Хронического эндотоксикоза
| Вид материала | Исследование |
- Задачи исследования: разработать новые хирургические технологии лечения хронического, 21.35kb.
- Диагностика и оперативное лечение хронического калькулезного холецистита и хронического, 231.98kb.
- Фундаментальна медицина практиці охорони здоров’я терапевтические подходы к лечению, 75.71kb.
- Значение показателей вязкости крови и мочи в комплексной диагностике степени тяжести, 490.41kb.
- Лечение хронического периодонтита с применением новой композиции «Коллапан-гель, 306.75kb.
- О. А. Возможности контроля за течением и эффективностью лечения хронического гепатита, 25.35kb.
- Лечение хронического урогенитального хламидиоза: сравнительный анализ применения нутрицевтиков, 965.76kb.
- На правах рукописи, 302.89kb.
- Комплексная терапия хронического алкоголизма, 140.82kb.
- В. Т. Ивашкин Современный взгляд на гепатоцеллюлярную карциному, 115.99kb.
На правах рукописи
Калашникова Светлана Александровна
гОРМОНАЛЬНАЯ
ДИЗРЕГУЛЯЦИЯ КАК КОМПОНЕНТ
ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОТОКСИКОЗА
(морфофункциональное исследование)
14.00.15 – патологическая анатомия
14.00.16 – патологическая физиология
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва - 2009
Работа выполнена в Государственном учреждении «Волгоградский
научный центр Российской академии медицинских наук
и Администрации Волгоградской области» и
Государственном образовательном учреждении высшего
профессионального образования «Волгоградский государственный
медицинский университет Федерального агентства
по здравоохранению и социальному развитию»
Научные консультанты:
ч
лен-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, Писарев Вячеслав Борисович
профессор
доктор медицинских наук, Новочадов Валерий Валерьевич
профессор
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, Туманов Владимир Павлович
профессор
доктор медицинских наук Филатов Владимир Васильевич
доктор медицинских наук, Яковлев Михаил Юрьевич
профессор
Ведущая организация: Государственное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека Российской академии медицинских наук»
Защита состоится «_28__» _сентября__________ 2009 года в __14.00 часов на заседании диссертационного Совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.
Автореферат разослан «_19_» мая_ 2009 года.
Ученый секретарь
диссертационного Совета, А.И. Щёголев
доктор медицинских наук,
профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность.
В последнее десятилетие в теоретической медицине и клинической практике выделено новое направление – нейроиммуноэндокринология [Акмаев И.Г., 2001, 2003; Гриневич В.В., 2003, 2007; Кветной И.М., с соавт., 2005; Кузнецов С.Л. с соавт., 2008; Zhang H. et al., 2003; Mosiienko H.P., 2007]. Благодаря новому интегрированному подходу к исследованию пато- и морфогенеза многих заболеваний, это направление позволило значительно расширить представления о природе ряда важнейших болезней и разработать ряд эффективных подходов к их диагностике и лечению [Крыжановский Г.Н. с соавт., 2004; Бобынцев И.И., Северьянова Л.А., 2005; Евсеев В.А., 2007; Cai Z. et al., 2007; Oertel Y.C., 2008].
В рамках комплексного исследования механизмов развития хронического эндотоксикоза (ЭТ), осуществлявшегося под руководством чл.-корр. РАМН В.Б. Писарева, ранее были установлены патогенетические моменты этого патологического процесса и его морфологические проявления [Новочадов В.В., Писарев, 2005; Писарев В.Б. с соавт., 2008; Зарипова И.В., 2008], метаболические особенности [Новочадов В.В., 2001; Марков Д.Е., 2004] и аспекты вегетативной дизрегуляции [Фролов В.И., 2004; Богачев А.А., 2005].
Основу хронического ЭТ составляет неконтролируемый перенос по организму эндогенных токсических соединений в весьма умеренных концентрациях, но в течение длительного времени с повреждением клеток-мишеней, органов и тканей и реакциями на него [Яковлев М.Ю., 2002, 2005; Мишнёв О.Д., с соавт., 2003; Гаджиева Х.К. с соавт., 2006; 3айратьянц О.В., Кaктypский Л.В., 2008; Sharshar T. et al., 2003; Yamaga J. et al., 2003].
