Львівський національний медичний університет імені Данила Галицького кафедра біологічної хімії методичні вказівки для практичних занять з біологічної хімії

1   ...   5   6   7   8   9   10   11   12   ...   20

Індивідуальна самостійна робота студентів.

1. Анаплеротичне та амфіболічне значення циклу трикарбонових кислот.

2. Роль найважливіших метаболітів амфіболічних шляхів (пірувату, α-кетоглутарату, ацектил-КоА, сукциніл-КоА та ін.) в інтеграції метаболізму.

Література

Основна:

1. Біохімічний склад рідин організму та їх клініко-діагностичне значення. Довідник / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Здоров’я, 2003. – 192 c.
   
2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.
   
3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.
   
4. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – 298 с.
   
5. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.
   

Додаткова:

1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф, Биологическая химия. – Москва: Медицина, 1998. – 701 с
   
2. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.
   
3. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. т. 1. – М.: Мир, 2004. – 381 с.
   
4. Мещишен І.Ф., Яремій І.М. Особливості обміну речовин у дітей / Чернівці: БДМА, 2003. – С. 4-18.
   

Змістовий модуль № 8. Молекулярні основи біоенергетики.


Тема № 7. Дослідження процесів біологічного окиснення, окисного фосфорилування та синтезу АТФ.

Мета заняття: Засвоїти основні принципи організації дихального ланцюга мітохондрій. Знати роль окисно-відновних ферментів у тканинному диханні. Оволодіти методами дослідження дії оксидоредуктаз: фенолоксидази, альдегіддегідрогенази, пероксидази, цитохрому с.

Актуальність теми: Окисно-відновні ферменти забезпечують перебіг реакцій, пов’язаних з перенесенням електронів та протонів і лежать в основі утворення макроергічних сполук. Дослідження їх функціонування важливе для глибокого розуміння механізмів тканинного дихання і його ролі при різних функціональних станах організму.

Конкретні завдання:

• Пояснювати процеси біологічного окиснення субстратів в клітинах та запасання енергії, що вивільняється, у вигляді макроергічних зв’язків АТФ;
  
• Аналізувати реакції біологічного окиснення та їх роль в забезпеченні фундаментальних біохімічних процесів;
  
• Малатаспартатна та гліцеролфосфатна човникові системи транспорту відновлюваних еквівалентів гліколітичного НАДН в мітохондрії та їх значення.
  
• Пояснювати структурну організацію ланцюга транспорту електронів та його молекулярних комплексів;
  
• Трактувати роль біологічного окиснення, тканинного дихання та окисного фосфорилування в генерації АТФ за аеробних умов.
  

Теоретичні питання

1. Біологічне окиснення субстратів в клітинах.
   
2. Реакції біологічного окиснення та їх функціональне значення:
   

• дегідрогеназні;
  
• оксидазні;
  
• оксигеназні (моно- та діоксигеназні).
  

3. Піридинзалежні дегідрогенази. Будова НАД⁺ і НАДФ⁺. Їх значення у реакція окиснення та відновлення.
   
4. Флавінзалежні дегідрогенази. Будова ФАД і ФМН. Їх роль у реакціях окиснення та відновлення.
   
5. Цитохроми та їх роль у тканинному диханні. Будова їх простетичної групи.
   
6. Молекулярна організація ланцюга транспорту електронів (дихального ланцюга) мітохондрій:
   

• компоненти дихального ланцюга мітохондрій;
  
• послідовність переносників електронів в дихальному ланцюгу;
  
• роль редокс-потенціалів у транспорті електронів і протонів.
  

7. Надмолекулярні комплекси дихального ланцюга внутрішніх мембран мітохондрій.
   

8. Шляхи включення відновлювальних еквівалентів (електронів та протонів) у дихальний ланцюг мітохондрій.
   
9. Шляхи утворення АТФ в клітинах – субстратне та окисне фосфорилування.
   

Практична робота

Дослід 1. Дослідження дії фенолоксидази.

Принцип методу. Метод базується на явищі забарвлення пірокатехіну в разі окиснення його молекулярним киснем за присутності фенолоксидази.

Матеріальне забезпечення: розчин пірокатехіну, 2 г свіжої картоплі, дистильована вода, розчин натрію сульфіду, ступка, штатив із пробірками, піпетки, водяна баня, термометр, газовий пальник.

Хід роботи. Одержання свіжого соку з картоплі: 1 – 2 г свіжої картоплі розтирають у ступці, додають 25 мл води, перемішують і зливають розчин у пробірку (ножем подрібнювати картоплю не можна, тому що іони заліза спричинюють потемніння).

