Селекция гороха ( Pisum sativum L.) На повышение эффективности симбиотической азотфиксации

Вид материала

Лекция

Содержание Тихонович Игорь Анатольевич Баталова Галина Аркадьевна Общая характеристика работы Цель исследований. В задачи исследований входило Научная новизна. Практическая значимость. На защиту выносятся следующие положения Апробация работы. Структура и объем работы. I. симбиозы бобовых и повышение эффективности Ii. условия, материал и методика исследований Pisum sativum Rhizobium leguminosarum bv. viciae Iii. скрининг генотипов гороха по эффективности симбиоза с Оценка клубенькообразующей способности. Нитрогеназная активность. Rhizobium leguminosarum bv. viciae Pisum sativum subsp. elatius Симбиотическая деятельность сортообразцов гороха различных морфотипов. ... Полное содержание

Подобный материал:

• «Кабардино-Балкарская государственная сельскохозяйственная академия имени В. М. Кокова», 1231.19kb.
• Повышение эффективности селекции аулиеатинского скота с использованием мирового генофонда, 1030.17kb.
• Селекция на повышение требований к ростовым веществам, 52.08kb.
• Задачи селекции : повышение урожайности сортов культурных растений, увеличение продуктивности, 105.58kb.
• Муниципальная программа «энергосбережение и повышение энергетической эффективности, 1085.05kb.
• 2010-2011 учебный год, 290.07kb.
• 2009-2010 учебный год, 378.67kb.
• И, повышение качества обучения, повышение эффективности управления, совершенствование, 131.69kb.
• Повышение эффективности диагностирования цилиндропоршневой группы автомобильных двигателей, 268.3kb.
• Паспорт подпрограммы «Энергосбережение и повышение энергетической эффективности, 155.24kb.

на правах рукописи


НАУМКИНА Татьяна Сергеевна


СЕЛЕКЦИЯ ГОРОХА (Pisum sativum L.) НА ПОВЫШЕНИЕ

ЭФФЕКТИВНОСТИ СИМБИОТИЧЕСКОЙ АЗОТФИКСАЦИИ


Специальность: 06.01.05 «Селекция и семеноводство»


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора сельскохозяйственных наук


Орел 2007


Диссертационная работа выполнена в 1985…2006 гг. в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур Россельхозакадемии


Научный консультант: академик Россельхозакадемии,

доктор биологических наук, профессор

Тихонович Игорь Анатольевич


Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Колесникова Аделина Фроловна


член-корр. Россельхозакадемии,

доктор сельскохозяйственных наук, профессор

Баталова Галина Аркадьевна


доктор сельскохозяйственных наук

Погодина Ольга Анатольевна


Ведущая организация: ГНЦ РФ ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова» Россельхозакадемии (г. Санкт-Петербург)


Защита состоится « 12 » ноября 2007 г. в 14³⁰ часов на заседании диссертационного совета ДМ 220.052.01 при ФГОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет» по адресу: 302019. г. Орел, ул. Генерала Родина, 69.


С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет».


Просим Вас принять участие в заседании диссертационного Совета или прислать свой отзыв в двух экземплярах, заверенных печатью.


С авторефератом можно ознакомиться на сайте www.vsau.ru


Автореферат разослан «___»___________2007 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор сельскохозяйственных наук,

профессор Л.П. Степанова


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы. Более 66% посевных площадей всех зерновых бобовых культур в России занимает горох (Pisum sativum L.). Однако в существующих сортах недостаточно реализовано одно из главных преимуществ культуры – высокая эффективность симбиотической азотфиксации (Тихонович, 2000; Задорин и др., 2003). Длительное время работы по изучению проблемы растительно-микробных симбиозов оставались монополией микробиологических институтов, создающих высокоэффективные микробные препараты. В результате роль растения-хозяина, наиболее генетически стабильного партнера растительно-микробной системы, в формировании симбиозов недооценивалась, а целенаправленная селекция бобовых на этот признак практически не проводилась. В этой связи расширение исследований, направленных на разработку методов создания и получение нового исходного материала, сочетающего высокую продуктивность с повышенной способностью фиксации атмосферного азота, является актуальной задачей.

