Биофункциональные полимерно-неорганические носители для инженерии костной ткани 02. 00. 06 высокомолекулярные соединения

Вид материала

Автореферат

Содержание 3.4. Адсорбция полимеров и конъюгатов Адсорбция конъюгатов 3.5. Апробация полученных скаффолдов Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях

Подобный материал:

• Носители противоопухолевых препаратов на основе синтетических полипептидов 02. 00., 548.13kb.
• Ется снижением костной массы, нарушением микроархитектоники костной ткани и сопровождается, 317.69kb.
• Анализ ассоциации костной массы у спортсменов с биохимическими и молекулярно-генетическими, 218.76kb.
• Название факультета, 245.29kb.
• Реферат до последнего времени основным пластическим материалом для замещения костных, 105.35kb.
• Рубрикатор общие вопросы аналитической химии, 36.93kb.
• Тверской государственный технический университет реферат на тему, 430.37kb.
• Природные красители, 84.69kb.
• Н. М. Эмануэля ран защита состоится 27 сентября 2011, 701.9kb.
• Термические превращения полиариленфталидов и их производных 02. 00. 06 Высокомолекулярные, 622.74kb.

Таблица 8

Размеры макромолекул полимеров и конъюгатов, полученные методами статического и динамического светорассеяния

Образец	Растворитель	RH(1), нм	RН(общ.), нм	RG, нм
пМАГ	б/б рН 10.0	3.9	45	33
п(МАГ-со-ВП)	б/б рН 10.0	4.2	40	38
окисл. пМАГ	б/р-р рН 7.0	6.2	82	70
пМАГ-глицин	б/р-р рН 7.0	5.3	68	80
пМАГ-(РНКаза-глицин)	б/р-р рН 7.0	7.8	122	101

R_H(1) – гидродинамический радиус, определенный по быстрой моде;

R_Н(общ.) – гидродинамический радиус, усредненный по обеим модам;

R_G – радиус инерции

Кроме того, оказалось возможным обозначить предпочтительные для адсорбции полимеров и конъюгатов условия. Так как при покрытии поверхности минеральной матрицы желательно получение адсорбционного слоя, обеспечивающего доступность сигнальных молекул для клеточных рецепторов, необходимо проводить процесс при низких концентрациях полимеров и их конъюгатов (меньше 1 г/дл), т. е. в условиях минимальной концентрации ассоциативных структур.

3.4. Адсорбция полимеров и конъюгатов

Адсорбция полимеров

Для определения возможности создания полимерно-неорганических композитов было проведено изучение адсорбции полученных полимеров на следующих минеральных носителях: гидроксиапатит (ГА), биокерамических матрицах Bio-Oss и Sponceram. Сравнительное исследование количества адсорбированного вещества показало, что исходные полимеры адсорбируются в максимальном количестве (Рис. 5) на керамической матрице Sponceram, который был выбран для дальнейших исследований.

Рис. 5. Морфологическая структура керамической матрицы Sponceram

Данный коммерчески доступный носитель, специально разработанный для культивирования клеток в биореакторах, представляет собой неорганическое твердое вещество на основе ZrO₂, допированного гидроксиапатитом.

Из кинетических кривых адсорбции исходных полимеров видно (Рис. 6), что процесс протекает достаточно быстро и достигает максимума примерно через 100 мин.

Рис. 6. Кинетические кривые (а) и изотермы адсорбции (б) исследуемых полимеров на носителе Sponceram. Условия адсорбции: объем раствора - 1.5 мл; 0.01 М натрий-боратный раствор, рН 7.0; 25°С; навеска Sponceram (монолит) – 50 ± 10 мг, концентрация полимеров (а) 1 мг/мл, (б) 0.25 – 3.5 мг/мл; Время инкубации полимера с минеральным носителем в случае построения изотермы адсорбции составляло 4 часа.

Для исследованных полимеров способность к адсорбции не имела особых отличий. Вероятно, адсорбция осуществляется в основном за счет звеньев МАГ, что объясняется их способностью образовывать водородные связи с отрицательно заряженными атомами кислорода на поверхности керамики. Таким образом, дальнейшее исследование влияния введения лигандов на процесс адсорбции проводили с использованием в качестве полимера-носителя только окисленной пМАГ.

