Прототипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синтезируемых ими антигенов 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 15 генетика

Вид материала

Документы

Содержание Материалы и методы. B. anthracis Генетические и молекулярно-генетические методы. B. аnthracis Биохимические методы. Иммунохимические методы. Результаты исследований B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis Иммунологическая эффективность белков S-слоя возбудителя сибирской язвы B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis B. anthracis ... Полное содержание

Подобный материал:

• Рабочая программа дисциплины «промышленная микробиология и биотехнология» Код дисциплины, 235.83kb.
• Методика эутоназии опытных животных 71 Изучение сравнительной иммунологической эффективности, 172.42kb.
• 11 клас Биология, 13.71kb.
• Рабочая программа генетика Код дисциплины по учебному плану опд ф. 6 для студентов, 274.5kb.
• Барыкина ольга серафимовна, 40.14kb.
• Задачи селекции : повышение урожайности сортов культурных растений, увеличение продуктивности, 105.58kb.
• Генетика Генетика, 18.18kb.
• Темы: общая генетика, генетика человека, медицинская генетика. Вопросы для самоподготовки., 39.67kb.
• Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза 03. 00., 750.11kb.
• Примерная программа дисциплины микробиология, вирусология, микробиология полости рта, 447.35kb.

Содержание диссертации

Материалы и методы. При проведении собственных исследований было использовано 77 штаммов B. anthracis и 3 - B. subtilis, из них 48 - получены в ходе настоящего исследования.

В качестве питательных сред использовали бульон BHI («Difco», США), бульон и агар Хоттингера, L-бульон и L-агар (Маниатис Т. с соавт., 1984), в которые при необходимости добавляли антибиотики: эритромицин (0,1 мкг/мл и 1 мкг/мл), линкамицин (25 мкг/мл), тетрациклин (10 мкг/мл), канамицин (25 или 50 мкг/мл), стрептомицин (25 мкг/мл). Для выделения сибиреязвенного токсина и белков S-слоя штаммы B. anthracis выращивали на среде (S-бульоне), предложенной J. Farchaus et al. (1995). Реакцию радиальной диффузионной преципитации ставили на казаминовой среде C. Thorne and F. Belton (1957) с добавлением сибиреязвенного -глобулина или кроличьих анти-ПА антител. Определение протеолитической, гемолитической активностей и способности к сорбции пигмента проводили на оригинальных средах с казеином, эритроцитами барана (кролика, морской свинки) и конго красным, соответственно. Работы с бактериофагом СP51ts45 осуществляли на питательном бульоне Nutrient broth («Difco», США) и средах для размножения, хранения и разведения фага (Thorne C. et al., 1968). В опытах по определению иммуногенности использовали морских свинок весом 300 - 350 г, беспородных белых мышей или мышей линии BALB/с весом 18 - 20 г. Для получения специфических антител к белковым препаратам использовали кроликов весом от 2,5 до 3 кг.

микробиологические и иммунологические методы. Определение видовых признаков сибиреязвенных штаммов проводили согласно регламентирующему документу - «Инструкции и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей» (М., 1980). Для микроскопического исследования клеток штаммов B. anthracis суточную агаровую культуру засевали в BHI и инкубировали 3 часа с аэрацией при температуре 37 ⁰С. Определение протеолитической активности проводили после инкубации посевов при температуре 37 ⁰С в течение 24 часов. Через 48 часов инкубации на этой же среде регистрировали син­те­з жел­то­го диф­фу­ндирующего пиг­мен­та. Учет ре­зуль­та­тов на сре­де с эрит­ро­ци­та­ми про­во­дили че­рез 72 ча­са инкубации при температуре 37 ⁰С. Для оценки признака пигментсорбции куль­ту­ру B. anthracis ин­ку­би­ровали при температуре 37 ⁰С в те­че­ние 18 ча­сов, за­тем ос­тав­ля­ли при ком­нат­ной тем­пе­ра­ту­ре на 48 ча­сов. Способность к споруляции определяли сравнением жизнеспособности прогретых (при температуре 65 ⁰С в течение 30 минут) и непрогретых культур. Дополнительно способность к образованию спор проверяли при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля.

