Geum.ru

Вступ. Актуальність

Вид материалаДокументы

Содержание


Оцінка - результату.
Помилки при визначенні Rh- фактора
4. Бiологiчна проба
Розділ ІІ . Експериментальне дослідження.
Північні райони області
Подобный материал:
1   2   3   4   5

а. Визначення груп крові системи АВ0 стандартними сироватками.


Групова приналежність крові визначається реакцією аглютинації за допомогою стандартних ізогемаглютинуючих сироваток або моноклональних антитіл.

Стандартні сироватки системи АВ0. двох різних серій кожної групи наносять на пластинку під відповідними позначеннями так, щоб вийшло два ряди по три великі краплі (0,1 мл) в наступному порядку зліва направо:

ab(I), Ab(II), Bb(III). Досліджувану кров наносять по одній маленькій краплі (0,01 мл) поряд з кожною краплею сироватки і перемішують кров з сироваткою.

Спостереження за ходом реакції проводять при легкому похитуванні пластинки протягом 5 хв. при кімнатній температурі. У міру настання аглютинації, але не раніше ніж через 3 хв. В краплі, в яких наступила аглютинація еритроцитів, додають по одній краплі (0,05 мл) ізотонічного розчину хлориду натрію і продовжують спостереження до закінчення 5 хв.

Оцінка - результату. Реакція в кожній краплі може бути позитивною (наявність аглютинації еритроцитів) і негативною (відсутність аглютинації) [6].

Різні поєднання позитивних і негативних результатів дають можливість судити про групову приналежність досліджуваної крові (див.табл.1).



Оцінка результатів визначення груп крові за допомогою стандартних ізогемаглютинуючих сироваток. Знаком плюс (+) позначено наявність аглютинації, знайомий мінус (-) – її відсутність.

Як видно з таблиці, результат оцінюється залежно від реакції із стандартними сироватками групи ab(I), Ab(II), Bb(III). В таких випадках, коли позитивний результат одержаний з сироваткою всіх трьох груп, для виключення неспецифічної аглютинації виробляється контрольне дослідження із стандартною сироваткою групи АВ(ІV), що не містить групових аглютинінів. Лише відсутність аглютинації в цій контрольній пробі дозволяє врахувати позитивний результат з сироватками груп ab(I), Ab(II), Bb(III) як істинний, тобто приналежність досліджуваної крові до групи АВ(ІV). За наявності панаглютінації і, відповідно, неможливості визначити групову приналежність за системою АВ0, кров хворого підлягає обов'язковому направленню до станцію переливання крові до спеціаліста-серолога.

б. Визначення групи крові системи AB0 моноклональними антитілами. Визначення групи крові системи АВ0 моноклональними реагентами (Цоліклони Анти-А і Анти-В) виробляється звичними методами виявлення антигенів еритроцитів: при масовому визначень в установах служби крові - на планшетах або в автоматичних системах, при індивідуальному визначенні - на білій фарфоровій або будь-якій іншій пластинці із змочуваною поверхнею; у хворих визначення групи крові можна проводити на картках Цолітест.

Беручи до уваги високу активність реагентів Цоліклон, а також повну їх стандартність, для кожного визначення групи крові достатньо застосовувати по одній серії реагентів Анти-А і Анти-В.

Цоліклони Анти-А і Анти-В наносять на планшет або пластинку по одній великій краплі (0.1 мл) під відповідними написами: "Анти-А" або "Анти-В". Поряд з краплями антитіл наносять досліджувану кров по одній маленькій краплі (0,01 мл). Після змішування реагентів і крові за реакцією аглютинації спостерігають протягом 2,5 хв.

У сольовому середовищі реакцію аглютинації проводять в пробірках або круглодоній мікроплаті, змішуючи рівні об'єми антитіл (0,1 мл) і 2 % суспензії досліджуваних еритроцитів. Результати реакції оцінюють по малюнку осаду еритроцитів на дні лунок мікроплати через 30-60 хв. інкубації, або по наявності або відсутності аглютинації в пробірках після негайного центрифугування і струшування.

На картках Цолітест групу крові визначають відповідно до прикладеної до них інструкції.

Оцінка результатів реакції аглютинації Цоліклонами Анти-А і Анти-В представлена в таблиці 2, в яку також включені результати визначення агилютинінів в сироватці (плазмі) донорів за допомогою стандартних еритроцитів.



I. Аглютинації немає (-) ні з Цоліклоном анти-А, ні з Цоліклоном анти-В. Отже, досліджувані еритроцити не містять антигенів А і В, і кров належить до групи 0(1). Це підтверджується наявністю аглютінінів ab(I), Ab(II), Bb(III) у досліджуваній сироватці (плазмі) за наслідками позитивної реакції аглютинації із стандартними еритроцитами груп А(П) і В(Ш).