В пато- и морфогенезе такого процесса современные исследования выделяют два взаимосвязанных между собой звена: собственно токсическое воздействие на эндотелий сосудов, клетки паренхиматозных органов и внеклеточный матрикс, где доминирует эндотоксиновая агрессия как результат увеличения количества ЛПС и нарушений антиэндотоксинового иммунитета [Яковлев М.Ю. с соавт., 2000, 2006; Аниховская И.А. с соавт., 2005] и цитокиновое - системный воспалительный ответ на эндогенную интоксикацию [Еськов А.П. с соавт., 2003; Гусев Е.Ю. с соавт., 2006].
Формирование подобного сложного патологического процесса немыслимо без развития нейроэндокринной дизрегуляция, в организме должны присутствовать ее признаки в виде гормонального дисбаланса и морфологических проявлений на уровне эндокринных органов и в точках приложения действия гормонов. Имеющиеся в литературе сведения о морфологии и функции органов эндокринной системы при остром ЭТ единичны и противоречивы [Востриков С.М. с соавт., 2004; Глумов В.Я., Филатов В.В., 2005; Висмонт Ф.И. с соавт., 2007; Touchette K.J., et al. 2002; Watanobe H. 2002; Wang Y., et al., 2000, 2004], а при хроническом процессе – практически отсутствуют [Денисов А.Г., 2005, 2008; Зайратьянц О.В., 2006; Полякова Л.В., 2008; Serdiuk S.E. et al., 2005; Cooper D.S., 2007]. С этих позиций, актуальным представляется комплексное исследование органов эндокринной системы при хроническом ЭТ в сопоставлении с маркерами эндогенной интоксикации, гормональным профилем и морфологическими изменениями в органах-мишенях эндогенной интоксикации.
Цель работы – установить закономерности морфологических изменений в органах эндокринной системы при хроническом эндотоксикозе и участия развивающиейся на этой основе гормональной дизрегуляции в его пато- и морфогенезе.
Задачи исследования.
1. Изучить основные патоморфологические изменения, развивающиеся в органах эндокринной системы при хроническом эндотоксикозе, выделить и охарактеризовать ведущие процессы, лежащие в их основе.
2. Установить структурные основы, последовательность и сравнительную выраженность патологии адреналовой, тиреоидной, гонадной эндокринных осей и паравентрикуло-инсулярного пути при хроническом эндотоксикозе.
3. Сопоставить морфологические изменения в органах-мишенях эндогенной интоксикации, особенности гормонального профиля и динамику интегральных показателей эндотоксикоза в периферической крови с выходом на математическое моделирование патологических изменений.
4. Выявить иммуногистохимическими методами распределение маркеров ФНО-зависимого апоптоза в отдельных железах внутренней секреции и определить роль этого процесса в механизмах устранения эндокриноцитов при хроническом эндотоксикозе.
5. Выявить распределение NOS-3 и определить роль эндотелиальной нитроксидсинтазы в сосудистом механизме повреждения эндокриноцитов и патологическом ремоделировании отдельных желез внутренней секреции при хроническом эндотоксикозе.
6. Показать стереотипные ультраструктурные изменения в эндокриноцитах различных желез внутренней секреции при развитии хронического эндотоксикоза и выявить особенности в зависимости от их принадлежности к различным регуляторным осям.
7. Оценить возможность уменьшения тяжести эндокринопатии и общих проявлений эндотоксикоза при введении экспериментальным животным эстрогенов или тиреостатиков.
Научная новизна.
Сформирована концепция об участии основных эндокринных органов в пато- и морфогенезе основных патологических изменений в печени и почках, а также участии выявленных гормональных сдвигов в развитии компенсаторных и приспособительных процессов в этих органах.
Впервые для объяснения механизмов и динамики развития хронического ЭТ, субстрата формирующейся полиорганной патологии, был применен подход, основанный на анализе характера и механизмов гормональной дизрегуляции. Показана роль мультигландулярной эндокринопатии в формировании недостаточности печени и почек при хроническом ЭТ.
С помощью современных методов морфологического исследования показано, что ФНО-зависимый апоптоз при хроническом ЭТ является одним из ведущих механизмов устранения эндокриноцитов в гипофизе, щитовидной железе и яичниках. Установлено, что в механизмах повреждения и гибели эндокриноцитов надпочечников, гонад и инсулярного аппарата при хроническом ЭТ существенную роль играет гиперэкспрессия эндотелиальной нитроксидсинтазы, опосредующая избыточную васкуляризацию желез внутренней секреции, хронический тканевой отек и повреждение сохранившихся эндокриноцитов, а также стромальную пролиферацию.