У 4 пронумеровані пробірки наливають по 0,5 мл свіжого картопля­ного соку. У першу пробірку додають 0,5 мл пірокатехіну, у другу – 1 – 2 краплі інгібітора натрію сульфіду та 0,5 мл пірокатехіну. Вміст третьої пробірки кип’ятять, а потім вміщують 0,5 мл пірокатехіну. У четверту пробірку доливають 0,5 мл дистильованої води.

Усі пробірки ставлять на водяну баню на 30 хв. при температурі 37° С. Вміст пробірок перемішують для кращого доступу кисню. Розчин пер­шої пробірки забарвлюється внаслідок окиснення пірокатехіну киснем за присутності фенолоксидази. Колір розчинів у другій, третій, четвертій пробірках не змінюється.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.


Дослід 2. Дослідження дії альдегіддегідрогенази.

Принцип методу. Метод базується на знебарвленні метиленового синього за умови його відновлення альдегідом у присутності ферменту альдегіддегідрогенази. Дегідрогеназа, що міститься в молоці, легко окиснює формальдегід у мурашину кислоту. При цьому відбувається перенесення водню на метиленовий синій, який знебарвлюється:



Матеріальне забезпечення: нейтралізований альдегід, розчин метиленового синього, молоко, штатив із пробірками, піпетки, водяна баня, термометр, газовий пальник.

Хід роботи. Готують 3 пронумеровані пробірки. В першу наливають 1 мл молока, 1 – 2 крап. нейтралізованого альдегіду і 2 краплі розчину метиленового синього. У другу пробірку – 1 мл молока та 2 краплі метиленового синього. В третю пробірку – 1 мл прокип'яченого молока, 1 – 2 краплі нейтралізованого альдегіду і 2 краплі розчину метиленового синього. Вміст усіх трьох пробірок перемішують і ставлять на водяну баню на 30 хв. при температурі 37°С.

У першій пробірці розчин метиленового синього знебарвлюється. У другій і третій знебарвлення не спостерігають.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.


Дослід 3. Дослідження дії пероксидази.

Принцип методу. Метод базується на здатності пероксидази за присутності гідрогену пероксиду каталізувати окиснення бензидину, яке супроводжується його наступним забарвленням.

Матеріальне забезпечення: витяжка з хрону, 3 %-ний розчин гідрогену пероксиду, розчин бензидину в оцтовій кислоті, інгібітор пероксидази, штатив із пробірками, піпетки, газовий пальник.

Хід роботи. Готують 3 пронумеровані пробірки. В першу вливають 3-4 краплі розчину бензидину в оцтовій кислоті, 3-4 краплі 3 %-го розчину гідрогену пероксиду та 3-4 краплі витяжки з хрону. В другу пробірку вносять 3-4 краплі розчину бензидину в оцтовій кислоті, 3-4 краплі 3 %-го розчину гідрогену пероксиду та 3-4 краплі прокип’яченої витяжки з хрону. В третю пробірку до 3-4 крапель розчину бензидину додають інгібітор пероксидази, витяжку з хрону, після перемішування додають 3-4 краплі гідрогену пероксиду.

У першій пробірці спостерігають появу синього забарвлення. В другій та третій пробірках забарвлення відсутнє.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.


дослід 4. Дослідження відновлення цитохрому С.

Принцип методу. Метод ґрунтується на реакції відновлення цитохрому с за допомогою водню, що виділяється в реакції між металічним цинком та хлоридною кислотою. Після відновлення червоний колір цитохрому с бідніє.

Матеріальне забезпечення: розчин цитохрому с – 100мг/мл, 0,5 М розчин (9 %) аскорбінової кислоти, концентрована хлоридна кислота, металічний цинк, пробірки з газовідвідною трубкою.

Хід роботи. У першу пробірку вносять 8-10 крапель цитохрому с, у другу пробірку з газовідвідною трубкою – стільки ж концентрованої хлоридної кислоти і металічний цинк. Закривають пробірку корком і зовнішній кінець трубки опускають у пробірку з розчином цитохрому с так, щоб через розчин проходили бульбашки водню. При стоянні на повітрі розчин цитохрому с поступово відновлює попереднє забарвлення.

У пробірку наливають 1 мл розчину цитохрому с, додають 0,5 М розчин аскорбінової кислоти (2 – 3 мл) і закривають пробірку корком. Спостерігають за зміною кольору.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Цитохроми – окисно-відновні ферменти, які беруть участь у транспортуванні електронів у процесах тканинного дихання. Вони належать до залізопорфіринових ферментів, простетична група яких містить різні похідні гему. Атом феруму в гемі може змінювати валентність, приєднуючи або віддаючи електрони. Препарат цитохрому с використовують для покращення тканинного дихання асфіксії новонароджених, при астматичних станах, хронічній пневмонії, серцевій недостатності, ішемічній хворобі серця, інфекційному гепатиті при інтоксикаціях та інших станах, що супроводжуються порушенням окиснювальних процесів в організмі.


Контроль виконання лабораторної роботи