Аглютинація (+) спостерігається тільки з Цоліклоном анти-А. Отже, досліджувані еритроцити містять тільки антиген А, і кров належить до групи А(П). Це підтверджується наявністю агглютінінов b у досліджуваній сироватці (плазмі) за наслідками позитивної реакції аглютинації із стандартними еритроцитами групи В(Ш).

Аглютинація (+) спостерігається тільки з Цоліклоном анти-В. Отже, досліджувані еритроцити містять тільки антиген В, і кров належить до групи В(Ш). Це підтверджується наявністю агглютінінів a у досліджуваній сироватці (плазмі) за наслідками позитивної реакції аглютинації із стандартними еритроцитами групи А(П).

Аглютинація (+) спостерігається як з Цоліклоном анти-А, так і з Цоліклоном анти-В. Отже, досліджувані еритроцити містять обидва антигени (А і В), і кров належить до групи АВ(IV). Це підтверджується відсутністю аглютінінів a і b у досліджуваній сироватці (плазмі) за наслідками негативної реакції аглютинації із стандартними еритроцитами груп А(П) і В(Ш).

З метою виключення аутоаглютинації яка може спостерігатися у деяких хворих (мієломна хвороба, опікова хвороба), а також в пуповинній крові новонароджених, у разі встановлення групи крові АВ(IV) провести контрольне дослідження; одну краплю (0,1 мл) ізотонічного розчину хлористого натрію змішують з маленькою краплею (0,01 мл) досліджуваної крові. Реакція аглютинації повинна бути відсутньою [7].

в. Визначення резус-приналежності крові.

При визначенні резус - приналежності лікар вибирає метод відповідно до нині діючих інструкцій і сироватки, що є в його розпорядженні, антирезус (анти-Д) або анти-Д антитілами. У інструкції, прикладеній до сироватки антирезус (реагенту), указується метод його застосування.

В умовах лабораторії дослідження проводять:

- за допомогою стандартних сироваток «експрес –метод» (додаток-1);

- методом конглютинації із застосуванням желатину(додаток-2);

- за допомогою стандартного універсального реагенту(в пробірках без підігріву)(додаток-3);

- методом аглютинації в сольовому середовищі за допомогою сироваток, що містять повні резус-антитіла(додаток-4);

-за допомогою моноклональних Тест-реагентів анти-Д(додаток-5);

-за допомогою моноклонального реагенту Анти-С(додаток-6).

Помилки при визначенні Rh- фактора

1. Помилки організаційно-технічного характеру:

-неправильний вибір антирезусних сироваток за груповою належністю.

-помилковий порядок розміщення сироваток, реагентів або дослідної крові у штативах.

-неправильне співвідношення між сироваткою і еритроцитами (еритроцитів повинно бути приблизно в 10 разів менше ніж сироватки).

-недотримання необхідної температури в водяній бані (при температурі нижчій від 420 С аглютинація може не наступити, при вищій від 480 С краплини швидко висохнуть).

-недотримання часу, необхідного для проведення реакції.

-висновок робиться з висохлої краплі.

-використання для визначення резус-фактора старої, гемолізованої або інфікованої крові.

-визначення резус - належності за допомогою однієї серії антирезусної сироватки.

2. Помилки пов'язані з використанням недоброякісних сироваток:

-використання протермінованих сироваток.

-використання малоактивних сироваток.

-використання забруднених, інфікованих сироваток.

3. Помилки зумовлені біологічними особливостями дослідної крові:

-феномен поліаглютинабельності еритроцитів. Полігаглютинацію вдається усунути за допомогою відмивання еритроцитів, хоч і не завжди;

-наявність антигену DU (слабка різновидність антигену D). Еритроцити з цим аглютиногеном дають дуже нечітку аглютинацію зі стандартними антирезусними сироватками та з МКА. Реципієнтів з антигеном DU рахують резус негативними, донорів резус позитивними;

-зниження рівня резус - аглютиногенів при деяких захворюваннях (хвороби системи крові, печінки, нирок, імунної системи).

г. Оцінка результатів визначення резус-належності стандартними сироватками.

1. Під час визначення резус-належності двома серіями стандартних сироваток у тих випадках, коли вони використовуються різними методами, результат враховують як вірогідний за умови співпадання його в обох серіях досліджень після перевірки контрольних зразків, які підтверджують специфічність і активність кожної серії сироватки антирезус, тобто за відсутності аглютинації зі стандартними резус-негативними еритроцитами однойменної групи і наявності аглютинації зі стандартними резус-позитивними еритроцитами однойменної або групи 0(1) І в контрольних пробах без сироватки (реагенту) антирезус.