У гороха часть генов, детерминирующих симбиоз с клубеньковыми бактериями, участвует в контроле развития и функционирования арбускулярной эндомикоризы (Борисов, 1999), а взаимодействие растений с микоризными грибами и клубеньковыми бактериями рассматривается как тройная симбиотическая система (Борисов и др., 2007). Поэтому исследования, направленные на создание высокопродуктивных ассоциаций гороха посевного с обоими эндосимбионтами, являются перспективными с точки зрения повышения биологической азотфиксации и симбиотического потенциала в целом, снижения степени затратности и повышения экологической ориентированности сельского хозяйства.

Создание высокоэффективных растительно-микробных систем в агроценозах путем селекции сортов гороха с высоким симбиотическим потенциалом является новаторским направлением, открывающим возможности расширения адаптивных свойств растений, придания им новых метаболических функций и на основе этого – получения высококачественной и экологически чистой сельскохозяйственной продукции (Тихонович, Проворов, 1998; Штарк, Данилова, Наумкина Т.С., 2006).

Цель исследований. Целью исследований является теоретическое обоснование и разработка практических подходов создания принципиально новых генотипов гороха, использующих потенциал двух- и трехстороннего симбиоза для формирования высокого урожая и повышения качества продукции.

В задачи исследований входило:

- изучить полиморфизм гороха по эффективности использования симбиотической микрофлоры в отношении повышения продуктивности растений;

- провести генетический анализ изменчивости и наследования продуктивности и симбиотических показателей у широкого спектра сортообразцов и гибридов гороха;

- разработать методы селекции гороха на повышение симбиотической эффективности;

- провести целенаправленный отбор ценных генотипов и на их основе создать принципиально новые сорта гороха, способные, используя взаимодействия с клубеньковыми бактериями и грибами арбускулярной микоризы, формировать высокий урожай и повышенное качество продукции;

- разработать элементы технологии возделывания новых сортов гороха с высоким симбиотическим потенциалом;

- дать оценку экономической и биоэнергетической эффективности возделывания новых сортов гороха

Работа проведена в соответствии с планами научно – исследовательских работ Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур по Государственным научно – техническим программам: О.Ц. 032 (1980…1985 гг.); ОНТП 0.51.03 «Зерно» (1986…1990 гг.); ОНТП «Высокоэффективные процессы производства продовольствия» (1991…1995 гг.); международному проекту «ИНТЕРБИОАЗОТ-2000»; программам НИОКР РАСХН (1996…2006 гг.); инвестиционным проектам ФЦНТП 01.03 (1999 – 2004 гг.); грантом Европейских программ кооперации научных исследований со странами бывшего Советского Союза INTAS 01-2170; грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований: №03-04-96466, № 06-04-96337; NATO – Russia JSTC. RCLG. 979133 и является итогом личных многолетних исследований автора, а также выполненных совместно с научными сотрудниками лаборатории генетики и микробиологии ГНУ ВНИИЗБК и лаборатории генетики растительно - микробных взаимодействий ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург).

Научная новизна. Впервые осуществлен скрининг генофонда гороха по эффективности взаимодействия с Rhizobium leguminosarum bv. viciae и микоризными грибами Glomus sp. Данные наблюдения имеют большое теоретическое значение, так как расширяют научные представления о взаимоотношениях растения-хозяина с полезной почвенной микрофлорой и способствуют дальнейшему развитию биологии и генетики развития растений.

Впервые установлен характер изменчивости показателей симбиотической азотфиксации у гороха и закономерности наследования при взаимодействии с ризобиями и микоризными грибами, что представляет определенный теоретический интерес для частной генетики и селекции гороха.

Впервые разработаны методики оценки и способы отбора высокопродуктивных растений, обладающих повышенной симбиотической эффективностью, комплементарных определенному штамму клубеньковых бактерий, что позволяет ускоренно получать исходный материал для селекции гороха.

Впервые на основании многолетних комплексных исследований теоретически обосновано и методически разработано новое направление селекции гороха на повышение симбиотической эффективности на основе симбиоза с клубеньковыми бактериями и микоризными грибами как целостной системы.

Впервые получены, не имеющие мировых аналогов, оригинальные линии гороха с рецессивным геном sym₂, вступающие в высокоэффективный симбиоз со штаммами клубеньковых бактерий, несущими ген nodX, которые могут быть использованы в дальнейших фундаментальных и прикладных исследованиях.

Практическая значимость. С помощью разработанных оригинальных модификаций методов селекции генотипов гороха, комплементарных определенному штамму клубеньковых бактерий, а также способствующих повышению эффективности двух- и трехстороннего симбиоза, созданы линии гороха, которые были переданы в лабораторию генетики растительно-микробных взаимодействий ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии и включены в научные исследования.