Подготовку споровой взвеси сибиреязвенных культур, определение ЛД₅₀ и иммуногенности штаммов B. anthracis проводили согласно регламенту производства №831-98 вакцины сибиреязвенной живой, а также в соответствии с методическими рекомендациями - «Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей» (2002). Индексы иммунитета определяли как отношение ЛД₅₀ заражающей культуры иммунизированных и интактных лабораторных животных. Для получения антител к белкам S-слоя применяли модифицированную схему J. Farchaus et al. (1995). Кроликов иммунизировали четырехкратно очищенными препаратами Sap или ЕА1 в дозе 100 мкг на инъекцию. Анти-ПА антитела получали из сывороток кроликов, иммунизированных очищенным препаратом ПА в дозе 50 мкг семикратно с интервалом в 2 недели.

Генетические и молекулярно-генетические методы. Трансдукцию фагом СР51ts45 проводили согласно процедуре, описанной C. Thorne et al. (1968). Конъ­ю­га­ци­он­ные скннре­щи­ва­ния осуществляли на мем­бран­ных фильт­рах по D. Lereclus et al. (1986) в мо­ди­фи­ка­ции И.В. Бра­ги­на с со­авт. (1990). Электростимулируемую трансформацию штаммов B. anthracis проводили по методике С.А. Еремина с соавт. (1990), штамма B. subtilis WB600 - по методу P. Brigidi et al. (1990). Для получения инсерционных мутантов, опосредованных интеграцией Tn917 в хромосому B. аnthracis, использовали разработанную нами ранее методику.

В экспериментах по элиминации резидентных плазмид из клеток B. аnthracis за основу были взяты методики P. Mikesell et al. (1983) и B. Green et al. (1985). Выделение ДНК высокомолекулярного репликона pXO1 осуществляли по методу R. Kaspar, D. Robertson (1987). ДНК плазмиды pUB110 из штамма B. subtilis выделяли с помощью коммерческого набора для выделения и очистки плазмид (QIAGEN, США). Выделение гибридных плазмид из штаммов B. anthracis осуществляли модифицированным способом C. Kado and S. Liu (1981). Результаты электрофорезов в агарозном геле сканировали с помощью гель-документирующей системы ViTran (Биоком, Россия). Полимеразную цепную реакцию в модификации И.Тучкова с соавт. (1991) осуществляли на программируемом амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) с диагностическими праймерами на последовательности гена pag. Рестрикцию выделенной плазмидной ДНК проводили в соответствии с рекомендациями фирмы производителя ферментов Sigma (США) или MBI Fermentas (Литва). Для плазмиды pXO1 - 40 мкг ДНК инкубировали с 10 мкл фермента в 100 мкл рестрикционной смеси в течение 9 часов при температуре 37 ⁰С. После инкубации смесь прогревали при 65 ⁰С в течение 15 минут. Клонирование гена pag осуществляли по стандартным методикам (Маниатис Т. с соавт., 1984) с модификациями. Элюцию 6 т.п.н. фрагмента плазмиды pXO1 осуществляли по методу G. Dretzen et al. (1981). Стабильность гибридных плазмид оценивали согласно методикам, предложенным J. Barnard, A. Friedlander (1999) и S. Cohen et al. (2000).