2. Якщо під час визначення резус-належності спостерігається слабка або сумнівна реакція, то слід повторно досліджувати кров даної особи тими ж та іншими серіями сироватки антирезус або моноклональними реагентами, а також використовувати сироватку, що вміщує повні антитіла.

Якщо за таких умов усі серії сироваток, що містять неповні антитіла, дадуть також слабку або сумнівну реакцію, а з повними антитілами реакція буде негативною, це означає, що еритроцити мають слабку різновидність антигену резус, так званий фактор DU, який зустрічається в популяції з частотою близько 1%. У цих випадках резус-належність крові хворого або вагітної жінки оцінюють, як резус-негативну (Rh-), а резус-належність крові донора - як резус-позитивну (Rh+), не допускаючи, таким чином, переливання його крові резус-негативним реципієнтам.

3. Інколи зустрічаються зразки еритроцитів, що дають слабко виражену реакцію. У цих випадках слід повторно досліджувати їх кількома серіями сироваток антирезус високої активності або моноклональними антитілами (реагенти анти D-супер).

4. Для визначення резус-належності крові донорів недостатньо розділення їх тільки на резус-позитивних і резус-негативних за сироваткою анти-D(Rh0), а необхідно додатково досліджувати сироватками, що мають антитіла анти-С(rh') і анти-Е(rh"), або моноклональними антитілами.

До числа резус-негативних донорів зараховують тільки тих осіб, кров яких не має ні одного з вказаних антигенів.

5. Визначення антигенів резус - С(rh'), Е(rh"), с(hr') і е (hr") проводять сироватками, що мають антитіла відповідної специфічності, або моноклональними реагентами. Ці антитіла можуть бути в сироватці як у чистому вигляді, так і в різних співвідношеннях.

Ці дослідження проводять тими ж методами, що і визначення резус-фактора - D(Rh0). Як позитивний контроль використовують стандартні еритроцити, що мають відповідний антиген.

Проведення проб на сумісності в трансфузійній терапії.

1. Отримання сироватки кровi хворого.

Для виконання перших двох проб необхiдно мати сироватку кровi хворого. Вона повинна бути свiжою, отриманою в день переливания крові (але не бiльше нiж за один день до трансфузiї) при зберiганні її при температурi +40 +6 0С. Обмеження в часi зв’язане з тим, що в клiнiчнiй практицi можуть траплятися хворi з ізоімунними антитiлами, активність і специфiчність яких може змінюватися. У зв’язку з цим, кров одержана за декілька днів до передбачуваної трансфузії, за імунологічною характеристикою може відрізнятися від крові хворого в день трансфузії, і проба з такою «старою» кров'ю не виявить несумісності . Крім цього, при бiльш тривалому зберiганнi кровi, особливо при кiмнатнiй температурi, можливий гемолiз, iнфiкування її в пробiрцi. Гемоліз може розвинутися також при взятті крові в мокру або забруднену пробірку (при використаннi стерильних пробiрок їх необхiдно автоклавувати в бiксах вверх дном), при попаданнi води в пробiрку з кров’ю, пiд час зберiганяя в холодильнику під морозильною камерою. Про наявнiсть гемолiзу свiдчить поява рожевого забарвлення сироватки в пробiрцi. Ознаками iнфiкування i загнивання будуть каламутнiсть сироватки, поява в нiй пластiвцiв, плiвки на поверхнi кровi в пробiрцi i неприємний гнильний запах. Гемолiзована, iнфiкована кров, сироватка для постановки проб, визначення групи кровi i резусналежностi непридатна.

Для отримавня сироватки у хворого беруть 4-5 мл кровi у пробiрку без стабiлiзатора, на якiй тут же надписують прiзвище i iнiцiали хворого, групу його кровi i дату. Через 1-2 хвилини пробiрку з кров’ю сильно струшують для вiддiлення згустку вiд стiнок пробiрки або обводять його сухою скляною паличкою. Якщо необхiдно прискорити вiддiлення сироватки, пробiрку з кров’ю центрифугують 5-7 хв. при 2000-3000 об/хв. Пiсля ретракції згустка вiд нього вiддiляється сироватка, яка i служить для проб на сумiснiсть.

Кров донора для проведення проб отримують iз флакона пiсля того, як вiн пiдготовлений для переливання. Для цього кров, еритроцитну масу спускають через голку в невеликiй кiлькостi (5—10 крапель) на борт пластинки (тарiлки), на якiй буде проводитися проба.

