Цервикальной неоплазии
| Вид материала | Автореферат |
- Течение и исходы беременности при консервативной и хирургической коррекции истмико-цервикальной, 92.09kb.
- Опыт применения акушерского разгрузочного пессария у беременных с истмико-цервикальной, 49.95kb.
- Применение постизометрической релаксации мышц головы и шеи и механического вытяжения, 399.92kb.
На правах рукописи
УДК 618.146-006.6-074
Пономарева Юлия Николаевна
МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
В ПАТОГЕНЕЗЕ, ДИАГНОСТИКЕ И ПРОГНОЗИРОВАНИИ
ЦЕРВИКАЛЬНОЙ НЕОПЛАЗИИ
14.01.01 – «Акушерство и гинекология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва-2011
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава», ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии Росмедтехнологий»
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор Манухин ИгорьБорисович
доктор медицинских наук, профессор Ашрафян Лев Андреевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Хашукоева Асият Зульчифовна
доктор медицинских наук, профессор Дамиров Михаил Михайлович
доктор медицинских наук, доцент Аполихина Инна Анатольевна
Ведущая организация: ГУ «Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии» Министерства Здравоохранения Московской области
Защита состоится «____» ___________ 2011 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.06 в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу: 127473, Москва, ул. Делегатская д. 20/1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета (127206, г. Москва, ул. Вучетича д.10а).
Автореферат разослан « _____ » ________________ 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Умаханова М.М.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Широкая распространенность, разнообразие патологических состояний и потенциальный риск злокачественной трансформации эпителия шейки матки определяют высокую значимость прогностических критериев развития цервикальной неоплазии (Кулаков В.И. и соавт., 2004). Мировые показатели заболеваемости предраковыми заболеваниями шейки матки составляют, по данным различных авторов, от 1,5% до 20,0% и опухолями от 7‰ до 15‰ (GLOBOCAN database, 2007; V. Kumar и соавт., 2007).
В Российской Федерации на протяжении двух последних десятилетий рак шейки матки остается одной из часто встречающихся опухолей и составляет 5,2% в структуре злокачественных новообразований у женщин (Чиссов В.И. и соавт., 2007). Негативной тенденцией является значительный рост заболеваемости среди молодых женщин, представляющих не только репродуктивно значимую часть населения, но и активную социальную группу. Важно отметить, что в возрастной группе 20-40 лет рак шейки матки является основной причиной смерти среди всех больных злокачественными новообразованиями женской половой сферы, достигая 60% (Аксель Е.М. и соавт., 2002).
Общепризнано, что проблема цервикальных опухолей связана не только с устойчиво высокой заболеваемостью раком, но и с трудностями диагностики цервикальной интраэпителиальной неоплазии, представляющую один из этапов малигнизации цервикального эпителия. По мнению экспертов ВОЗ (Сидней, 1996), рак шейки матки – полностью предотвратимое заболевание, если оно выявлено на стадии предрака.
Как известно, развитие цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки связано с инфицированием онкогенными типами HPV. Длительная персистенция вирусов в цервикальном эпителии сопровождается их интеграцией в клеточный геном и появлением мутаций, причем неопластическая трансформация возникает с большей вероятностью при взаимодействии HPV с другими ИППП, достаточно распространенными в популяции (Киселев В.И. и соавт., 2000-2003; zur Hausen H., 1991-2000).
По результатам многоцентровых эпидемиологических исследований, до 90% случаев инфицирования HPV заканчиваются спонтанным выздоровлением, и только в 10% наблюдений развивается персистирующая инфекция, которая и запускает механизм злокачественной трансформации эпителиальных клеток (Herrington C.S., 1998; Schneider A. и соавт., 2002). Таким образом, инфицирование цервикального эпителия HPV представляет собой необходимое, но недостаточное условие для развития рака. Не исключено, что HPV является инициирующим фактором многостадийного процесса неопластической трансформации, однако, для финального превращения в рак важно его взаимодействие с другими онкогенами.
