Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 15 генетика

Вид материала

Документы

Содержание Конструирование бациллярных штаммов с клонированным геном синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба B. anthracis В. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis Перспективы практического использования рекомбинантных бациллярных штаммов и синтезируемых ими иммуногенных антигенов B. anthracis Стиdтпа-1; 4,6  10 Стиdтпа-1 - 100,0 B. anthracis

Подобный материал:

• Рабочая программа дисциплины «промышленная микробиология и биотехнология» Код дисциплины, 235.83kb.
• Методика эутоназии опытных животных 71 Изучение сравнительной иммунологической эффективности, 172.42kb.
• 11 клас Биология, 13.71kb.
• Рабочая программа генетика Код дисциплины по учебному плану опд ф. 6 для студентов, 274.5kb.
• Барыкина ольга серафимовна, 40.14kb.
• Задачи селекции : повышение урожайности сортов культурных растений, увеличение продуктивности, 105.58kb.
• Генетика Генетика, 18.18kb.
• Темы: общая генетика, генетика человека, медицинская генетика. Вопросы для самоподготовки., 39.67kb.
• Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза 03. 00., 750.11kb.
• Примерная программа дисциплины микробиология, вирусология, микробиология полости рта, 447.35kb.

Конструирование бациллярных штаммов с клонированным геном синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба

В создании вакцин нового поколения приоритет отдается рекомбинантным технологиям. Генетическое конструирование позволяет манипулировать детерминантами синтеза и регуляции факторов иммуногенности и патогенности микроорганизмов, оказывая опосредованное действие на те или иные звенья иммуно- и патогенезов. Трудности возникают на пути обеспечения выраженной экспрессии клонированных генов и стабильности воспроизведения чужеродной генетической информации.

В успешном конструировании безопасных продуцентов иммуногенных антигенов немаловажную роль играет выбор реципиентной культуры и векторной плазмиды. На наш взгляд, для клонирования гена pag оптимальными системами являются протеазодефицитные бациллярные штаммы. Исходя из перспектив использования рекомбинантных штаммов для промышленного производства ПА, поиск реципиентов остановили на генетически охарактеризованном штамме близкородственного бактериального вида - B. subtilis WB600, и бесплазмидных производных вакцинных штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. В качестве вектора, способного стабильно функционировать в составе бациллярных штаммов, решили использовать плазмиду pUB110, характеризующуюся мультикопийностью, небольшим размером и наличием надежного селективного маркера.

Выделенную из штамма B. anthracis Sterne 34F₂ плазмиду pXO1 обработали ферментом BamHI. Образовавшиеся рестрикты, размером от 4 до 25 т.п.н., разделили электрофоретически. Присутствующий среди фрагментов ДНК участок (6 т.п.н), содержащий ген pag (Vodkin M., Leppla S., 1983), элюировали из агарозного геля и лигировали с векторной плазмидой pUB110. Лигированный материал передали при помощи электростимулируемой трансформации в реципиентные клетки B. anthracis СТИT. Антибиотикорезистентные клоны селектировали на среде с сибиреязвенным -глобулином. Для трансформантов с положительной реакцией диффузионной преципитации изучали белковый состав культуральных фильтратов и плазмидные профили выделенных ДНК. После нескольких пассажей в селективных условиях был отобран клон, стабильно наследующий гибридный репликон. Рестрикционный анализ сконструированной плазмиды pUB110PA (~10,5 т.п.н.) показал ее соответствие теоретически возможному варианту включения фрагмента pXO1 в вектор pUB110 (рис. 4). По данным белкового электрофореза и реакции преципитации на среде с сибиреязвенным -глобулином рекомбинантный штамм B. anthracis СТИTПА продуцировал основной иммуноген сибиреязвенного микроба на уровне вакцинной культуры B. anthracis СТИ-1. Прецеденты создания более эффективных рекомбинантных штаммов-продуцентов ПА (Ivins B., Welkos S., 1986; Cohen S. et al., 2000) предопределили продолжение экспериментов.