Сопоставление гормонального профиля и структурных изменений в гипоталамусе, гипофизе, щитовидной железе, инсулярном аппарате поджелудочной железы, надпочечниках, яичниках и семенниках в динамике хронического ЭТ позволило обосновать основные закономерности, очередность и сравнительную интенсивность разрушения основных гормональных осей при этом патологическом процессе.
Анализ ультраструктурных изменений в эндокриноцитах основных эндокринных органов при хроническом ЭТ подтвердил стереотипность внутриклеточных реакций на повреждение, а также выявил дополнительные признаки, зависящие от типа секреции, ангиоархитектоники железы и ее нагруженности при данной патологии.
Показано, что применение эстрогенов и тиреостатическая терапия способны корректировать гормональный дисбаланс и уменьшать выраженность эндогенной интоксикации и повреждения печени и почек при хроническом ЭТ.
Научно-практическая значимость.
Полученные данные расширяют современные представления о хроническом ЭТ с позиций вовлечения в его развитие механизмов эндокринной дисфункции. Они мотивируют врачей клинической практики на поиски скрытой эндокринной патологии у лиц с хроническими заболеваниями, сопровождающимися эндогенной интоксикацией. С другой стороны, на основании работы обосновывается поиск хронической эндогенной интоксикации в эндокринологии, как возможной причины заболевания.
Метод разделения эндокриноцитов по результатам радиальной морфометрии на классы (гиперфункционирующие, нормально функционирующие, с гипофункцией и истощенные) приемлем для любых исследований в области эндокринологии для скрининга направления и выраженности изменений под действием экзо- или эндогенных стимулов.
Ряд гормональных воздействий (введение эстрогенов, тиреостатиков) может быть использовано для модификации общепринятых моделей хронических токсин-индуцированных процессов с доказанной модуляцией ими развивающейся органопатологии в экспериментальной медицине.
Использование материалов работы при преподавании физиологии, патофизиологии, патологической анатомии и эндокринологии в высших учебных заведениях позволяет повысить качество подготовки современного врача.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Ключевыми патоморфологическими изменениями в органах эндокринной системы при хроническом эндотоксикозе являются мозаичное сочетание участков повреждения, гибели, атрофии и гипертрофии эндокриноцитов, сосудистых реакции и пролиферации стромы.
2. Степень повреждения эндокриноцитов при хроническом эндотоксикозе и характер компенсаторных процессов в конкретной железе зависит от ее исходного функционального состояния, вовлеченности в системные механизмы адаптации к токсическому процессу при общей тенденции к субкомпенсированной гипофункции и стромальной пролиферации с частичным замещением объема утраченных эндокриноцитов.
3. Результатом структурных изменений в органах эндокринной системы при хроническом эндотоксикозе является мультигландулярный гормональный дисбаланс, представляющий собой взаимосвязанную последовательность нарушений основных вертикальных эндокринных осей, внутриосевых взаимоотношений.
4. Классические вертикальные регуляторные эндокринные оси при развитии хронического эндотоксикоза повреждаются в различной степени: максимальная дизрегуляция, патология периферических желез и разрушение внутриосевых взаимоотношений свойственно гонадной оси, менее выраженная патология – тиреоидной оси и инсулярному пути, и минимальные изменения – адреналовой оси.
5. Существенное значение в механизмах устранения функционирующих эндокриноцитов желез внутренней секреции имеют ФНО-зависимый апоптоз и сосудистый механизм, опосредованный через эндотелиальную нитроксидсинтазу, которая экспрессируется в эндотелии сосудов этих желез.
6. Применение тиреостатиков и эстрогенов способно ослаблять уровень эндогенной интоксикации, и связанную с ним тяжесть патологии печени и почек при хроническом эндотоксикозе.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты исследования докладывались и обсуждались на II Общероссийской конференции «Проблемы морфологии» (Сочи, 2003); научной конференции «Новые технологии в медицине» (Волгоград, 2004); V Общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Кисловодск, 2004); V Российском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Казань, 2004); III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004); Всероссийском симпозиуме «Эндотоксикоз: природа, диагностика и принципы коррекции» (Волгоград, 2005); V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); II Всероссийской конференции «Клинико-морфологические аспекты эндокринопатий» (Белгород, 2006); VII общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Москва, 2006); II съезде Российского общества патологоанатомов (Москва, 2006); II Всероссийской конференции «Новые информационные технологии в медицине» (Волгоград, 2007); международной конференции «Структурные преобразования органов и тканей в норме и при воздействии антропогенных факторов» (Астрахань, 2007); IX Международном конгрессе Ассоциаций морфологов (Бухара, 2008); Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика Д.А. Жданова (Москва, 2008).