Биохимические методы. Электрофоретическое разделение протеинов осуществляли в 10 % полиакриламидном геле в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 50 мА в течение 5 часов. Концентрацию белка в препаратах определяли общепринятыми методами: по М. Брэдфорду (Практическая химия белка, 1989) и спектрофотометрически (Скоупс Р., 1985). Аминокислотный состав белков определяли по методике S. Moore, W. Stein (Практическая химия белка, 1989) на базе института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН России (г. Саратов). Хроматографическую очистку Sap осуществляли в соответствии с рекомендациями J. Farchaus et al. (1995). Белок ЕА1 экстрагировали из клеточных стенок с помощью SDS-буфера, очищали двухэтапной ионно-обменной хроматографией на гидроксиапатите. ПА выделяли из рекомбинантных штаммов B. anthracis СТИDТПА-1 и 55DТПА-1(Spo^-). Хроматографическую очистку ПА проводили согласно рекомендациям C. Quinn et al. (1988) с модификациями. Ионобменную хроматографию препарата осуществляли на колонке с Macro Prep 50Q (Bio-Rad, США). Высокая степень очистки препарата ПА достигалась за счет гель фильтрации на сефакриле 300 НR (Bio-Rad, США).

биофизические методы. Для электронной микроскопии препараты белков S-слоя предварительно дважды диализовали, окрашивали 1,5 % раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты или 2 % раствором уранил-ацетата. Ультратонкие срезы контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата при температуре 56 ⁰С в течение 10 минут. Подготовку препаратов для иммуноэлектронной микроскопии проводили согласно процедуре, описанной J. Farchaus et al. (1995), с собственными модификациями. Все препараты просматривали на электронном микроскопе JEM-7A (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Мечение антител коллоидным золотом для иммуноэлектронной микроскопии проводили по методике Л.А. Дыкмана (1996). Регулярность ультраструктуры полученных протеинов подтверждали сканирующей атомно-силовой микроскопией (Коннов Н.П. с соавт., 2002).

Иммунохимические методы. Для анализа иммуноспецифичности препарата проводили иммуноблотинг по методу H. Towbin et al. (1979). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C (Amersham, США) проводили при силе тока 0,4 А и напряжении 100 V в течение 1,5 часов. Титр антител к протективному антигену в сыворотках иммунизированных животных и количественную оценку уровня продукции ПА рекомбинантными штаммами определяли с помощью дот-анализа и твердофазного ИФА (Фримель Г., 1987).

Экспериментальные материалы обрабатывали посредством статистических методов, описанных И.П. Ашмариным, А.А. Воробьевым (1962). Уровень значимости (Р) для различия между средними значениями вычисляли при помощи t критерия Стьюдента-Фишера.


Результаты исследований

Экспериментальные основы для создания эффективных сибиреязвенных вакцинных препаратов

Одна из первых задач настоящего исследования - осуществление поиска еще не идентифицированных факторов патогенности и иммуногенности сибиреязвенного микроба, детерминируемых хромосомными генами. Прежде всего, нас интересовала перспектива получения оптимального реципиентного штамма B. anthracis для генетического конструирования продуцирующего ПА бациллярного рекомбинанта. Внимание было обращено на признаки протеолиза (Prt), гемолиза (Hly), пигментсорбции (CR), пигментсинтеза (Ydp) и спорообразования (Spo) возбудителя сибирской язвы, по версиям разных авторов коррелирующих с вирулентностью (Цыганкова О.И., 1993; Еремин С.А. с соавт., 1999; Uchida I., 1985; Koehler T. et al., 1992; Worsham P., Sowers M., 1993).

Протестировав 14 штаммов B. anthracis, выявили гетерогенность их популяций, выражающуюся в одновременном присутствии клонов с различной экспрессией перечисленных признаков. Отмечен координированный характер изменения свойств. Клетки, хорошо сорбирующие пигмент из среды роста, как правило, обладали высокой активностью протеолитических, гемолитических ферментов и синтезировали желтый пигмент - фенотип Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺. Отсутствие способности к сорбции конго красного сочеталось с нарушением протеолиза, гемолиза, пигментсинтеза - фенотип Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-. Аспорогенные клоны отличались морфологией колоний и характером роста в жидких питательных средах.

В ходе экспериментов было установлено, что гетерогенность популяций штаммов B. anthracis является следствием диссоциации отдельных клонов с фенотипом Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺. Образование промежуточных форм укладывается в явление фенотипической изменчивости (Головлев Е.Л., 1998). Появление стабильных при пассировании in vitro и in vivo вариантов Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-Spo⁺ или Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-Spo^-, скорее всего, результат му­тационных событий, завершающих диссоциацию типичного штамма возбудителя сибирской язвы.