Как известно, в процессе трансформации бациллярных штаммов с высокой частотой образуются делеционные производные гибридных молекул ввиду особенностей механизмов проникновения экзогенных молекул ДНК в компетентные клетки бацилл (Щелкунов С.Н., 1994; Hahn J., Dubnau D., 1985). Вероятно, с подобными рекомбинационными событиями мы столкнулись, пытаясь переклонировать фрагмент, несущий ген pag. Векторную плазмиду, стратегию клонирования и реципиентный штамм использовали те же, что и в первом случае. Однако при осуществлении селекции на среде с -глобулином были обнаружено несколько клонов, дающих необычно большие зоны диффузионной преципитации – почти в 10 раз превышающие значения, установленные для штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis СТИTПА. Интересно, что только часть селектированных трансформантов активно синтезировала ПА. Совершенно неожиданно среди изолированных рекомбинантов с большими зонами преципитации выявили клоны, продуцирующие белок S-слоя - Sap. Напомним, что реципиентный штамм не экскретировал Sap.



Рисунок 4. Схемы получения гибридных плазмид pUB110РА и pUB110РА 1. Стрелками обозначено начало и направление транскрипции гена pag.


Детерминация синтеза белков S-слоя осуществляется хромосомными генами, а регуляция - локализованными на pXO1 областями atxA и pagR. Возможно, в нашем случае в процессе клонирования произошли рекомбинации, затронувшие область негативной регуляции генов pag и sap - pagR область, находящуюся в непосредственной близости от структурного гена pagА (Hoffmaster A., Koehler T., 1999(а); Mignot T. et al., 2003). В то же время, восстановление способности к экскреции белка S-слоя у части трансформантов свидетельствует об интактности гена sap в штамме В. anthracis СТИТ и вовлеченности в мутационный процесс структур, отвечающих за секрецию антигена.

Определяя электрофоретическую подвижность гибридных ДНК, обнаружили репликон, размером 6,5 т.п.н., что на 4 т.п.н. меньше ожидаемого значения (рис. 4). Рестрикционный анализ ДНК плазмиды, обозначенной как pUB110PA 1, выявил протяженную делецию, распространяющуюся на нуклеотидные последовательности pUB110 и, возможно, область pagR. Наличие клонированного гена подвердили, осуществив ПЦР с праймерами на последовательности детерминанты синтеза ПА. Положительными следствиями произошедшей в pUB110PA 1 делеции стали, с одной стороны – стабильное функционирование генетической конструкции в составе клеток B. anthracis, с другой - высокий уровень продукции ПА штаммом В. anthracis СТИТПА-1, содержащим pUB110PA 1.

Успешный опыт воспроизвели на других реципиентах. Гибридный репликон pUB110PA-1 выделили из штамма В. anthracis СТИТПА-1 и электростимулируемой трансформацией передали в штаммы В. anthracis 55ТPrt^- и В. subtilis WB600. Изолированные трансформанты по результатам проведенного тестирования содержали плазмиду pUB110PA-1 и локализованный в ее составе ген pag. Клонированный ген хорошо экспрессировался в бациллярных клетках.

При помощи биохимических (белковый электрофорез концентрированных культуральных фильтратов) и иммунохимических (реакция радиальной диффузной преципитации, иммуноблот, дот-анализ и твердофазный ИФА) методов исследования осуществили сравнительную оценку секреции ПА рекомбинантными штаммами и вакцинными культурами. Необходимые для иммунохимических реакций анти-ПА антитела получали из сывороток кроликов, иммунизированных очищенным препаратом ПА, выделенным из штамма B. antracis СТИDТПА-1. В результате проведенных исследований все генно-инженерные конструкции, вне зависимости от реципиентной основы, обладали одинаково высоким уровнем продукции ПА. В этой связи, необходимо вспомнить, что в эксперимент были взяты только реципиенты с низкой активностью протеолитических ферментов. На основании данных дот-анализа установлено, что продукция ПА штаммами B. anthracis СТИТПА-1 и B. anthracis 55ТПА-1 в 10 и 6 раз превышала его секрецию клетками соответствующих вакцинных культур - B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. С помощью ИФА определены количественные показатели продукции ПА: 80 - 90 мкг/мл – для рекомбинантов, и 15 - 20 мкг/мл – для вакцин. Высокая продукция ПА рекомбинантными штаммами с pUB110PA-1, вероятнее всего является следствием увеличения числа копий гена pag за счет мультикопийности вектора, а также делеции в pagR области, отвечающей за негативную регуляцию синтеза ПА.

Для сконструированных штаммов B. anthracis СТИDТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 изучали стабильность репликации гибридной плазмиды in vitro и in vivo. Многократное пассирование культур рекомбинантных штаммов в присутствии селективного антибиотика не приводило к утрате репликона pUB110PA 1. В отсутствие селективного давления у всех штаммов отмечали постепенное нарастание темпов элиминации гибридной плазмиды после третьего суточного пассажа. После трехкратных пассажей рекомбинантных культур in vivo все исследованные культуры содержали плазмиду pUB110PA-1. Стабильность гибридного репликона, на наш взгляд, обеспечена правильным выбором вектора pUB110 и делецией сравнительно большой части нуклеотидных последовательностей в результате рекомбинационных изменений.