Разработаны и предложены селекционерам методические рекомендации по селекции гороха на повышение симбиотической азотфиксации (2005).

Создана серия изогенных линий гороха, способных формировать высокую семенную продуктивность, используя потенциал двухстороннего (Норд sym₂sym₂, Битюг sym₂sym₂, Демон sym₂sym₂) и трехстороннего (л.99/1) симбиоза, что придает растениям принципиально новую трофическую функцию – использование атмосферного азота в качестве основного источника азотного питания. Данные линии представляют ценность для использования в практической селекции в качестве доноров гена sym₂ и как перспективный исходный материал для селекции на урожайность, симбиотическую эффективность, устойчивость к полеганию, осыпанию семян, детерминантный тип роста стебля и другие признаки.

При использовании теоретических разработок и выполнении селекционно-генетических программ созданы и переданы на Государственное сортоиспытание новые сорта зернового гороха Юниор и Триумф, характеризующиеся повышенным симбиотическим потенциалом и высокой урожайностью.

Модельные системы на основе выделенных генотипов используются в международной кооперации научных исследований в области селекции гороха, а также при изучении взаимодействия растений и микроорганизмов.

Разработанные в процессе исследований методические подходы по симбиотической селекции гороха могут использоваться в учебных программах по биологии, генетике, селекции и микробиологии в высших и средних учебных заведениях.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Экспериментальное обоснование полиморфизма гороха по эффективности использования симбиотической микрофлоры при формировании высокой продуктивности растений.

2. Особенности изменчивости и наследования признаков продуктивности и симбиотической эффективности у гороха при одновременной инокуляции ризобиями и микоризными грибами.

3. Методы комплементарной селекции гороха на повышение симбиотической эффективности, основанные на интрогрессии рецессивного гена sym₂ в генотипы коммерческих сортов, серии отборов на безазотном фоне гибридных растений и дальнейшем использовании для их инокуляции штаммов ризобий с геном nodX или nodZ, способных использовать атмосферный азот в качестве основного источника азотного питания.

4. Способ ускоренного создания новых сортов гороха, способных используя взаимовыгодные взаимодействия с клубеньковыми бактериями и грибами Glomus sp,. формировать высокий урожай с повышенным качеством продукции.

5. Элементы технологии возделывания новых сортов гороха с высоким симбиотическим потенциалом.

6. Экономическая и биоэнергетическая эффективность возделывания новых сортов гороха.

Апробация работы. Результаты настоящих исследований были представлены и докладывались на областных, всесоюзных, всероссийских и международных совещаниях: на V и VI съездах Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987; Минск, 1992); на I и II съездах Всероссийского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994; Санкт-Петербург, 1999); на научно – теоретической конференции молодых ученых и аспирантов «Особенности продукционного процесса у зерновых бобовых и крупяных культур» (Орел, 1989); на научно – практической конференции «Научное обеспечение производства зернобобовых и крупяных культур» (Орел, 1992); на конференции «Аграрная наука - производству», посвященной 90-летию Самарского НИИСХ (Безенчук, 1993); на Международной научной конференции «Биологический и экономический потенциал зернобобовых, крупяных культур и пути его реализации» (Орел, 1997); на Международной конференции «Научные основы стабилизации производства продукции растениеводства» (Харьков, 1999); на Х и ХV Международных конгрессах по азотфиксации (Санкт – Петербург, 1995; Кейп Таун, 2007); на IХ Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995); на I и II Европейских конференциях по азотфиксации (Сегед, 1995; Познань, 1996); на Международном “Mendel Centenary Congress” (Брно, 2000); на IV Европейской конференции по зернобобовым культурам (Краков, 2001); на школе молодых селекционеров им. А.С. Кунакбаева (Уфа, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006); на Х Международном конгрессе по растительно – микробным взаимодействиям (Санкт-Петербург, 2003); на XII Международной конференции Африканской ассоциации по биологической азотфиксации (Кейп Таун, 2007); на IV Международном конгрессе по биотехнологии (Москва, 2007).