Обнаружено различие состава популяций природных вирулентных (преобладание фенотипа Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺) и аттенуированных (преобладание фенотипа Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-Spo⁺ или Prt⁺Hly^-CR^-Ydp^-Spo^-) культур сибиреязвенного микроба (рис. 1). Штаммы B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis Wright были представлены исключительно клетками, не экспрессирующими тестируемые признаки (Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-).

Рисунок 1. Популяционная гетерогенность штаммов B. anthracis по признакам протеолитической, гемолитической активности и пигментсорбции. По оси абсцисс – обозначения штаммов B. anthracis: 1 - 81/1; 2 - М28; 3 - М29; 4 - И34; 5 - И35; 6 - И36; 7 - И38; 8 - И302; 9 - 17JB; 10 - Sterne 34F₂; 11 - 71/12; 12 - Pasteur; 13 - СТИ-1; 14 - Wright. По оси ординат - количество клонов определенного фенотипа в процентах от общего числа.


На основании изучения популяционных составов ди-, моно- (Cf или T) и бесплазмидных (pf) штаммов B. anthracis, представляющих 8 изогенных систем, установили, что в координации признаков протеолиза, гемолиза, синтеза и сорбции пигментов не участвуют плазмидные гены. Определение механизмов сочетанного изменения свойств заслуживает дальнейшего теоретического осмысления и экспериментального развития. Однако, исходя из задач исследования, приоритет был отдан определению корреляции экспрессии хромосомных признаков с вирулентностью возбудителя сибирской язвы.

С этой целью на основе природного изолята B. anthracis 81/1 сконструировали систему изогенных штаммов, различающихся по составу плазмид и экспрессии хромосомных признаков. Сравнивали вирулентность клонов с диаметрально противоположными фенотипами - Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-Spo⁺, Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺Spo⁺ и Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺Spo^-. Диплазмидные производные тестировали на модели морских свинок, моноплазмидные (pXO1^-pXO2⁺) - белых мышей. В группе диплазмидных штаммов вирулентность изогенного производного с сочетанными нарушениями хромосомных признаков оказалась даже в 2 раза выше вирулентности исходного варианта - Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺Spo⁺. В группе моноплазмидных производных отмечали резкое снижение степени патогенности аспорогенного штамма - в 85 или в 1778 раз - для разных партий животных. Вирулентности клонов с фенотипами Prt^-Hly^-CR^-Ydp^-Spo⁺ и Prt⁺Hly⁺CR⁺Ydp⁺Spo⁺ существенным образом не отличались.

Таким образом, сочетанное нарушение способностей к протеолизу, гемолизу, сорбции и синтезу пигментов - признаков, ассоциируемых ранее с вирулентностью возбудителя сибирской язвы, не приводит к значительным изменениям ЛД₅₀ для лабораторных животных (морские свинки, белые мыши). Спонтанные мутации, характеризующиеся изменением фенотипа на Spo^-, сопровождаются снижением на 2 - 3 порядка уровня патогенности моноплазмидных производных для белых мышей.

Для того, чтобы определить является ли обнаруженный факт общей тенденцией иди единичным случаем, осуществили генетическое моделирование вирулентности. Во-первых, в бесплазмидный аспорогенный вариант изогенной коллекции с помощью трансдукционного переноса ввели репликон pXO2 из донорного штамма B. anthracis. В экспериментах на белых мышах степень патогенности Spo^- трансдуктанта была в 63 раза меньше степени патогенности аналогичной контрольной спорообразующей конструкции. Восстановление функции образования спор посредством трансдукционной передачи хромосомных генов приводило к повышению показателя ЛД₅₀ приблизительно до уровня контрольного штамма. Во-вторых, сконструировали транспозонный аспорогенный мутант и, после генетической передачи в него репликона pXO2, определили значения ЛД₅₀ для белых мышей. В результате Spo^- вариант обладал в 10 раз меньшей вирулентностью, чем Spo⁺ контроль.