Совокупность свойств созданных штаммов B. anthracis СТИDТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 обуславливает их перспективность в качестве рекомбинантных продуцентов ПА сибиреязвенного микроба. Они могут быть использованы как для лабораторного, так и промышленного получения ПА, так как обладают высоким уровнем продукции ПА, низкой активностью протеолитических ферментов и стабильны при пассировании in vitro и in vivo. По сравнению с вакцинными штаммами B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55 рекомбинантные культуры секретируют в 5 раз больше иммуногенного антигена.

В соответствии с современной концепцией технология производства химических сибиреязвенных вакцин должна не только отвечать требованиям биологической безопасности, но и быть экологичной. Имея в виду данное обстоятельство, на следующем этапе исследования поставили задачу создания рекомбинантного продуцента ПА, промышленное и лабораторное культивирование которого не будет сопряжено с риском контаминации помещений и оборудования спорами возбудителя сибирской язвы, чрезвычайно устойчивых к действию факторов внешней среды и дезинфицирующих агентов.

С целью конструирования стабильного аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis с высоким уровнем продукции ПА и низкой активностью протеолитических ферментов, осуществили генетическую передачу гибридной плазмиды pUB110PA-1 в аспорогенный протеазодефицитный бесплазмидный реципиентный штамм B. anthracis 55DТPrt^-Spo^-. Исследование изолированных антибиотикорезистентных трансформантов на наличие рекомбинантного репликона pUB110PA-1, клонированного гена pag и активность протеолитических ферментов во всех случаях дало ожидаемые результаты. В процессе изучения стабильности трансформантов было отобрано три клона, сохраняющих гибридную плазмиду в селективных условиях и в течение нескольких пассажей (не более 3-х суток) на средах без антибиотика.

Сравнительную оценку уровней продукции ПА аспорогенными трансформантами проводили с помощью белкового электрофореза концентрированных препаратов культуральных фильтратов, реакции радиальной диффузной преципитации и дот-анализа с анителами к ПА. По результатам всех тестов Spo^- рекомбинанты секретировали больше ПА, чем исходный штамм B. anthracis 55. Один из клонов по уровню продукции ПА соответствовал спорообразующим генно-инженерным штаммам. На основании данных твердофазного ИФА клетки B. anthracis 55DТПА-1(Spo^-) экскретировали около 80 мкг/мл ПА.

На модели данного штамма оптимизировали технологию выделения и очистки рекомбинантного ПА. Прежде всего, внесли некоторые коррекции в процесс культивирования. В исследовательских целях штамм B. anthracis 55DТПА-1(Spo^-) выращивали на богатой питательной среде (S-бульоне) в атмосфере с повышенным содержанием СО₂, то есть, моделируя условия секреции ПА in vivo. Для промышленных масштабов среда с высоким содержанием дорогостоящих фирменных компонентов - триптона и дрожжевого экстракта, слишком затратна. В качестве альтернативы S-бульону предложен бульон Хоттингера с добавлением дрожжевого аутолизата. Наиболее важным оказалось наблюдение, что в отличие от культур, содержащих pXO1, продукция ПА рекомбинантными штаммами с pUB110PA-1 (в том числе и аспорогенным) не зависит от СО₂, ввиду отсутствия у них области, детерминирующей синез СО₂ - зависимого транскрипционного регулятора – AtxA (Koehler T. et al., 1994; Hoffmaster A., Koehler T.,1997; Mignot T. et al., 2003).

Выделение ПА осуществляли из 24 часовой бульонной культуры B. anthracis 55ΔТПА-1(Spo^-), выращенной с аэрацией при температуре 37 ⁰С. Культуральный фильтрат очищали при помощи ионообменой хроматографии на Macro Prep 50Q, и гель-фильтрации с использованием Sephacryl-HR300 (рис.5). В результате удалось достичь почти полного освобождения образца от сопутствующих примесей. Специфичность выделенного белка подтверждали постановкой реакции иммуноблота с антителами к ПА. Выход составил 12,8 мг препарата ПА на 1 литр культуры аспорогенного рекомбинатного штамма.