Результаты исследований свидетельствуют, что усиленная транскрипция вирусных онкогенов и функционирование вирусных онкобелков ассоциированы с нарушением экспрессии цитокинов, связанных не только противоинфекционным, но и противоопухолевым иммунитетом. Показано, что некоторые цитокины, в частности, TNFα, IL-1β, TGFβ, активно участвуют в регуляции факторов стабильности клеточного генома (Бережная М.Н., 2000; Hazelbag S., 2001; Tjiong M.Y. и соавт., 2001). В свою очередь, изменения в генетическом аппарате клеток могут быть обусловлены нарушением программы клеточной гибели. Одним из механизмов нарушения апоптоза являются мутации в генах, контролирующих гибель клеток. В ряду этих процессов находятся потеря функций гена-супрессора опухолевого роста р53 в результате его превращения в мутантный тип и аберрантная экспрессия протоонкогена bcl-2. Генетические нарушения, изменяя темпы гибели клеток, влияют и на пролиферативную активность, тем самым, способствуя нарушению процессов тканевого контроля (Лушников Е.Ф., 2001; Hale A.J. и соавт., 1996; Sheets E.E., 1997; Thomas M. и соавт., 1999).
Принято считать, что процесс неопластической трансформации связан с изменением баланса апоптоза и пролиферации клеток (Новиков В.С., 1996; Швемберг И.Н. соавт., 2002; Isacson C., 1996; Leung T.W. и соавт., 2004). Исследованию пролиферативной активности как показателю биологической агрессивности опухолей в последнее время придается большое значение. Этому способствовало появление иммуногистохимических методик, что позволило определить маркеры, связанные с регуляцией митотического цикла, - c-erb-B2, PCNA, Ki-67, а также рецепторы половых гормонов. Экспрессия последних в эпителиальных клетках шейки матки определяет их гормоночувствительность, и, как, следствие, пролиферативную активность цервикального эпителия. Тем более что, по мнению ряда исследователей, для формирования необратимой цервикальной неоплазии в качестве одного из факторов необходима конверсия клеточного метаболизма эстрадиола (Киселев В.И., 2004; Auborn K.J. и соавт., 1991; Woodworth C.D., 1998- 2002; Ramos J.G. и соавт., 2002; Remoue F. и соавт., 2003).
Изучение различных молекулярно-биологических факторов при цервикальной интраэпителиальной неоплазии во время ее перехода в рак и прогрессии начальных стадий рака представляет огромный клинический интерес. В настоящее время активно исследуются количественные гистопатологические параметры, пролиферативные, регуляторные маркеры, факторы стабильности клеточного генома (Франк Г.А. и соавт., 1997; И.И. Фролова и соавт., 2002; Манухин И.Б. и соавт., 2001; Pillai M.R. и соавт., 1996; Waggoner S.E. и соавт., 1998; Xue Y. и соавт., 1999; Sasagawa T. и соавт., 2003). Это обусловлено стремлением к выявлению рака шейки матки на доклинической стадии развития, когда своевременное максимально щадящее лечение цервикальной интраэпителиальной неоплазии имеет оптимально-радикальный эффект, позволяющий добиться полного излечения (Ашрафян Л.А. и соавт., 2002). Важность подобного направления исследований понятна, так как эффективность существующих методов терапии предрака и рака шейки матки напрямую зависит от степени ее поражения.
В свою очередь, улучшение результатов лечения уже возникших опухолей достигается при индивидуальном прогнозировании клинического течения рака шейки матки. Использование молекулярно-биологических критериев, характеризующих злокачественный потенциал опухоли, наряду с традиционными факторами прогноза позволяет определить вероятность прогрессирования начальных стадий рака шейки матки и повысить эффективность программы ведения пациенток высокого риска.
Цель исследования: улучшение результатов лечения и определение прогноза цервикальной неоплазии на основании комплексного анализа и систематизации молекулярно-биологических факторов, ассоциированных с неопластической трансформацией цервикального эпителия.
Задачи исследования:
- Определить инфицированность пациенток HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45 типами, CMV, HSV I-II типа, СТ и взаимосвязь с клинико-морфологическими характеристиками цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раком шейки матки (возраст, анамнез, степень тяжести поражения, глубина инвазивного роста, степень дифференцировки, наличие метастазов).
- Изучить содержание цитокинов IL-1β, TNFα и TGFβ в цервикальной слизи в зависимости от характера инфицирования, при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки и оценить их клиническое значение.