Серологiчнi проби на сумiснiсть, як рiвно ж визначення групової належностi реципiєнта i донора повиннi проводитись не в випадковiй обстановцi, а за певним робочим столом (в лабораторiї, процедурнiй або операцiйнiй), обладнаним всiм необхiдним для проведення цих проб. Вiдсутнiсть у лiкувальному вiддiленнi робочого мiсця для iзосеролотiчних лабораторних дослiджень часто призводить до серйозних порушень методики i технiки проведения цих вiдповiдальних проб i до помилкового визначення результату. Важкi для хворого наслiдки, якi виникають на цьому грунтi, неминучі .

2. Проба на iндивiдуальну сумiснiсть за групами кровi системи АВО (проба на групову сумісність при кiмнатнiй температурi)

На бiлу поверхню (тарiлку, пластинку) пiпеткою нанося 2—3 краплi сироватки хворого iз пробiрки i з боку вiд них крапельку кровi донора, спiввiдношення кровi i сироватки 1:10. Краплi сироватки i кровi перемiшують сухою скляною паличкою, вiдтак тарiлку перiодично злегка похитують на протязi 5 хв. i одночасно спостерiгають результат реакцiї. Вiдсутнiсть аглютинацiї еритроцитiв донора (проба вiд’ємна) свiдчить про сумiснiсть кровi донора i реципієнта за групами кровi АВО. Поява аглютинації (проба додатня) вказує на їх несумiснiсть i недопустимiсть переливання даної кровi. Пробу треба проводити в добре освiтленiй кiмнатi при температурi примiщення в межах +15 +25°С. Аглютинацiя при несумісностi за групами кровi системи АВО наступає протягом першої хвилини. При низькому титрi групових антитiл в сироватцi крові хворого або при слабо вираженiй активностi аглютаногену А у донора (пiдгрупа А2) вона може наступити значно пiзнiше. Тому спостереження треба вести не менше 5 хвилин.

У рядi випадкiв при постановцi проби треба пам’ятати про можливiсть виникнення псевдоаглютинації, для усунення якої необхiдно пiсля закiвчення 5 хв. додати одну краплю фiзiологiчного розчину хлористого натрiю перемішати і продовжити спостереження ще 2 хвилини. Зникнення аглютинації пiсля добавлення фiзiологiчного розчину означає вiдсутнiсть її. Проба на групову сумiснiсть проводиться з кожним флаконом кровi, еритроцитної маси. Основні помилки при проведеннi проби: неправильне спiввідношення крапель, невикористання фізіологічного розчину, недотримання часу експозиції.

3.Проба на iндивідуальну сумiсність за резус-фактором (теплова проба на резус-сумiснiсть на водянiй банi)

На чашку Петрi (iз органiчного скла) наносять 2—3 каплi сироватки хворого i краплину кровi донора у спiввiдношеннi 10:1, їх змiшують скляною паличкою (крапля має бути достатньо велика i масивна). Для кращої оцiики проби краплю рекомендується помістити на предметне скло, мiж яким i чашкою кладуть кружок фiльтрувального бiлого папету. Чашку опускають плавати на водяну баню при температурi 46—48°С на 10 хвилин (для водяної банi використовують апарат «резус-1», при його вiдсутностi-каструлю об’емом не менше 2 літрів) [21].

Для зменшення випаровування сироватки (підсихання краплi!) чашку Петрі рекомендується накрити паперовим кружком. Через 10 хвилин чашку виймають i оцiнюють результат. Пробу необхiдно оцiнювати в першу хвилину після знiмання чашки з водяної банi, похитуючи предметне скло із краплею над бiлим фоном або над засвiченою лампочкою (при вiдсутностi фільтрувального паперу). Коли цi умови не виконуються, при остиганнi краплi може появитися неспецифiчна аглютинація. Інодi при пiдсиханнi краплi і випаданнi фiбрину на її повевхнi утворюсться плівка, яку необхiдно обережно зняти, зачептiвши за її край голкою для iн’єкцiї (зняти плівку, як знiмають кашкет).

Наявнiсть аглютинацiї (проба додатня) вказує частiше на резус-несумiснiсть кровi донора i реципiєнта або на несумiснiсть по ряду інших антигенiв еритроцитів, i переливати таку кров категорично забороняється. В першому випадку треба думати, що допущена помилка у вiдношеннi резус-належностi (хворий -резус -вiд’ємний), і у нього є резус-антитiла (хворий сенсибiлізований резус-антигеном), якi i викликали аглютинацiю резус-додатнiх, несумiсних для нього, еритроцитiв донора. Таким чином, ця проба дозволяє попередити ускладнення, зв’язанi з несумiснiстю за резус-фактором та iншими аглютиногенами кровi при сенсибілiзації хворого до цих факторiв. Індивiдуалъна проба на резус-сумiсність набуває особливо важливого практичного значення при наявностi у хворого обтяженого трансфузiйного анамнезу, а у жінок і акушерського анамнезу, бо ці анамнестичні дані, звичайно, виявляються у резус-вiд’ємних осiб, для яких особливо небезпечне переливання резус-додатньої крові.