Все вышеизложенное позволило заключить, что мутации, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, затрагивают детерминанты, вовлеченные в реализацию патогенных свойств сибиреязвенного микроба. И хотя, не образующие спор штаммы B. anthracis, ввиду значимости споровых антигенов для иммуногенеза, не имеют больших перспектив в плане создания менее реактогенных живых вакцин, они обладают явными преимуществами в качестве безопасных продуцентов иммуногенных антигенов.

Поэтому следующим этапом исследования было получение аспорогенных производных на основе вакцинных штаммов. Принцип селекции Spo^- мутантов базировался на использовании обнаруженной ранее корреляции признаков. В результате проведенных экспериментов удалось получить не образующие спор штаммы - B. anthracis Sterne 34F₂Spo^- (КМ89), B. anthracis 55Spo^- (КМ92), B. anthracis СТИTSpo^- (КМ91), B. anthracis SterneTPrt^-Spo^- (КМ90) и B. anthracis 55TSpo^- (КМ92(3)). Аспорогенность перечисленных культур сохранялась при культивировании in vivo, in vitro и после длительного хранения.

Моноплазмидные Spo^- варианты сибиреязвенных штаммов могут быть использованы как экологичные и безопасные продуценты сибиреязвенных антигенов, бесплазмидные - в качестве основ для их генетического конструирования. Преимущество практического применения аспорогенных культур заключается в нивелировании риска контаминации рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы. Необходимо отметить, что почти все полученные штаммы, за исключением B. anthracis КМ89, характеризуются низкой активностью протеолитических ферментов, что крайне важно для потенциальных продуцентов белковых антигенов.

Исходя из деградирующего действия собственных протеаз in vitro, возник вопрос – может ли экспрессия признака протеолиза влиять на функциональную активность ПА in vivo? Для ответа на него провели эксперименты с привлечением двух групп изогенных штаммов. Одна включала Prt^-Hly^-CR^- и Prt⁺Hly⁺CR⁺ фенотипы моноплазмидного (pXO1⁺pXO2^-) производного природного изолята B. anthracis 81/1, другая – такие же варианты вакцинного штамма B. anthracis Sterne 34F₂. Морских свинок иммунизировали однократно споровыми взвесями тестируемых культур в дозах - 1,25  10⁵ и 8  10⁵ жизнеспособных спор - для изогенных вариантов на основе вирулентного и вакцинного штаммов, соответственно. Через 21 день после иммунизации биомоделей заражали тест-культурой B. anthracis 2-ая вакцина Ценковского.

В результате, индексы иммунитета Prt⁺ производных вирулентного и вакцинного штаммов даже несколько превосходили показатели протективности изогенных Prt^- культур - в 8,0 и 1,3 раз, соответственно. С другой стороны, в поствакцинальный период от иммунизирующей дозы протеазопозитивных производных штаммов B. anthracis Sterne 34F₂ и 81/1 пало, соответственно, три и две морские свинки из 20-ти. На введение споровой взвеси протеазонегативных культур было по одному случаю летального исхода. Таким образом, собственные протеазы сибиреязвенного микроба могут несколько повышать протективность синтезирующих их штаммов, выступая, по-видимому, в роли дополнительных антигенов. В то же время, их функциональная активность ассоциируется с более высоким уровнем летальности иммунизированных биомоделей.

Обе эти тенденции подтверждают данные сравнительного изучения протективных свойств еще одного вакцинного штамма - B. anthracis СТИ-1, характеризующегося нарушенной способностью к деградации белковых субстратов. Ввиду отсутствия у него протеазопозитивного изогенного варианта, о чем упоминалось выше, сравнение проводили с Prt⁺ и Prt^- производными на основе B. anthracis Sterne 34F₂. В тех же условиях опыта индекс иммунитета B. anthracis СТИ-1 оказался еще меньше (приблизительно в 5 раз) чем у Prt^- варианта B. anthracis Sterne 34F₂. Летальности морских свинок в поствакцинальный период в этом случае отмечено не было.