Адсорбция конъюгатов

Представленные на Рис. 7 данные демонстрируют аналогию форм кинетических кривых и изотерм адсорбции конъюгатов окисленной пМАГ с макромолекулярными лигандами (РНКазой и пЛиз) с формами, установленными для исходного полимера. Можно предположить, что взаимодействие этих конъюгатов с поверхностью Sponceram определяется структурой полимерной составляющей конъюгата (пМАГ). В то же время, количество адсорбированного вещества зависит от наличия в структуре окисленной пМАГ ковалентно-связанных лигандов. Так, незначительное увеличение адсорбции пМАГ-РНКаза по сравнению с окисленной пМАГ, по всей видимости, обусловлено влиянием белка на адсорбционные характеристики конъюгата.

Как и ожидалось, наибольшее количество адсорбированного вещества наблюдалось в случае конъюгата пМАГ-пЛиз, что связано с положительным зарядом цепи полиаминокислоты, обуславливающим дополнительное электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженной поверхностью Sponceram. При этом на изотерме адсорбции пМАГ-пЛиз отсутствует ярко выраженное плато насыщения, что можно объяснить полимолекулярной природой адсорбции данного конъюгата.

Рис. 7. Кинетические кривые (а) и изотермы адсорбции (б) на Sponceram окисленной пМАГ и её конъюгатов с РНКазой, пЛиз и GRGDSP-пептидом. Условия адсорбции: (а) концентрация окисленной пМАГ и конъюгатов – 1 мг/мл; объем раствора - 1.5 мл; 0.01 М натрий-боратный раствор, рН 7.0; 25°С; навеска Sponceram (монолит) – 50 ± 10 мг. (б) концентрация окисленной пМАГ и конъюгатов 0.25 – 3.5 мг/мл; объем раствора - 1.5 мл; 0.01 М натрий-боратный раствор, рН 7.0; 25°С; навеска Sponceram (монолит) – 50 ± 10 мг; время инкубации растворов полимера с минеральным носителем - 4 часа.

Напротив, в случае конъюгата окисленной пМАГ с GRGDSP-пептидом наблюдается значительное уменьшение количества адсорбированного вещества и изменение вида зависимостей. Эти явления, вероятно, вызваны изменением макроструктуры полимера в результате связывания с низкомолекулярным лигандом и, как следствие, изменением способности к адсорбции данного конъюгата, что согласуется с результатами, полученными методами вискозиметрии и светорассеяния.

Учитывая аналогичность вида кинетической зависимости и изотермы адсорбции конъюгата пМАГ-РНКаза-пЛиз-GRGDSP и пМАГ-пЛиз, можно сделать вывод о том, что значительный вклад в адсорбцию «смешанного» конъюгата вносит наличие в его структуре пЛиз.

Также была исследована десорбция полимеров и конъюгатов в течение 14 суток, т. е. в течение времени, когда происходит адгезия и наиболее интенсивный рост клеток. Данные по максимальной адсорбции, определенные по плато на изотермах и по количеству десорбированных полимеров и конъюгатов, представлены в Таблице 9.

Таблица 9

Параметры адсорбции и десорбции полимеров и конъюгатов окисленной пМАГ

с различными лигандами

Образец	Qмакс, мг/г Sponceram	Количество десорбированного полимера, мг/г Sponceram
8 суток	14 суток
окисленная пМАГ	16.5	0.2	0.3
п(МАГ-со-ВП-со-ДААк)	14.1	0.3	0.5
пМАГ-пЛиз	18.2	0.3	0.4
пМАГ-РНКаза	17.0	0.2	0.3
пМАГ-GRGDSP	6.1	0.0	0.1
пМАГ-(РНКаза)-(пЛиз)-(GRGDSP)	17.7	0.1	0.2

Очевидно, что десорбция полимеров и их конъюгатов в указанный промежуток времени незначительна, что позволило рекомендовать обсуждаемые образцы для клеточных экспериментов.

Образование адсорбционного слоя с толщиной менее 10 нм на поверхности Sponceram в случае окисленной пМАГ и ее конъюгата с пЛиз показано методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС).

Таким образом, результаты, полученные при исследовании адсорбции и десорбции исходных полимеров-носителей и синтезированных на их основе конъюгатов с различными лигандами, подтвердили возможность создания полимерно-неорганических материалов для инженерии костной ткани путем адсорбционного покрытия поверхности минеральной матрицы (Sponceram) полифункциональным полимерным вектором, выполняющим к тому же роль гибкого макроспейсера, повышающего доступность для клеток сайтов биоспецифического взаимодействия.

