N-винилпирролидоном (ВП); 3б - периодатное окисление звеньев МАГ в сополимере МАГ с ВП; 4 – сополимеризация МАГ с диэтилацеталем акролеина (ДААк); 5а – сополимеризация МАГ с ВП и ДААк; 5б – удаление диэтилацетальной защиты. Продукты: I – МАГ; II – пМАГ; III – окисленная пМАГ; IV – сополимер МАГ с ВП (п(МАГ-со-ВП)); V – окисленный п(МАГ-со-ВП); VI – сополимер МАГ с ВП и ДААк (п(МАГ-со-ВП-со-ДААк)); VII - п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) после удаления диэтилацетальной защиты с - п(МАГ-со-ВП-со-Ак). |
Первый метод заключается в полимераналогичном превращении предварительно синтезированного гомополимера МАГ (пМАГ) в альдегид-содержащий сополимер путем периодатного окисления (Рис. 1, реакция 2б) сахаридных звеньев. Также было проведено окисление сополимера МАГ с N-винилпирролидоном (п(МАГ-со-ВП)) (Рис. 1, реакция 3б), синтезированного, исходя из предположения о положительном влиянии винилпирролидона на адсорбцию полимера на минеральной матрице. Вторым методом является сополимеризация МАГ с альдегидсодержащим мономером (в нашем случае, диэтилацеталем акролеина, ДААк). Было установлено, что прямая сополимеризация МАГ с ДААк (Рис. 1, реакция 4) приводит к образованию практически гомополимера МАГ, содержащего следовые количества ДААк. С другой стороны, известно, что ДААк и МАГ достаточно легко образуют сополимеры с N-винилпирролидоном. Поэтому ВП был использован в качестве интермедиата для введения ДААк в структуру поливинилсахарида (Рис. 1, реакция 5а).
Образование сополимеров п(МАГ-со-ВП) и п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) (Рис. 1, продукты IV и VI) было доказано методами ЯМР спектроскопии. Наличие альдегидных групп в продуктах III, V и VII (Рис. 1) было качественно подтверждено методом ИК-спектроскопии путем идентификации полос в области 1740 – 1755 см-1.
При синтезе полимерной составляющей гибридного скаффолда необходимо обеспечить оптимальную величину ее молекулярной массы (ММ), гарантирующую, с одной стороны, адсорбцию на матрице, но, с другой, не препятствующую выводу полимера из организма при его возможной десорбции. Обычно значения ММ биологически значимых полимеров лежат в пределах 10000-30000. Для пМАГ это требование выполнялось путем подбора условий синтеза ([МАГ] = 10 масс%, [АИБН] = 5 масс%, ДМФА, выход 98%), в случае п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) учитывалось введение ДААк, которое приводит к уменьшению ММ продуктов сополимеризации.
| Таблица 1 Окисление пМАГ | |||
| № | Полимер | [NaIO4]:[ МАГ], моль | [CHO], моль% |
| 1 | пМАГ | 2.0 | 55 |
| 2 | -“- | 1.0 | 40 |
| 3 | -“- | 0.7 | 30 |
| 4 | -“- | 0.3 | 10 |
Содержание ДААк в тройных сополимерах значительно ниже, чем в исходной мономерной смеси, что может быть объяснено его способностью к деградационному переносу в процессе роста цепи, приводящему к уменьшению выхода продукта и его молекулярной массы. Однако, количество введенного в сополимер ДААк, и, следовательно, альдегидных групп, можно варьировать путем изменения количества ВП в исходной реакционной смеси (Таблица 2).
Таблица 2
Сополимеризация МАГ (М1) с ВП (М2) и ДААк (М3)
| № | Сополимер | Условия сополимеризации | Характеристики сополимеров | ||||
| Соотношение мономеров, моль% | [M1+M2 (+M3)], масс% | [АИБН], масс% от [M1+M2(+M3)] | Выход % | [m1]:[m2](:[m3]) моль% | Mη• 10-4 | ||
| 5 | п(МАГ-со-ВП) | 50 : 50 | 10 | 4 | 60 | 77 : 23 | 2.40 |
| 6 | п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) | 30 : 30 : 40 | 40 | 1 | 39 | 82 : 15 : 3 | 2.00 |
| 7 | п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) | 20 : 40 : 40 | 40 | 1 | 31 | 79 : 16 : 5 | 1.75 |
| 8 | п(МАГ-со-ВП-со-ДААк) | 15 : 45 : 40 | 40 | 1 | 22 | 75 : 18 : 7 | 1.35 |