- Установить характер экспрессии белков-регуляторов апоптоза р53mut и bcl-2, маркеров пролиферации c-erb-B2 и PCNA при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки для более точной оценки степени тяжести цервикальной неоплазии.
- Выявить особенности экспрессии рецепторов половых гормонов при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки во взаимосвязи с экспрессией маркеров апоптоза, пролиферации, метаболитов эстрогенов (2-OH/16α-OH), индексом массы тела и определить их роль патогенезе цервикальной неоплазии.
- Определить характер корреляционных взаимоотношений между клинико-морфологическими параметрами и изученными молекулярно-биологическими факторами при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и раке шейки матки.
- Оценить прогностическое значение изученных молекулярно-биологических факторов в развитии цервикальной неоплазии.
- Разработать оптимальную диагностическую и лечебную тактику и постлечебный мониторинг у пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией с использованием молекулярно-биологических факторов.
Научная новизна
1. Выявлено, что поражение цервикального эпителия канцерогеными типами вируса папилломы человека и хламидийно-папилломавирусное инфицирование при цервикальной интраэпителиальной неоплазии связано с увеличением локальной продукции противовоспалительного цитокина TGFβ.
2. Показано, что повышение содержания TGFβ в цервикальном секрете пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией является диагностическим критерием тяжести поражения шейки матки, а увеличение концентрации IL-1β в цервикальной слизи больных инвазивным раком шейки матки сопряжено с глубиной опухолевого роста более 3 мм и метастатическим поражением регионарных лимфатических узлов.
3. Установлено, что приоритетное значение в клиническом течении цервикальной интраэпителиальной неоплазии имеет сочетанное увеличение экспрессии p53mut, гиперэкспрессия bcl-2, выраженная экспрессия c-erb-B2, повышение уровня PCNA.
4. Обнаружено, что увеличение экспрессии bcl-2 и c-erb-B2 в эпителии шейки матки характерно для пациенток репродуктивного возраста, а повышение экспрессии p53mut чаще встречается у больных в перименопаузе.
5. Установлено, что при определении степени тяжести и составлении прогноза заболевания необходимо учитывать сочетание экспрессии онкогенов p53mut, bcl-2, c-erb-B2, рецепторов половых стероидов, в комплексе с продукцией метаболитов эстрогенов и индексом массы тела, что коррелирует с клиническим течением и является прогностическим фактором клинического течения цервикальной неоплазии.
6. Определено, что формирование цервикальной неоплазии взаимосвязано с увеличением экспрессии p53mut и bcl-2, микстинфицированием CT и HPV HR, высокой пролиферативной активностью, увеличением локальной продукции TGFβ, гиперэкспрессией онкогена c-erb-B2, снижением экспрессии рецепторов эстрогенов, повышением концентрации 16α-ОНЕ1 и локальным увеличением содержания IL-1β.
7. Выявлены молекулярно-биологические критерии оптимальной тактики ведения пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией: определение концентрации TGFβ в цервикальном секрете, уровня экспрессии онкобелков p53mut, bcl-2, c-erb-B2, пролиферативной активности клеток, которые позволяют наряду со стандартными методами диагностики повысить эффективность курации цервикальной интраэпителиальной неоплазии и индивидуально обосновать объем лечебно-диагностических мероприятий.
Практическая значимость
Установлены дифференциально-диагностические критерии клинически значимых изменений на шейке матке при цервикальной интраэпителиальной неоплазии и распространенности опухолевого процесса при раке шейки матки. Определены и систематизированы наиболее значимые прогностические молекулярно-биологические факторы клинического течения цервикальной неоплазии. Определены группы риска по возникновению рака шейки матки. Предложена тактика ведения пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией, которая обладает высокой эффективностью при использовании в лечебно-профилактических учреждениях. Разработаны рациональные молекулярно-биологические критерии постлечебного мониторинга
Основные положения, выносимые на защиту
Вирусы папилломы человека высокого онкогенного риска 16, 18, 31, 33, 35, 45 типов выявляются более, чем у 50% пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией и 90% больных раком шейки матки. При этом частота выявления 16 типа HPV у больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией возрастает по мере увеличения степени тяжести поражения шейки матки.