Апробация работы осуществлена на расширенном заседании сотрудников отдела общей и экспериментальной патологии Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области, кафедр патологической анатомии и патологической физиологии Волгоградского государственного медицинского университета 20 октября 2008 года. По теме диссертации опубликовано 49 научных работ, в том числе 14 публикаций в журналах, действующего «Перечня … ВАК».
Внедрение результатов работы.
Материалы диссертации внедрены в учебный процесс кафедр факультетской терапии, патологической анатомии, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета, кафедры семейной медицины Ульяновского государственного университета. Практические рекомендации используются в работе ГУ «Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области», Волгоградского областного патологоанатомического бюро, ГУЗ «Волгоградское областное бюро СМЭ», Областном онкологическом центре Ульяновской области.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 305 страницах машинописного текста, содержит 87 таблиц, иллюстрирована 59 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, главы собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Список литературы содержит 334 источника (211 на русском и 123 – на иностранных языках).
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа носила экспериментальный характер и была выполнена с использованием 141 белых нелинейных крыс обоего пола (в том числе 21 – контрольные группы различных серий опытов). Протокол экспериментов составлен в соответствии с действующими нормативными документами в области биоэтики и правил лабораторной практики, программа экспериментов была согласована с Локальным независимым этическим комитетом по этической экспертизе диссертационных исследований (протокол № 18-2006 от 20 ноября 2006 года).
Использовали две модели хронического ЭТ: у 36 крыс с преимущественным поражением печени [Писарев В.Б. с соавт., 2002], у 36 - с преимущественным поражением почек [Новочадов В.В., Писарев В.Б., 2005]. Токсический гепатит и нефропатия в сочетании с печеночной и почечной недостаточностью воспроизводятся в этих моделях к 30 сут эксперимента, а к 90 сут удается воспроизводить более выраженные нарушения, связанные с формированием цирроза печени и нефросклероза.
Отдельная часть исследования была посвящена проведению патогенетической терапии, направленной на уменьшение тяжести хронического ЭТ путем целенаправленного изменения гормонального дисбаланса. Коррекция тиреостатическими препаратами осуществлялась с помощью препарата Тиамазол per os 24 крысам-самцам в дозе 20 мг/кг/сут в течение 5 дней и поддерживающей дозой 10 мг/кг массы животного 1 раз в 7 дней [Centero B.A., et al., 1996]. Гиперэстрогенемию вызывали 24 крысам-самкам путем внутримышечного введения 0,1% масляного раствора Эстрадиола из расчета 50 мкг/кг/сут в течение 7 дней с поддерживающей дозой 50 мг/кг массы животного 1 раз в 5 дней [Дедов И.И., с соавт., 2002.]
Морфологическим доказательством наличия хронического ЭТ являлись признаки прогрессирующего повреждения печени и почек с развитием в них компенсаторных процессов: хронического гепатита/гепато-фиброза и дисметаболической нефропатии/нефросклероза.
В качестве лабораторно-биохимических показателей ЭТ в плазме крови крыс определяли вещества средней молекулярной массы (ВСММ), олигопептидов [Малахова М.Я., 1995] и концентрацию продукта свободнорадикального окисления липидов - малонового диальдегида (МДА). В гомогенатах печени и почек определяли активность ацилазы, как маркера токсического повреждения [Фролов В.И. с соавт., 1991]. Эти исследования подтвердили, что во всех случаях у крыс развивалась хроническая эндогенная интоксикация (табл. 1).