Новые методы оценки и способы отбора генотипов апробированы при создании сортов гороха Юниор и Триумф; комплементарных пар: «Норд sym₂sym₂ – штамм Rhizobium leguminosarum bv. viciae A-1», «Битюг sym₂sym₂ – штамм Rhizobium leguminosarum bv. viciae A-1», «Демон sym₂sym₂ – штамм Rhizobium leguminosarum bv. viciae A-1»; подана заявка на изобретение.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 66 научных работ, в том числе 9 – в рецензируемых и 17 – в зарубежных изданиях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 280 страницах текста и состоит из введения, семи глав, выводов, предложений производству; содержит 68 таблиц, 46 рисунков. Список литературы включает 341 источник, в том числе 114 на иностранных языках.

Автор выражает искреннюю благодарность директору ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, академику РАСХН, доктору биологических наук, профессору И.А.Тихоновичу, заведующему лабораторией генетики растительно – микробных взаимодействий, доктору биологических наук А.Ю. Борисову; директору ВНИИ зернобобовых и крупяных культур, доктору сельскохозяйственных наук, профессору В.И. Зотикову; главному научному сотруднику, члену-корреспонденту РАСХН, доктору сельскохозяйственных наук, профессору А.Д. Задорину; ведущему научному сотруднику лаборатории генетики и микробиологии, доктору биологических наук, профессору С.Н. Агарковой; кандидатам сельскохозяйственных наук В.П. Орлову и И.Ф. Орловой; доктору биологических наук, профессору Н.М. Чекалину за консультации по обсуждаемым в данной работе вопросам.


I. СИМБИОЗЫ БОБОВЫХ И ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ

БИОЛОГИЧЕСКОЙ АЗОТФИКСАЦИИ ПУТЁМ СЕЛЕКЦИИ

(обзор литературы)


В обзоре литературы показано, что симбиоз бобовых с клубеньковыми бактериями и микоризными грибами является результатом сопряженной эволюции партнеров, а его эффективность зависит как от генотипа растения-хозяина, так и микросимбионта. Поэтому высокая симбиотическая эффективность может быть достигнута путем создания комплементарных сочетаний генотипов партнеров, для чего необходима их координированная селекция. Несмотря на большое количество данных, накопленных при изучении генетического контроля симбиотической азотфиксации как со стороны растения-хозяина, так и микросимбионта, вопрос о методических основах селекции бобовых на повышение симбиотической эффективности остается открытым. В литературных источниках слабо представлены результаты оценки изменчивости, наследуемости и комбинационной способности сортов по симбиотическим признакам и показателям. Селекция бобовых культур, в частности гороха, на повышение эффективности симбиотической азотфиксации практически не ведется.

На основании имеющихся в современной отечественной и зарубежной литературе данных, делается вывод о необходимости разработки методических основ селекции на повышение эффективности симбиотической азотфиксации не только для улучшения её результативности, но и для дальнейшего развития теоретических основ биологии, генетики и селекции.


II. УСЛОВИЯ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ


Работа выполнена в 1985…2006 г.г. в лаборатории генетики и цитологии (с 2003 г. - лаборатории генетики и микробиологии) ГНУ ВНИИЗБК в условиях лесостепной зоны Центрально – Черноземного региона Российской Федерации.

Опытные посевы размещали после озимой пшеницы, высеваемой по черному пару. Почвы опытных участков темно – серые лесные среднесуглинистые, подстилаемые лессовидным суглинком, средней окультуренности (содержание гумуса по Тюрину – 4,4…5,4 %, легкогидролизуемого азота по Кононовой – 125 мг/кг почвы, подвижного фосфора по Кирсанову – 195, обменного калия по Кирсанову – 179 мг/кг почвы, рН солевой вытяжки – 5,6…6,0, гидролитическая кислотность – 4,2…4,6 мг-экв/100 г почвы).

Метеорологические условия периодов вегетации гороха (май-август) в годы исследований существенно различались: от засушливых (ГТК=0,74) до избыточно увлажненных (ГТК=2,50). Засушливыми в это время были 1992, 1999 и 2002 годы; слабо засушливыми – 1985, 1986, 1987, 1990, 1994, 1996, 2001, 2003 годы; достаточно увлажненными – 1988, 1989, 1991, 1995, 1998; 2003, 2004, 2005; избыточно увлажненными –1993, 1997, 2000, 2004, 2006 годы.

Объектом исследований являлись более 800 сортообразцов гороха ( Pisum sativum L.) из мировой коллекции ВИР им. Н.И. Вавилова, признаковой коллекции лаборатории селекции зернобобовых культур и генетической коллекции лаборатории генетики и цитологии ГНУ ВНИИЗБК, коллекции симбиотических мутантов ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, а также образцы из Центра генетических исследований зернобобовых культур Департамента сельского хозяйства США при Вашингтонском университете.