Цервикальная интраэпителиальная неоплазия ассоциирована с нарушением продукции цитокинов с преобладанием иммуносупрессивного влияния TGFβ и нивелированием цитотоксического и антипролиферативного эффектов TNFα и IL-1β.
Рецидивирование цервикальной интраэпителиальной неоплазии и прогрессия в рак взаимосвязаны с хламидийно-папилломавирусным инфицированием, увеличением экспрессии онкогенов p53mut, bcl-2, c-erb-B2, высоким уровнем пролиферации.
Неблагоприятное течение цервикальной неоплазии связано двумя вариантами онкогенеза: промоторным – экспрессия рецепторов эстрогенов в сочетании с увеличением содержания16α-гидроксиэстрона у пациенток с ожирением и отсутствием онкогенов p53mut, bcl-2, c-erb-B2; генотоксическим – гиперэкспрессия онкогенов bcl-2 и c-erb-B2 при отсутствии стероидных рецепторов на фоне дефицита массы тела и критически низких значений соотношения 2ОН/16α-ОН.
Приоритетными факторами индивидуального прогнозирования клинического течения цервикальной неоплазии являются сочетание вариантов инфицирования шейки матки, продукции цитокинов, белков-регуляторов апоптоза, пролиферации клеток, рецепторов стероидных гормонов, метаболитов эстрогенов.
Апробация диссертации
Основные результаты работы представлены и доложены на региональной научно-практической конференции НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Рак репродуктивных органов: профилактика, диагностика, лечение» (Томск, 2002), Международном Конгрессе «Профилактика, диагностика и лечение гинекологических заболеваний» (Москва, 2003), региональной научно-практической конференции «Новые технологии акушерстве и гинекологии» (Хабаровск, 2004), V международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2004), I Российском конгрессе «Генитальные инфекции и патология шейки матки» (Москва, 2004), Российских Форумах «Мать и дитя» (Москва, 2003-2010), I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005), Международном Конгрессе «Практическая гинекология: от новых возможностей к новой стратегии» (Москва, 2006), Российской научно-практической конференции «Патология шейки матки и генитальные инфекции – от теории к практике» (Москва, 2006), 1 Международном конгрессе «Менеджмент в индустрии здоровья и красоты» (Москва, 2007), Всероссийском конгрессе «Амбулаторно-поликлиническая практика – новые горизонты» (Москва, 2009-2010), ХХIII Международном конгрессе с курсом эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» (Москва, 2010).
Внедрение
Материалы исследования используются в лечебной работе отделения гинекологии ФГУ Российский научный центр рентгенорадиологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи, гинекологических отделений ГКБ № 36, Московской областной больницы №5.
Разработан «Способ диагностики тяжелой цервикальной дисплазии», подтвержденный патентом на изобретение (РФ № 2273855 от 10.04.06 г.).
Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре акушерства и гинекологии лечебного факультета МГМСУ.
Личное участие
Автором разрабатывалась методика исследования и лично проводился подбор обследованных в группы изучения: 215 пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией I-III, 154 больных раком шейки матки Ia-III стадий, 50 здоровых женщин. Осуществлялся забор материала для ПЦР-детекции генитальных инфекций, ИФА-анализа цитокинов цервикальной слизи, бактериоскопического и цитологического исследования, выполнялась расширенная кольпоскопия и биопсия шейки матки, эндоцервикальный кюретаж с подбором образцов для иммуногистохимического исследования. Выполнялось оперативное лечение (электрокоагуляция, электроэксцизия шейки матки, пангистерэктомия, расширенная экстирпация матки по Вертгейму), ведение и 5-летнее диспансерное наблюдение пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки. В ходе диссертационной работы соискателем освоены методы статистической обработки данных в медицинских исследованиях.
Публикации
По материалам диссертации опубликованы 40 научных работ, из них 2 монографии, 20 статей, в том числе 14 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 17 тезисов и 1 патент на изобретение.