Получение высокоочищенного препарата ПА, не содержащего сопутствующих антигенов сибиреязвенного микроба, является важным шагом на пути конструирования профилактических и диагностических сибиреязвенных препаратов, отвечающих современным требованиям.



Рисунок 5. Результаты хроматографической очистки ПА, выделенного из культурального фильтрата аспорогенного продуцента B. anthracis 55ΔТПА-1Spo^-. Треки: 1 – культуральный фильтрат B. anthracis 55ΔТПА-1Spo^-; 2 – этап очистки на Macro Prep 50Q; 3 - маркеры молекулярных масс (116,0; 97,0; 66,0; 45,0; 29,0 кДа); 4 - 11 – этап хроматографии на колонке с Sephacryl-HR300.


Перспективы практического использования рекомбинантных бациллярных штаммов и синтезируемых ими иммуногенных антигенов

В задачи заключительного раздела исследования входило изучение биологических свойств рекомбинантного ПА. Оценку протективной активности генно-инженерных штаммов проводили с использованием различных биомоделей. Иммунизацию осуществляли однократно, подкожно. Иммунизирующая доза тестируемых штаммов для мышей линии BALB/с составила 3  10⁷ спор, морских свинок - 5  10⁷. Через 21 день опытных и интактных животных заражали тест-штаммом B. anthracis 2-ая вакцина Ценковского в возрастающих дозах.

На модели мышей линии BALB/с тестировали культуры B. anthracis СТИDТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 в сравнении с вакцинными препаратами B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. В поствакцинальный период пало 50 % линейных мышей, иммунизированных штаммом B. anthracis 55. Препарат B. anthracis СТИ-1 в иммунизирующей дозе вызвал развитие летального процесса у одной особи. Рекомбинантные штаммы не обладали остаточной вирулентностью. Ввиду превышения допустимого порога летальности при иммунизации, индекс иммунитета и ЛД₅₀ для штамма B. anthracis 55 не определяли. Значение ЛД₅₀ тест-штамма для интактных мышей составило 6,8  10³ спор, а для мышей, иммунизированных рекомбинантными культурами - почти на два порядка выше - 6,8  10⁵ спор - для B. anthracis СТИDТПА-1; 4,6  10⁵ - для В. subtilis WB600ПА-1; и 3,2  10⁵ спор - для В. anthracis 55ТПА-1. Тот же показатель ЛД₅₀ для контрольного штамма B. anthracis СТИ-1 оказался сопоставимым со значениями, установленными для рекомбинантов - 8,6  10⁵ спор тест-штамма. Соответственно, индексы иммунитета распределились в следующем порядке: для B. anthracis СТИ-1 - 125,9; B. anthracis СТИDТПА-1 - 100,0; В. subtilis WB600ПА-1 - 68,1; для В. anthracis 55ТПА-1 - 46,4.

На модели морских свинок изучали протективную активность штаммов B. anthracis СТИDТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 в сравнении с вакциной B. anthracis СТИ-1. В поствакцинальный период от иммунизирующей дозы штамма B. anthracis СТИ-1 пало семь животных из двадцати взятых в эксперимент (35 %). Летальности лабораторных животных, иммунизированных рекомбинантными штаммами, отмечено не было. Для интактных животных значение ЛД₅₀ тест-штамма составило 1,3  10³ спор. Для морских свинок, иммунизированных штаммами B. anthracis СТИDТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1, этот показатель оказался на 4 порядка выше - 3,2  10⁷ спор. Вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1 обеспечивал более эффективную защиту морских свинок - ЛД₅₀ тест-штамма - 2  10⁸ спор. Индекс иммунитета коммерческой вакцины составил 158480. Индексы иммунитета штаммов B. anthracis СТИDТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 оказались одинаковыми - 25117, при требовании не менее 20000 для культуры, претендующей на роль сибиреязвенной вакцины. С одной стороны, различие в значениях индексов иммунитета рекомбинантов и контрольного штамма объяснимо техническими особенностями подготовки спор в лабораторных и промышленных условиях. С другой, оно может являться следствием отсутствия у генно-инженерных штаммов детерминант, обуславливающих cинтез ОФ и ЛФ (Pezard C. et al., 1995).