Проба на резус-сумісність проводиться як при переливанні резус-додатньої кровi резус-додатньому хворому, так i резус-вiд’ємної крові резус-від’ємному хворому. Проба проводиться з кожним флаконом донорської крові, еритроцитної маси, відмитих еритроцитів. Проби на групову і резус-сумісність ні в якому разі не підмiняють одна одну, тому що виясняють сумісність по різних аглютиногенах і аглютинiнах, які проявляють себе при рiзних умовах. Тiльки проведення обох проб може своєчасно запобігти переливанню несумісної кровi.

Постановка проби на резус-сумісність може супроводжуватися в окремих випадках виникненням несправжньої додатньої реакцiї —псевдоаглютинації донорських еритроцитів в сироватцi реципієнта. Проте внесення фізiологiчного розчину не допустиме. Диференціювати в даному випадку справжню і псевдоаглютинацію можна тільки при розгляді під мікроскопом свіжоприготовленого мазка із краплi на чашцi Петрі ( при малому збiльшенні). При справжній аглютинації під мiкроскопом видно крупинки аглютинатів , якi нагадують шовковичні ягоди, або грона винограду. При виконанні проби на резус – сумісність іноді допускаються такі порушення: скорочення часу інкубації, неправильна пропорція сироватки і крові, низька температура водяної бані.

4. Бiологiчна проба

ЇЇ проводять безпосередньо після венепункції — переливають струминно по 10—15 мл крові (еритроцитної маси, відмитих еритроцитів, плазми) три рази з інтервалом в З хвилини. Для попередження згортання крові в голці під час трьоххвилинного інтервалу трансфузiю можна продовжити рідкими краплями (20 крапель на хвилину). Грубою помилкою є введення вказаних доз кровi не струминно, а кпапельно, бо при крапельному вливаннi можна перелити значно більшу кiлькiсть несумiсної крові без вираженої реакції з наступним розвитком посттрансфузійного шоку. Під час біологічної проби спостерігають за станом хворого (скарги, зовнішній вигляд, дихання , пульс). Відсутність клiнічних проявів реакції або ускладнення у хворого після трьохразової перевірки (біологічна проба вiд’ємна) дозволяє продовжити переливання решти трансфузійної рідини — крапельно або струминно- залежно від показань.

У випадку несумісної кровi поведінка хворого стає неспокійною, самопочуття його погіршується; появляються вiдчуття ознобу або жару у всъому тілі, здавлення в грудях. Хворий скаржиться на болі в поясниці, животі, голові. Пульс звичайно стає малим і частим, понижається артеріальний тиск. Дихання прискорюється, стає поверхневим. Шкіра лиця набуває цiанотично- червоного забарвлення, яке змiнюється блідістю. При виникненні якої-небудь із описаних ознак , переливання крові або її компонентів чи інших рідин повинно бути негайно припинене перетискуванням системи. Проводять необхідне лікування.


Розділ ІІ . Експериментальне дослідження.


2.1. Практичне дослідження резус-фактора


Наше дослідення проводилось на базі Рівненської обласної клінічної лікарні в відділення трансфузіології. Дослідження проводилось за даними карток амбулаторних хворих за період 2005-2007 років.


Розглянемо дані за 2005 рік згідно карток. Для кращої наочності доцільно буде згрупувати райони за напрямом розміщення.

Отже спочатку проаналізуємо північні райони та складемо таблицю.


Північні райони області

№
Район
 
 
Rh+-
%
Rh+-(%)

1
Дубровицький
Rh+
25
1
1,04
0,04

Rh-
7
0,3

2
Володимирецький
Rh+
135
 
5,61
 

Rh-
43
1,79

3
Зарічненський
Rh+
18
1
0,75
0,06

Rh-
7
0,29

4
Рокитніський
Rh+
32
2
1,33
0,08

Rh-
6
0,25

5
Сарненський
Rh+
104
2
4,3
0,08

Rh-
19
0,79


З даної таблиці ми можемо зробити висновок про те що у всіх переважає позитивний резус-фатор та у Сарненському і Володимирецькому районах спостерігається найбільша кількість пацієнтів з Rh+ , 104 та 135 відповідно.