Объём и структура диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 7 подглав результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов исследования, главы алгоритма ведения пациенток с цервикальной интраэпителиальной неоплазией, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Работа изложена на 280 страницах, иллюстрирована 24 таблицами и 70 рисунками. Список использованной литературы включает 221 отечественных и 278 зарубежных источников.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
При выполнении исследования проведен анализ 3140 амбулаторных карт и историй болезни пациенток с морфологически подтвержденным диагнозом цервикальной интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки. В процессе проведения статистической выборки пациентки с тяжелой соматической патологией, имеющие опухоли других локализаций, с отсутствием возможности динамического 5-летнего наблюдения и выбывшие из наблюдения последовательно исключались методом компьютерного распределения. В результате проведено проспективное исследование 369 больных цервикальной интраэпителиальной неоплазией и раком шейки матки, находившихся на обследовании, лечении и диспансерном наблюдении в областном онкологическом диспансере г. Читы в 2001-2006 гг., отдельные положения прошли экспериментальную проверку в Российском научном центре рентгенорадиологии Росмедтехнологий. Возраст обследованных варьировался от 16 до 60 лет, и составил, в среднем, 37,9±8,1 лет.
Все исследования выполнялись с информированного согласия пациентов и соответствовали этическим принципам, предъявляемым Хельсинской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964, 2000).
Диагностика цервикальной интраэпителиалиальной неоплазии и рака шейки матки основывалась на комплексном клиническом обследовании, результатах расширенной кольпоскопии, цитологического и гистологического исследования (электроконизация шейки матки, аппарат «Фотек») в соответствии с отраслевыми стандартами объемов обследования и лечения в гинекологии (Кулаков В.И. и соавт., 1999) и алгоритмами объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований в онкологии (Чиссов В.И. и соавт., 2002). Критерием отбора больных являлся морфологически подтвержденный диагноз цервикальной интраэпителиальной неоплазии (CIN) и рака шейки матки. Стадирование эпителиальных дисплазий проводилась в соответствии с МКБ-X (1995), ГКО женского полового тракта ВОЗ (1995) и рака шейки матки в соответствии с классификацией TNM и FIGO (1997). В зависимости от степени тяжести поражения шейки матки группы обследованных распределились следующим образом: у 62 женщин диагностировалась CIN I; 60 – CIN II; 93 –CIN III; 40 – микроинвазивный рак (Ia стадия); 30 – Ib стадия; 30 – II стадия и у 54 – III стадия рака шейки матки.
Среди гистологических вариантов рака шейки матки у 125 (81,2%) пациенток обнаруживался плоскоклеточный рак (61 (39,6%) – без ороговения, 45 (29,2%) – крупноклеточный ороговевающий, 19 (12,3%) – мелкоклеточный низкодифференцированный), у 21 (13,6%) – аденокарцинома (12 (7,8%) – эндоцервикальная, 9 (5,8%) – мезонефроидная) и у 8 (5,2%) – железисто-плоскоклеточный рак. Степень дифференцировки опухоли G1 выявлена у 27 (17,5%) больных, G2 – у 49 (31,8%) и G3 – у 78 (50,7%).
Лечение цервикальных интраэпителиальных неоплазий у 74 (34,4%) больных выполнено в объеме электрокоагуляции шейки матки (CIN I-II), у 34 (15,8%) – криодеструкции (CIN I-II), у 81 (37,7%) – электроконизации (CIN III, CIN I-II при сочетании с рубцовой деформацией шейки матки), у 18 (8,4%) – ножевой ампутации шейки матки (CIN III на фоне рубцовой деформации, гипертрофии шейки матки), у 8 (3,7%) – гистерэктомии (CIN II-III в сочетании с миомой матки, аденомиозом).
При лечении рака шейки матки в 15 (9,7%) случаев применялась электроконизация шейки матки (Ia стадия), в 16 (10,4%) – операция Вертгейма (Ib стадия), в 34 (21,4%) – пангистерэктомия (Ia-Ib стадии), в 16 (10,4%) – комбинированная терапия (Ib-II стадии), в 61 (39,6%) – сочетанная лучевая терапия (II-III стадии) и в 12 (7,8%) – комплексное лечение.