Для подтверждения способности рекомбинантных штаммов вызывать иммунологическую перестройку в организме иммунизированных животных, определяли динамику титра антител. В иммуноферментном анализе исследовали сыворотки крови, взятые на 24-е, 28-е, 32-е и 36-е сутки после введения им дозы 5  10⁷ спор тестируемых штаммов B. anthracis СТИΔТПА-1 и B. anthracis СТИ-1. Кроме того, исследовали напряженность иммунитета через два, три, три с половиной и четыре месяца от начала эксперимента. Проанализировав данные, полученные для двух групп животных (по три особи на штамм), выявили следующие закономерности. Титры анти-ПА антител у морских свинок, иммунизированных штаммом B. anthracis СТИΔТПА-1, в среднем были выше, чем у биомоделей вакцинированных B. anthracis СТИ-1. В случае рекомбинантного штамма B. anthracis СТИΔТПА-1 титр антител к ПА нарастал к 36-му дню. В случае B. anthracis СТИ-1 максимальный титр отмечали на 32-е сутки, к 36-му дню происходило некоторое его уменьшение. Начиная с 2 месяцев после иммунизации, титры анти-ПА антител в обеих группах постепенно снижались до средних значений 1:1024 - для вакцинного штамма, и 1:512 – для рекомбинантного. В таком соотношении они оставались до конца 4-го месяца наблюдения.

Все вышеиложенное свидетельствует о высокой иммунологической эффективности сконструированных штаммов. Рекомбинантные штаммы выгодно отличаются от контрольных вакцинных препаратов, ввиду отсутствия у них остаточной вирулентности в отношении использованных в экспериментах биомоделей. На основании сравнения индексов иммунитета, первенство в обеспечении защиты лабораторных животных принадлежит штамму B. anthracis СТИΔТПА-1. На наш взгляд, его «родословная» в сочетании с приобретенными в результате генетического конструирования преимуществами являются основанием расценивать данный рекомбинантный штамм как прототип эффективной и безопасной сибиреязвенной вакцины.

Помимо определения иммуногенных свойств рекомбинантных штаммов изучали протективную активность белкового препарата ПА, выделенного из аспорогенного продуцента B. anthracis 55ΔТПА-1(Spo^-). Лабораторных животных (кроликов) иммунизировали очищенными сибиреязвенными антигенами – ПА и ЕА1, в сочетании с полным адьювантом Фрейнда. Белок S-слоя ЕА1 добавляли в некоторых случаях к ПА, исходя из его иммуногенногенного и иммуномоделирующего действия. Инъекции осуществляли парентерально, двукратно с интервалом в 14 дней. Кроликам первой группы вводили по 50 мкг ПА, второй - по 50 мкг каждого из белков - ПА и ЕА1, третьей - 5 · 10⁷ спор штамма B. anthracis СТИ 1 (однократно). Контрольную группу оставляли интактной. В конце поствакцинального периода определяли титры антител к ПА в сыворотках крови иммунизированных животных. Результаты иммуноферментного анализа свидетельствовали о формировании напряженного иммунитета во всех случаях. Выявлены более высокие титры анти-ПА антител у кроликов, иммунизированных белковыми препаратами. Через 21 день после последней инъекции животных заражали 50 ЛД₅₀ высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1. Все интактные особи пали от сибиреязвенной инфекции на третьи сутки. Кролики, иммунизированные ПА или ПА + ЕА1, а также споровой взвесью вакцинного штамма - выжили. Признаков заболевания не отмечали ни в одном из случаев.

Способность рекомбинантного ПА в сравнительно небольшой дозировке обеспечивать защиту 100 % биомоделей от заражения вирулентным штаммом B. anthracis предопределяет главное направление его практического использования – создание средств специфической профилактики сибирской язвы. Высокоочищенный белковый препарат с ярко выраженными протективными свойствами по праву претендует на роль основного компонента современной химической вакцины. Существенный уровень защиты лабораторных животных при одновременном введении ПА и белка S-слоя является серьезным поводом для продолжения работ по совершенствованию рецептуры сибиреязвенной вакцины.

Таким образом, проведенные нами исследования заложили прочный фундамент в успешное решение актуальной задачи получения эффективных и ареактогенных сибиреязвенных вакцин, соответствующих реалиям и возможностям 21-го века.

Преимущества использования генно-инженерных продуцентов заключаются в безопасных и экологичных технологиях получения ПА сибиреязвенного микроба. На основе очищенного рекомбинантного иммуногенного антигена возможно создание менее реактогенных химических вакцин. Сконструированный штамм B. anthracis СТИDТПА-1 является оптимальной моделью для улучшенной живой сибиреязвенной вакцины. Экономический эффект от внедрения соответствующих профилактических препаратов будет связан с повышением эффективности вакцинации против сибирской язвы и снижением частоты возникновения побочных реакций.