3.5. Апробация полученных скаффолдов

Изучение возможности применения полученных гибридных материалов для выращивания костной ткани проводили с использованием коммерческой линии клеток - предшественников остеобластов, выделенных из свода черепа мышей (MT3C3-E1).

Для изучения возможности использования полученных каркасов в клеточных экспериментах использовали тест на цитотоксичность, основанный на реакции восстановления бесцветной соли тетразолия (МТТ, 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолбромида) митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически активных клеток с образованием голубых растворимых в ДМСО кристаллов формазана. Этот высокочувствительный метод, называемый МТТ-тестом, позволяет определять количество жизнеспособных клеток при взаимодействии с чужеродным материалом. Особый интерес представляют концентрационные и временные зависимости количества живых клеток, контактирующих с материалом, указывающие на степень токсичности материала или её полное отсутствие.

В данной работе была проведена серия экспериментов, направленная на изучение цитотоксичности исходных полимеров-носителей и полученных биофункциональных скаффолдов. Кроме этого, использование МТТ-теста позволило оценить влияние покрытия поверхности Sponceram полимерными конъюгатами с биолигандами на адгезию и рост клеток.

Как уже было сказано выше, создаваемые гибридные скаффолды состоят из двух компонентов: минеральной матрицы и полимерной составляющей. Отсутствие цитотоксичности у Sponceram было доказано компанией–производителем (ZellWerk GmbH) и практическими исследованиями, проводимыми в Институте технической химии Университета Ганновера. Исследование альдегидных форм полученных полимеров показало значительную токсичность их растворов и полное ее отсутствие для адсорбированных форм. Более того, блокирование альдегидных групп полимеров вводимыми лигандами также приводило к получению нетоксичных растворимых продуктов.

Для изучения влияния адсорбционного покрытия Sponceram конъюгатами полимеров с биолигандами использовали так называемый «короткий» МТТ-тест, когда детектирование количества жизнеспособных клеток на полученных гибридных матрицах проводили в течение первых суток после высевания (Рис. 8, а и б).

Рис. 8. Результаты «короткого» МТТ-теста: количество жизнезнеспособных клеток на Sponceram и Sponceram, покрытом конъюгатами пМАГ (а) и п(МАГ-со-ВП-со-Ак) (б) с GRGDSP-пептидом и пЛиз в течение первых суток после высевания. Данные по оси ординат приведены в относительных единицах, рассчитанных на основе значений оптической плотности растворов формазана.

В случае Sponceram, покрытого конъюгатом пМАГ-пЛиз, наблюдается увеличение количества жизнеспособных клеток на поверхности скаффолда за счет электростатического притяжения отрицательно заряженных мембран клеток (Рис. 8, а), причем введение пЛиз увеличивает адгезию клеток только в первые 2-4 часа, а затем влияние лиганда ослабляется. Следовательно, поли-L-лизин оказывает влияние только на начальный этап адгезионного взаимодействия клеток с поверхностью матрицы.

В случае модификации Sponceram конъюгатом пМАГ-GRGDSP, зафиксировано большее количество жизнеспособных клеток, чем в случае чистого Sponceram. Отличие количества жизнеспособных клеток через 24 часа для конъюгатов пМАГ-GRGDSP и пМАГ-пЛиз, по всей видимости, обусловлено различным механизмом взаимодействия клеток с лигандами.

Рис. 9. Результаты флуоресцентного определения количества DAPI-меченных клеток на поверхности чистого Sponceram и гибридных скаффолдов через 1, 4 и 24 часа после высевания.

Обсужденные закономерности адгезии клеток проявляются и при покрытии поверхности Sponceram конъюгатами на основе п(МАГ-со-ВП-со-Ак) (Рис. 8, б).

Для исследования влияния адсорбционного покрытия Sponceram конъюгатом окисленной пМАГ с GRGDSP-пептидом, а также «смешанным» конъюгатом пМАГ-пЛиз-GRGDSP на адгезию клеток был проведен эксперимент, основанный на флуоресцентном детектировании количества прикрепленных клеток (DAPI). С этой целью клетки высевали на диски Sponceram одинакового размера, предварительно помещенные внутрь силиконового кольца для фиксации клеток внутри матрицы.

Из зависимости количества прикрепленных клеток Sponceram/пМАГ-GRGDSP в течение первых суток культивации видно, что адгезия клеток на поверхности гибридной матрицы протекает более интенсивно в сравнении с чистым Sponceram (Рис. 9). Этот факт аналогичен данным, полученным при использовании МТТ-теста.