После проведения лечения CIN рецидивы выявлены у 20 (9,3%) больных. Только у 7 (35,0%) пациенток рецидив возник в течение 2 лет после терапии, что свидетельствует о резидуальном поражении шейки матки. У 13 (75,0%) больных рецидив обнаружен в сроки от 3 до 5 лет, что обусловлено возникновением нового заболевания. В большинстве наблюдений – 16 (80,0%), диагноз при обнаружении рецидива оставался таким же, как и до лечения (CIN I-III), в 2 (0,5%) случаях после лечения CIN I-II возникла CIN III и у 2 (0,9%) больных при первичном лечении CIN III впоследствии возник микроинвазивный рак. Пациенткам с рецидивом заболевания CIN I-II была выполнена электроэксцизия шейки матки, при развитии рака – гистерэктомия. Все больные, наблюдавшиеся по поводу эпителиальных неоплазий живы и здоровы в течение 5 лет.
Показатель одногодичной летальности у больных раком шейки матки составил 11,7% (18). Прогрессирование рака шейки матки отмечено в 31,8% (49) случаев: в 23,4% (36) проведена химиолучевая терапия, 8,4% (13) – симптоматическое лечение. Общая пятилетняя выживаемость составила 72,7% (112), летальность 27,3% (42).
Больные с рецидивом цервикальной неоплазии (n=20) и прогрессированием рака шейки матки (n=49) составили группы неблагоприятного прогноза для CIN и рака шейки матки. Безрецидивное течение неоплазий (n=195) и рака шейки матки (n=115) соответствовали группам с благоприятным прогнозом CIN и рака шейки матки.
Цитологическое исследование цервикальных мазков и гистологическое исследование биоптатов шейки матки и операционного материала (шейка матки, регионарные лиматические узлы) выполняли по стандартной методике цитологического (Меркулов Г. А., 1969; Лилли Р., 1969) и гистологического (Хмельницкий О.К., 1994, 1999; Автандилов Г.Г., 2002; Семченко В.В., 2003) методов исследования.
Детекцию HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45 типа, CMV, HSV I-II типа, СТ проводили тест-системами «АмплиСенс-100-R» (Москва) методом ПЦР-анализа в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции» (ГК СЭН, 1995).
Определение концентрации цитокинов IL-1β, TNF-α, TGF-β в цервикальной слизи осуществляли при помощи стандартных коммерческих наборов для ИФА компании «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург). Определение в моче 2-гидроксиэстрона и 16α-гидроксиэстрона основывалось на методе ИФА при использовании набора «ESTRAMET 2/16 ELISA» и анализатора MULTISKAN EX (Фримель Г., 1987; Ngo T.T. et al., 1988).
В качестве контрольной группы по изучению генитальных инфекций, цитокинов и метаболитов эстрогенов использовалась репрезентативная выборка из 50 здоровых женщин, сформированная методом случайного выбора из общей популяции.
Иммуногистохимическое исследование онкомаркеров p53mut, bcl-2, c-erb-B2, PCNA, рецепторов эстрогенов и прогестерона проводили с использованием двухэтапного с демаскировкой антигена стрептавидин-биотин-пероксидазного метода с использованием стандартных наборов антител «Dako» (Дания) (Эллиниди В.Н. и соавт., 2002; Петров С.В. и соавт., 2004). При проведении морфологических исследований для контроля использовали 10 образцов здоровых тканей шейки матки.
Индекс массы тела рассчитывался по G. Brey (1978).
Статистическая обработка данных проведена в соответствии с правилами вариационной статистики (Гланц С., 1999). Данные представлены в виде M±m, где M – среднее арифметическое, m – ошибка среднего, n объем анализируемой подгруппы, р достигнутый уровень значимости. В таблицах и рисунках указаны только статистически значимые различия. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез оценивали с помощью t-test, считая статистически достоверными значения р≤0,05.
При анализе качественных признаков учитывали оценку долей в совокупности с расчетом стандартной ошибки доли с применением формулы Бернулли. Вероятность развития рецидива эпителиальных дисплазий оценивали при помощи модели пропорциональных рисков Кокса с применением критерия Кокса. Анализ выживаемости и построение кривых выживаемости осуществляли по методу Каплана-Мейера, статистическую значимость различий между кривыми оценивали при помощи критерия Гехана-Вилкоксона. Для изучения силы и значимости взаимосвязей между различными иммунобиологическими параметрами использовали многофакторный корреляционный анализ, при оценке степени их влияния на развитие цервикальной неоплазии был использован метод множественной линейной регрессии (Юнкеров В.И. и соавт., 2002).