Выводы

1. С учетом фундаментальных знаний о факторах патогенности и иммуногенности возбудителя сибирской язвы и применением рекомбинантных технологий разработаны экспериментальные основы для решения проблемы совершенствования сибиреязвенных вакцин. Многокомпонентная система включает: коллекцию реципиентных штаммов B. anthracis для генетического конструирования, представленную бесплазмидными производными с низкой активностью протеолитических ферментов, нарушением экскреции белка Sap и отсутствием способности к образованию спор; высокоиммуногенные и низкореактогенные генно-инженерные бациллярные штаммы; спорообразующие и аспорогенные рекомбинантные продуценты протективного антигена; высокоочищенные препараты протективного антигена и белков S-слоя сибиреязвенного микроба.
   
2. На основе протеазодефицитных бесплазмидных производных бациллярных штаммов созданы генно-инженерные продуценты - B. anthracis СТИDТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1, по уровню синтеза протективного антигена (80 - 90 мкг/мл) пятикратно превосходящие вакцинные культуры B. anthracis СТИ 1 и B. anthracis 55. Рекомбинантные штаммы содержат структурный ген pag в составе гибридного репликона pUB110PA-1 (6,5 т.п.н.) и стабильно сохраняют биологические свойства при пассировании in vitro и in vivo.
   
3. Сконструированные генно-инженерные штаммы обладают высокой иммунологической эффективностью: в иммунизирующей дозе (3  10⁷ спор) они обеспечивают защиту мышей линии BALB/с от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы. Однократная иммунизация морских свинок дозой 5  10⁷ спор штаммов B. anthracis СТИDТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к протективному антигену. Штаммы с клонированным геном pag не обладают остаточной вирулентностью для мышей линии BALB/с и морских свинок, в отличие от вакцинных культур B. anthracis 55 и B. anthracis СТИ-1. Созданный на основе B. anthracis СТИ-1 штамм B. anthracis СТИDТПА-1 является прототипом менее реактогенной живой сибиреязвенной вакцины.
   
4. Для создания безопасных и экологичных технологий производства сибиреязвенных профилактических и диагностических препаратов сконструирован аспорогенный рекомбинантный авирулентный продуцент протективного антигена - B. anthracis 55DТПА-1(Spo^-). Штамм стабильно наследует гибридный репликон pUB110PA-1, не реверсирует к спорообразующему фенотипу и характеризуется низкой активностью протеолитических ферментов. Уровень продукции ПА аспорогенным рекомбинантом составляет около 80 мкг/мл.
   
5. Оптимизирована экспериментальная схема выделения и очистки протективного антигена, синтезируемого генно-инженерными продуцентами. Из аспорогенного штамма B. anthracis 55DТПА-1(Spo^-) получен препарат протективного антигена, перспективный в качестве основного компонента химической сибиреязвенной вакцины. Двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного протективного антигена обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД₅₀ высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1.
   
6. Бесплазмидные производные штаммов B. anthracis при культивировании in vitro различаются по способности к экскреции белка S-слоя - Sap. Получены экспериментальные доказательства нарушения продукции Sap у штамма B. anthracis СТИT. В качестве источников белка Sap предложены протеазонегативные штаммы B. anthracis SterneTPrt^- и 2^ая вакцина Ценковского pf Prt^-. На основании изучения протективных свойств очищенных препаратов белков S-слоя и изогенных Sap⁺ и Sap^- штаммов B. anthracis установлено, что белки Sap и ЕА1 являются дополнительными иммуногенными факторами сибиреязвенного микроба при определяющей роли протективного антигена.
   
7. Получены высокоочищенные препараты белков S-слоя сибиреязвенного микроба – Sap и ЕА1. Протеины идентифицированы как компоненты S-слоя B. anthracis на основании молекулярных масс, выявленной паракристаллической ультраструктуры, особенностей аминокислотного состава, иммунореактивности и локализации на поверхности клетки.
   
8. На основании результатов экспериментов по моделированию вирулентности установлено, что спонтанные или индуцированные Spo^- мутации в штаммах B. anthracis приводят к снижению на 1 - 3 порядка степени их патогенности для белых мышей. Выяснено отсутствие влияния экспрессии хромосомных признаков протеолиза, гемолиза, пигментсорбции и пигментсинтеза на вирулентность сибиреязвенного микроорганизма.