Неожиданный интерес возник в связи с обнаруженным различием протективной активности двух протеазонегативных культур - B. anthracis Sterne 34F₂ и СТИ-1. Не является ли причиной почти пятикратного превышения индекса иммунитета штамма B. anthracis Sterne 34F₂ (Prt^-) наличие у него дополнительных иммуногенных антигенов? Подтвердить или исключить такую вероятность на данном этапе исследования не представлялось возможным. Однако в продолжение темы появились оригинальные предположения.

Иммунологическая эффективность белков S-слоя возбудителя сибирской язвы

Опыт работы со штаммами B. anthracis Sterne34F₂ и B. anthracis СТИ-1 показывает, что, несмотря на принадлежность к одному виду, они имеют некоторые фенотипические отличия. Наше внимание привлекло сообщение французских авторов, занимающихся исследованием S-слоя сибиреязвенного микроба, о фенотипических особенностях штаммов B. anthracis, дефектных по синтезу одного из компонентов поверхностной паракристаллической структуры. Как известно, S-слой возбудителя сибирской язвы представлен двумя белками - Sap и ЕА1. In vitro микроорганизм сначала синтезирует Sap, затем в течение стационарной фазы происходит замещение Sap на EA1, а освобождающийся протеин выходит в супернатант. Сконструированные I. Etienne-Toumelin et al. (1995) и S. Mesnage et al. (1997) Sap^- мутанты штамма B. anthracis Sterne34F₂ отличались от Sap⁺ клонов более крупными колониями, способностью к оседанию в бульоне в виде комочков и образованию очень длинных клеточных цепочек. Мы провели сравнительное микроскопическое исследование штаммов B. anthracis Sterne34F₂ и B. anthracis СТИ-1. Клетки выращивали в одинаковых условиях в жидкой питательной среде. Изучение с помощью светового микроскопа показало, что средняя длина микробной цепи, представленной клетками B. anthracis СТИ-1, более чем в двадцать раз превосходит таковую штамма B. anthracis Sterne 34F₂.

На основании совпадений феноменологий было сделано предположение, что у вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 нарушена экскреция протеина S-слоя – Sap. Сравнение белковых профилей концентрированных культуральных фильтратов штаммов B. anthracis СТИ-1 и Sterne34F₂ продемонстрирвало их различие. В супернатанте B. anthracis СТИ 1 отсутствовал белок с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе протеинов S-слоя возбудителя сибирской язвы (94 кДа). Протестировав 9 бесплазмидных штаммов сибиреязвенного микроба, выявили еще 4 культуры, непродуцирующие Sap в среду культивирования.

Анализ результатов белкового электрофореза концентрированных культуральных фильтратов выявил также штаммы, активно экскретирующие белок Sap - B. anthracis SterneT, 55T, 71/12pf. Ввиду подверженности компонентов S-слоя сибиреязвенного микроба протеолитической деградации, селектировали Prt^- варианты перечисленных культур.

Для выделения препаративных количеств белка S-слоя сибиреязвенного микроба, продуцируемого в среду выращивания (Sap), культуру B. anthracis 71/12pfPrt^- засевали в S-бульон и инкубировали при температуре 37 ⁰С с аэрацией в течение 18 часов. Хроматографическую очистку проводили с использованием различных носителей - сефарозы CL-4B, Macro Prep 50Q и гидроксиапатита. Выход белкового продукта составил 60 - 80 мг на 1 литр исходной культуры.

Для выделения компонента S-слоя, прочно связанного с клеточной стенкой (ЕА1), использовали штамм B. anthracis СТИT. Его культуру выращивали в BHI-бульоне при температуре 37 ⁰С с аэрацией в течение 18 часов. Разделение белков клеточного SDS-экстракта проводили при помощи разработанной методики двухэтапной ионообменой хроматографии на гидроксиапатите. Выход составил 80 мг протеина ЕА1 на 1 литр исходной культуры.