Изучение «смешанного» конъюгата пМАГ-пЛиз-GRGDSP показало, что совместное использование двух лигандов оказывает большее влияние на адгезию клеток, чем в случае моноконъюгатов (Рис. 9).

Рис. 10. Результаты «длительного» МТТ-теста: количество жизнезнеспособных клеток на чистом Sponceram и Sponceram, покрытом конъюгатами п(МАГ-со-ВП-со-Ак) с GRGDSP-пептидом и BMP-2 в течение тринадцати суток после высевания. Данные по оси ординат приведены в относительных единицах, рассчитанных на основе значений оптической плотности растворов формазана.

Целевыми лигандами, способными изменять динамику роста клеток на скаффолде, являются биомолекулы, специфически взаимодействующие с клетками, а именно, GRGDSP-пептид и фактор роста BMP-2. Поэтому было исследовано влияние покрытия поверхности Sponceram конъюгатами этих лигандов с полимерами-носителями на жизнеспособность клеток в течение первых 13-ти суток, т. е. в период их наиболее интенсивного роста. Для этого был использован «длительный» МТТ-тест (Рис. 10).

Полученные данные на примере тройного сополимера конъюгированного с RGD-пептидом и фактором роста BMP-2, показывают (Рис. 10), что рост клеток, начиная с третьих суток эксперимента, происходит интенсивнее на поверхности полимерно-неорганических носителей, чем на чистом Sponceram.

Приведенные закономерности свидетельствуют о положительном влиянии исследуемых гибридных носителей на адгезию и рост клеток по сравнению с чистой керамической матрицей Sponceram.

ВЫВОДЫ

1. Разработана стратегия получения полимерно-неорганических биораспознающих носителей клеток, или скаффолдов, для инженерии костной ткани, основанная на адсорбционном покрытии макропористой керамической основы биосовместимыми (со)полимерами винилсахаридов, модифицированными управляющими поведением клеток биологическими молекулами (биолигандами).
   
2. Впервые методом свободно-радикальной полимеризации синтезирован гомологичный ряд полимеров на основе винилсахарида 2-деокси-N-метакрилоил-амидоглюкозы (МАГ): гомополимер, сополимер с N-винилпирролидоном и тройной сополимер с N-винилпирролидоном и диэтилацеталем акролеина; в последнем случае N-винилпирролидон выполнял роль инертного интермедиата, позволяющего вводить в структуру сополимера МАГ реакционноспособные альдегидные группы.
   
3. Впервые методами полимераналогичных превращений и сополимеризации с защищенной формой акролеина с дальнейшей активацией альдегида в полученном сополимере синтезированы новые альдегидсодержащие полимеры, принадлежащие к классу поливинилсахаридов, а именно, окисленная периодатом натрия поли(2-деокси-N-метакрилоиламидоглюкоза) и поли([2-деокси-N-метакрилоиламидо-глюкоза]-со-[1-винилпирролидин-2-он]-cо-[акролеин]). Показана возможность контролируемого введения альдегидных групп в полученные макромолекулярные соединения.
   
4. Разработаны методы контролируемого синтеза моноконъюгатов полученных полимеров с лигандами различной биологической функциональности, а именно, фактором неспецифической адгезии клеток макромолекулярным поли-L-лизином, фактором роста и дифференциации клеток белком BMP-2, а также низкомолекулярным интегрин-связывающим RGD-пептидом. Экспериментально установленные закономерности реакций конъюгирования позволили предложить метод создания «смешанных» конъюгатов - би- и трифункциональных полимерных векторов, представляющих собой контролируемое сочетание двух или трех биолигандов в структуре выбранных полимеров.
   
5. Исследованы процессы адсорбции и десорбции полученных полимеров и их биоконъюгатов. Установлено влияние химического строения полимеров-носителей и присоединяемых биолигандов на процесс адсорбции. Показана практическая необратимость адсорбции полимеров и конъюгатов, как в модельных экспериментах, так и в культуральной среде, используемой для роста клеток.
   
6. Показано, что синтезированные альдегидсодержащие полимеры на основе винилсахарида в виде их биофункциональных конъюгатов значительно стимулируют прикрепление клеток к поверхности скаффолда, ускоряют их рост и образование ткани по сравнению с немодифицированной керамической основой скаффолда.
   