В работе использованы полевой, вегетационный и лабораторный методы исследований.

В летний период эксперименты проводили в поле на делянках площадью 1,5…10 м² в 4-х кратной повторности, размещение делянок рендомизированное; в осенне-зимний период - в теплице (интенсивность освещения 25…30 тыс. люкс, световой период 18/6 часов (день/ночь), температура днем и ночью составляла соответственно 22⁰С и 18⁰С.

Для предпосевной инокуляции гороха использовали производственные штаммы Rhizobium leguminosarum bv. viciae 245а, 250а, а также штаммы А-I, А-III - cпособные преодолевать устойчивость растений к клубенькообразованию, обусловленную геном sym₂, обладающие высокой конкурентоспособностью по отношению к местным и производственным штаммам и несущие ген nodX (Четкова, Тихонович, 1986). Инокуляцию проводили либо водной суспензией бактерий при разведении 10⁷-10⁸ клеток на 1 растение, либо ризоторфином - коммерческим препаратом клубеньковых бактерий, производимым во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

При изучении эффективности симбиоза гороха с эндомикоризными грибами для инокуляции использовали почвенно-корневую смесь из-под микоризованной суданской травы (Sorgum sudanense Pers.), которую вносили из расчета 500 кг/га.

Минеральные удобрения в дозе N₄₅P₃₀K₆₀ вносили перед посевом в виде аммиачной селитры, двойного суперфосфата и хлористого калия, исходя из методических рекомендаций по выращиванию гороха в данной зоне (1982).

Интрогрессию гена sym₂ в генотипы коммерческих и перспективных сортов осуществляли методом насыщающих скрещиваний (беккроссов).

Гибридизацию проводили посредством предварительной кастрации и последующего принудительного опыления цветков (50…100 шт. по каждой комбинации скрещивания).

При отборе проб для учета числа клубеньков на корнях растений использовали метод монолитов (Посыпанов, 1992).

Азотфиксирующую способность генотипов определяли по активности нитрогеназы методом редукции ацетилена по методике ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (1982) на газовом хроматографе с использованием сорбента “Parapak”.

Оценку микоризной инфекции выполняли по F.Trouvelot, J. Koungh (1986), используя следующие параметры: интенсивность развития микоризной инфекции, пересчитанная на 1 см корня (М, %) и обилие арбускул в микоризованной части корня (а, %).

Изучение изменчивости генотипов гороха осуществляли на 100 растениях каждого сортообразца по «Методическим указаниям по изучению коллекции зерновых бобовых культур» (ВИР, 1975) и методике, предложенной А.Ф. Мережко (1984).

Общее содержание азота, фосфора и калия в семенах устанавливали общепринятыми методами (Соколов, 1975).

Для оценки сортообразцов методами дивергенции использовали «Методику анализа хозяйственно-полезных признаков самоопыляющихся культур для подбора родительских форм при гибридизации на основе дивергенции» (Варлахов с соавт., 1981), базирующуюся на факторном анализе (Иберла, 1980).

Статистическую обработку данных по гибридологическому анализу проводили методом χ² (Глотов с соавт., 1983).

Комбинационную способность рассчитывали в соответствии с «Методикой оценки исходного материала по комбинационной способности в диаллельных скрещиваниях» (Цильке, Присяжная, 1979).

Генетический анализ выполняли согласно «Методике диаллельного анализа исходного материала по количественным признакам» (Новосибирск, 1979). Коэффициенты наследуемости H² и h² вычисляли по методике П.Ф. Рокицкого (1974).

Отбор высокопродуктивных растений, отзывчивых на инокуляцию штаммами ризобий и грибов арбускулярной микоризы, осуществляли из гибридных популяций F₄ на основе таких показателей, как масса сухого растения, масса семян с растения, число клубеньков на корнях растения и нитрогеназная активность и на основании глазомерной оценки в полевых условиях.

Оценку урожайности сортов Юниор и Триумф проводили в конкурсном сортоиспытании. В качестве стандартов использовались сорта Норд и Орловчанин, допущенные к использованию в Центральном регионе.

Все расчеты по математической обработке опытных данных выполнены на персональном компьютере в вычислительном центре ВНИИЗБК.

III. СКРИНИНГ ГЕНОТИПОВ ГОРОХА ПО ЭФФЕКТИВНОСТИ СИМБИОЗА С RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM bv. VICIAE