Идентификацию выделенных белков в качестве компонентов S-слоя сибиреязвенного микроба осуществляли биохимическими, электронно-микроскопическими и иммуноэлектронно-микроскопическими методами исследования. Как известно, S-слои микроорганизмов состоят из регулярно организованных протеиновых или гликопротеиновых субъединиц. Ультраструктуру белковых препаратов, полученных из культурального фильтрата штамма B. anthracis 71/12pfPrt^- и клеточного SDS-экстракта штамма B. anthracis СТИТ, исследовали с помощью электронного микроскопа. При нанометровом разрешении удалось выявить характерное для S-слоя регулярное строение белка - паракристаллическую решетку с упорядоченным расположением цилиндрических пор (рис. 2).

Для белков S-слоев различных микроорганизмов выявлены определенные соотношения аминокислот: значительное количество (40 - 60 %) неполярных; равные доли (по 15 %) кислых и основных; отсутствие (или наличие долей процента) метионина и цистеина (Sleytr U., 1978, 1997; Sara M., Sleytr U., 1996, 2000). Аминокислотный анализ выделенных нами протеинов показал содержание неполярных аминокислот у Sap - 53,5 % , у ЕА1 - 43,3 %. Соотношение кислых и основных для Sap - 16,3 и 20 %, а для ЕА1 –17,3 % и 18,8 %. Метионин и цистеин в обоих белковых препаратах обнаружены не были.



Рисунок 2. Электронно-микроскопическая картина ультраструктур белковых препаратов, полученных: А - из культурального фильтрата штамма B. anthracis 71/12pfPrt^- (Sap), увеличение - в 200 000 раз; Б – из SDS-экстракта клеточных стенок штамма B. anthracis СТИT (ЕА1), увеличение - в 150 000 раз.


Локализацию антигенов Sap и ЕА1 на поверхности клеток подтверждали иммуноэлектронной микроскопией со специфичными мечеными антителами. Для этого кроликов иммунизировали очищенными белками Sap и ЕА1. Из кроличьих сывороток получали иммуноглобулины и метили их коллоидным золотом. Иммуносорбцию осуществляли на клеточных образцах 18-часовых культур штаммов B. anthracis SterneT и СТИT. После взаимодействия с антителами к ЕА1 клетки обоих штаммов были почти сплошь покрыты непроницаемой для электронов меткой (рис. 3). Меченые антитела к Sap активно сорбировались на поверхности клеток B. anthracis SterneT и в межклеточном пространстве - на конгломератах экскретируемого штаммом белка. В препаратах B. anthracis СТИT частицы коллоидного золота равномерно распределялась в поле зрения в виде единичных включений или небольших скоплений, специфической сорбции антител не отмечалось.

Иммунореактивность выделенных препаратов определяли также постановкой иммуноблота с кроличьими антителами к белкам S-слоя. Кроме очищенных протеинов в реакции иммуноблота исследовали культуральные фильтраты штаммов B. anthracis СТИT и SterneT. После окрашивания нитроцеллюлозной мембраны положительную реакцию взаимодействия со специфичными антителами к



Рисунок 3. Результаты иммуноэлектронной микроскопии клеток штаммов B. anthracis СТИT (А) и B. anthracis SterneT (Б), обработанных мечеными антителами к белкам S-слоя - ЕА1 (А) и Sap (Б) (увеличение в 20000 и 25 000 раз).


Sap и ЕА1 регистрировали для обоих белковых образцов и культурального фильтрата штамма B. anthracis SterneT (на уровне электрофоретической подвижности, соответствующей молекулярной массе 94 кДа). Образования иммунных комплексов в препарате культурального фильтрата штамма B. anthracis СТИT не отмечалось. Имевшие место перекрестные реакции между антигенами S-слоя возбудителя сибирской язвы объясняются высокой степенью их сродства.