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

1. Korzhikov V. A., Diederichs S., Nazarova O. V., Vlakh E. G., Kasper C., Panarin E. F., Tennikova T. B. Water-soluble aldehyde bearing polymers of 2-deoxy-2-methcarylamido-D-glucose for bone tissue engineering // Journal of Applied Polymer Science. 2008. V. 108, I. 4. P.2386-2397.

2. Korzhikov V., Roeker S., Vlakh E., Kasper C., Tennikova T. Synthesis of multifunctional polyvinylsaccharides containing controllable amounts of biospecific and non-specific ligands // Bioconjugates Сhemistry. 2008. V. 19, I. 3. P. 617-625.

3. Коржиков В. А., Филиппов А. П., Власова Е. Н., Панарин Е. Ф., Тенникова Т. Б. Физико-химическое исследование структуры полимеров на основе 2-деокси-N-метакрилоиламидо-D-глюкозы и их конъюгатов с лигандами различного молекулярного размера // Журнал Прикладной Химии. 2008. Т. 81, вып. 8. – C.1311-1319.

4. Korzhikov V., Vlakh E., Nazarova O., Panarin E., Tennikova T. Synthesis and modification of hydrophilic polymers based on 2-deoxy-N-methacrylamido-D-glucose // Proceedings of Baltic Polymer Symposium. 2007. P.40-44.

5. Коржиков В. А., Афанасьева Е. В., Назарова О. В. Синтез альдегидсодержащих полимеров на основе N-метакрилоиламиноглюкозы // Тезисы докладов I СПб Конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах». 2005. C.75.

6. Korzhikov V., Vlakh E., Panarin E., Tennikova T., Diederichs S., Roeker S., Kasper C. Construction of biofunctional polymer-mineral composites for bone tissue engineering // The Young Scientists’ and Students’ International Scientific Conference “Modern Problems of Microbiology and Biotechnology”, Odessa, Ukraine. 2007. Book of Abstracts. P.93.

7. Roeker S., Diederichs S., Korzhikov V., Scheper T., van Griensven M., Tennikova T., Kasper C. Development of «smart» scaffolds for bone tissue engineering // “European BioPerspectives 2007”. Cologne, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.284.
   
8. Korzhikov V., Vlakh E. G., Diederichs S., Roeker S., Tennikova T. B., Kasper C. Water-soluble polymers for construction of composite scaffolds for bone tissue engineering: synthesis and adsorption study // “European BioPerspectives 2007”. Cologne, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.298.
   
9. Korzhikov V., Vlakh E. G., Diederichs S., Roeker S., Tennikova T. B., Kasper C.. New water-soluble polymers for construction of biofunctionalized scaffolds for bone tissue engineering: synthesis and adsorption study // 20^th Meeting of the European Society for Animal Cell Technology (ESACT-2007), Dresden, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.270.
   
10. Roeker S., Diederichs S., Korzhikov V., Scheper T., Tennikova T., Kasper C. Biofunctional polymer-mineral composites as scaffolds for bone tissue engineering // 20^th Meeting of the European Society for Animal Cell Technology (ESACT-2007), Dresden, Germany. 2007. Book of Abstracts. P.274.
    
11. Vlakh E., Korzhikov V., Nazarova O., Panarin E., Tennikova T. Synthesis and modification of hydrophilic polymers based on 2-deoxy-N-methacrylamido-D-glucose // Baltic Polymer Symposium 2007 (BPS 2007), Druskinikai, Lithuania. 2007. Book of Abstracts. P.75.
    
12. Korzhikov V. A., Vlakh E. G., Nazarova O. V., Panarin E. F., Tennikova T. B. Synthesis, biofunctionalization and adsorption of polymers based on 2-deoxy-N-methacrylamido-D-glucose for bone tissue engineering // 4^th Saint-Petersburg young scientists conference “Modern problems of polymer science”, Saint-Petersburg. 2008. Program and abstract book. P. 23.
    
13. Korzhikov V. A., Filippov A. P., Panarin E. F., Tennikova .T. B. Hydrodynamic properties of the polymers based on 2-deoxy-N-methacrylamido-D-glucose and their conjugates with small and macromolecular bioligands // 6^th International Symposium “Molecular Order and Mobility in Polymer Systems”. Saint-Petersburg. 2008. Book of abstracts. P.147.
    

Бесплатно.


Копировально-множительный участок

отдела обслуживания учебного процесса

Физического факультета СПбГУ

Тираж 120 экз.