Таблица 1
Биохимические показатели выраженности хронического ЭТ у крыс-самцов
(на примере модели с преимущественным поражением печени, M±m)
| Показатели | Контрольная группа | Сроки эксперимента | ||
| 30 сут | 60 сут | 90 сут | ||
| ВСММ, усл. ед. Олигопептиды, мг/л МДА, ммоль/л Ацилаза печени, мккат/г белка Ацилаза почек, мккат/г белка | 0,16± 0,02 115,5 ± 13,8 5,33 ± 0,43 27,91 ± 1,93 35,61 ± 2,90 | 0,43 ± 0,05* 268,5 ± 29,8* 11,40 ± 0,94* 9,06 ± 0,87* 35,61 ± 2,90 | 0,49± 0,05* 289,4 ± 30,5* 10,53 ± 1,25* 7,58 ± 0,73* 18,21 ± 1,78* | 0,51 ± 0,06* 291,0 ± 36,4* 11,08 ± 1,35* 5,97 ± 0,68* 13,61 ± 1,45* |
Примечание. *Р<0,05 по сравнению с крысами контрольной группы
Поскольку течение и исход различных патологических процессов во многом определяются уровнем реактивности организма [Крыжановский Г.Н., 2001, 2004; Акмаев Г.Н., 2003], которая существенно зависит от пола, в сериях по исследованияю гонадной показатели развития хронического ЭТ раздельно проанализированы для крыс-самцов и самок. В последующем при сопоставлениях они выражались в процеснтах от соответствующих исходных величин.
Подготовку материала для патоморфологического исследования эндокринных органов - паравентрикулярного ядра гипоталамуса (PV), гипофиза, щитовидной железы (ЩЖ), надпочечников, яичников/семенников, поджелудочной железы проводили с помощью общепринятых методик [Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996; Коржевский Д.Э., 2005].
Для прямого морфометрического исследования был использован компьютерный комплекс «Видеотест-Морфо» (Россия). Подсчитывали численную плотность и объемные доли (ОД) отдельных структур, показатели размеров и их соотношения [Автандилов Г.Г., 2002].
Степень повреждения эндокриноцитов оценивали по соотношению неизмененных клеток, эндокриноцитов, находящихся в состоянии повышенной функциональной секреции, крайнего истощения, повреждения или некроза (свыше 1000 клеток на одну железу). Результаты дополняли с помощью оригинального метода радиальной морфометрии, разработанного в Волгоградском научном центре РАМН [Новочадов В.В., 2005]. Он реализован в виде программного приложения «Radiana», позволяющий представить распределение яркости в радиальном и секторальном направлениях в единицах RGB виде матрицы данных MS Excel с расчетом коэффициентов этой функции.
Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием наборов антител фирмы «Novocactra Laboratories Ltd» (Великобритания);
- TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand, клон 27В12),
- каспаза-3 (Caspase-3, клон JHM62);
- эндотелиальная нитроксидсинтаза (NOS-3, клон RN5).
Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода. По степени экспрессии клетки относили к одному из классов: негативные, слабопозитивные, позитивные и гиперэкспрессирующие с выражением доли каждого класса в процентах [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004].
Для проведения ультрамикроскопического исследования животных подвергли эвтаназии путем внутривенной инфузии 4%-ного раствора параформа на 0,1 М какодилатном буфере (суправитальной фиксации) под нембуталовым наркозом. Дофиксацию производили в 4%-ном растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в 1%-ном растворе тетраокиси осмия на 0,1М какодилатном буфере (pH=7,4). Материал заливали в смесь эпона и аралдита, ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме LKB-8800. После контрастирования в 2,5%-ном растворе уранилацетата в течение 40 минут и 0,3%-ном растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронных микроскопе Tesla BS-500 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Фотодокументирование производили с использованием фотопленок «ФТ-40».
Для оценки функционального состояния органов эндокринной системы при хроническом ЭТ были определены концентрации гормонов в сыворотке крови с учетом наличия определенных эндокринных осей:
- адреналовой оси: АКТГ – кортизол.
- тиреоидной: ТТГ – Т3 и Т4 (общий и свободный), тиреоглобулин.
- гонадной: ФСГ, ЛГ, пролактин - тестостерон, эстрадиол, прогестерон.
- паравентрикуло-инсулярного пути: инсулин.
Исследование проводили методом ELISA с использованием спектрофотометра Stat Fax 2100 и вошера Stat Fax 2600 (AWARENESS Technology, USA) c помощью тест-систем «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия) и «DRG» (Germany).
Статистическая обработка проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами с помощью программных пакетов EXCEL 7.0 (Microsoft, USA) и АРКАДА (Диалог-МГУ, Россия). При регрессионном анализе выявлены наиболее значимые показатели, определение которых целесообразно для оценки влияния эндокринной дизрегуляции на выраженность изменений в данном органе при ЭТ [Платонов А.Е., 2000; Петри А., Сабин К., 2003; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005].