На основании изложенного выше, протеины, выделенные из штаммов B. anthracis 71/12pfPrt^- и B. anthracis СТИT, по молекулярной массе, формируемым ультраструктурам, аминокислотному составу и расположению на клеточной поверхности идентифицированы как компоненты S-слоя сибиреязвенного микроба - Sap и ЕА1. Высказанное нами предположение о нарушении у штамма B. anthracis СТИT продукции белка Sap подтвердилось данными иммуноэлектронной микроскопии и иммуноблота со специфичными антителами.

Изучение протективности очищенных препаратов Sap и ЕА1 проводили на модели морских свинок. Лабораторных животных иммунизировали очищенными препаратами Sap, ЕА1, и для сравнения - вакцинным штаммом B. anthracis. Контрольных животных оставляли интактными. Антигены вводили подкожно двукратно в дозе 25 и 50 мкг в сочетании с полным адьювантом Фрейнда. Иммунизацию споровой культурой B. anthracis Sterne 34 F₂ осуществляли однократно в дозе 1 ^. 10⁶ спор. После периода, необходимого для формирования иммунитета (21 день), биомоделей заражали штаммом B. anthracis 2^ая вакцина Ценковского в возрастающих дозах 1 · 10² – 1 · 10⁷ КОЕ.

В результате, значения ЛД₅₀ тест-заражающей культуры для морских свинок, иммунизированных белками Sap и ЕА1, оказались в 36,9 и 3,3 больше, чем тот же показатель для интактных животных. Преимущество в защитной способности в данном эксперименте принадлежало Sap. Иммуногенность вакцинного штамма, продуцирующего ПА, вполне предсказуемо почти на три порядка превышала иммуногенность белковых препаратов. Однако обращало на себя внимание, что даже в отсутствие основного иммуногена сибиреязвенного микроба, компоненты S-слоя в определенной степени защищали лабораторных животных.

Изучение влияния белков S-слоя на развитие адаптивного иммунитета in vivo осуществляли с использованием изогенной системы Sар⁺ и Sар^- вариантов B. anthracis SterneT. Мы предположили, что нарушение продукции Sар у штамма B. anthracis СТИ-1 - следствие спонтанных Sap^- мутаций, возникающих в процессе культивирования микроорганизма или температурной элиминации плазмид. Смоделировав в опыте соответствующие условия (42,5 ⁰С), осуществили поиск спонтанных Sap^- мутантов в популяции одного из вновь полученных бесплазмидных клонов. Прямая селекция по культурально-морфологическим признакам (как было предложено ранее) дала положительный результат. В данном случае для отбора 4-х спонтанных мутантов было протестировано всего 100 произвольных клонов. Отсутствие продукции белка Sар подтверждали данными белкового электрофореза, иммуноблота и иммуноэлектронной микроскопии.

Для изучения влияния Sap^- мутации на протективные свойства микроорганизма репликон pXO1 из донорного штамма B. anthracis передали посредством конъюгации в изогенные антибиотикорезистентные реципиенты на основе исходного штамма B. anthracis SterneT и его спонтанного Sap^- мутанта - B. anthracis SterneTSap⁺Sm^r и B. anthracis SterneTSap^-Sm^r. морских свинок иммунизировали однократно споровыми взвесями трансконъюгантов в концентрации 1 ·  10⁶ КОЕ. Через 21 день опытных и контрольных животных заражали культурой B. anthracis 2^ая вакцина Ценковского. Индекс иммунитета штамма на основе Sap^- мутанта оказался в 3 раза меньше индекса иммунитета Sap⁺ варианта. То есть, in vivo белок S-слоя способен усиливать протективную активность продуцирующего ПА штамма сибиреязвенного микроба.

В совокупности результаты, полученные при изучении защитных свойств белковых препаратов Sар и ЕА1, а также изогенных Sар⁺ и Sар^- штаммов B. anthracis, дают основания расценивать компоненты S-слоя возбудителя сибирской язвы как дополнительные факторы иммуногенности хромосомной детерминации. Это обстоятельство необходимо учитывать при селекции или конструировании штаммов сибиреязвенного микроба, претендующих на роль живых вакцин.