Каршиева Саида Шамильевна Роль индукторов дифференцировки в комбинированной терапии злокачественных новообразований 14. 00. 14 онкология автореферат
| Вид материала | Автореферат |
- Проблема радиочувствительности и радиорезистентности злокачественных опухолей, 78.65kb.
- Дистанционная гамма терапия на этапах комбинированного лечения с интраоперационной, 302.64kb.
- Нейтронная и нейтронно-фотонная терапия злокачественных новообразований слюнных и щитовидной, 340.88kb.
- Известные причины зно (злокачественных новообразований), 104.24kb.
- Роль радиотермометрии при хирургическом лечении непальпируемых новообразований молочной, 450.48kb.
- Запорожан В. Н., Голант М. Б., Хаит, 62.84kb.
- В. В. Яковлев лечение рака и других злокачественных новообразований новым растительным, 518.58kb.
- «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И. П. Павлова, 672.82kb.
- Журнал для врачей всех специальностей Терра Медика, 87.94kb.
- С. 48-53. Достижения малоинвазивной эндоскопии в лечении доброкачественных и ранних, 372.55kb.
На правах рукописи
УДК 615.277.3.015.2:616-006-092.4/.9
Каршиева Саида Шамильевна
Роль индукторов дифференцировки в комбинированной терапии злокачественных новообразований
14.00.14 – онкология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2009 г.
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН
Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор Трещалина Елена Михайловна
доктор медицинских наук,
профессор, академик РАЕН Барышников Анатолий Юрьевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Переверзева Элеонора Рафаиловна
ГУН НИИ по изысканию новых
антибиотиков им. Г.Ф.Гаузе РАМН
доктор медицинских наук, Доненко Федор Витальевич
ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН
Ведущая организация: ФГУ МНИОИ им. П.А.Герцена Росздрава
Защита диссертации состоится «_____»_____________2009 г.
на заседании диссертационного cовета (Д.001.017.02)
ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН
(115478, Москва, Каширское шоссе, 24).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского онкологического
научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН.
Автореферат разослан « _____» _____________ 2008 года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Ю.А. Барсуков
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Самостоятельное применение цитодифференцирующих агентов (ЦДА) в онкологии связано с доказанным феноменом программированной гибели некоторых злокачественных клеток путем запуска терминальной дифференцировки. В последнее время активно изучается возможность повышения эффективности лечения некоторых распространенных форм злокачественных новообразований путем комбинированного применения их друг с другом и с химиотерапией [Абелев Г.И., 2001 г.; Волкова М.А., 2002 г.;]. Особую актуальность приобретает совершенствование схем комбинированного лечения с использованием ЦДА, отличающихся сравнительно низкой токсичностью [Уоррел Р.П., 2002 г.; Переводчикова Н.И., 2005 г.]. Механизм антипролиферативного действия одного из них был изучен на примере полностью трансретиноевой кислоты (ПТРК) - натурального метаболита витамина группы А. Противоопухолевый эффект ПТРК осуществляется за счет прямой стимуляции дифференцировки и индукции апоптоза в клетках больных острым промиелоцитарным лейкозом (ОПЛ). Данные доклинического изучения продемонстрировали также перспективность поиска новых ЦДА в ряду производных ПТРК, например 13-цис-ретиноевой кислоты. Определенные надежды связывают с включением производных ретиноевой кислоты в схемы лечения рака почки [Волкова М.А. и др. 2001 г.; Савченко В.Г. и др. 2004 г.; Bartolini G. et al., 2004]. Другим известным примером использования дифференцирующего подхода в терапии иммунозависимых злокачественных опухолей является терминальная дифференцировка клеток под влиянием цитокинов. Дифференцировка, индуцированная интерфероном (ИФН), хорошо изучена в культуре клеток волосатоклеточного лейкоза человека. Этот эффект рассматривается как результат активации внутриклеточных ферментов, обуславливающих функции клеток [Рукавицин О.А. и др., 2004 г., Кадагидзе З.Г., 2003 г.; Caraglia M. et al., 2005]. Улучшение результатов лечения больных с диссеминированной меланомой и раком почки за счет использования α2-ИФН позволило добиться длительных ремиссий и рекомендовать этот препарат в качестве «золотого» стандарта лечения [Носов Д.А., 2005 г.].
Среди новых ЦДА наиболее интересны и перспективны низкомолекулярные соединения, в числе которых трихостатин, депудецин, трапоксины, апицидины и производные гидроксамовой кислоты [Monneret C., 2005]. В настоящем исследовании углубленно изучено одно из соединений этого типа - новый отечественный оригинальный псевдопептид дикарбамин (Dcr), представляющий собой 2-(имидазол-4-ил)-этанамид пентандиовой-1,5 кислоты. Анализ консервативного лечения некоторых форм рака, в числе которых меланома, рак почки и ОПЛ, показывает, что, несмотря на увеличение числа лекарственных средств (ЛС) различных групп, результаты остаются неудовлетворительными. Отдельные схемы химиотерапии (ХТ), иммунотерапия или цитодифференцирующая терапия не приводят пока к полным клиническим эффектам. Поэтому в настоящее время особую актуальность приобретает вопрос совершенствования комбинированного лечения за счет сочетания ХТ и иммунотерапии с индукторами дифференцировки. Однако использование ЦДА может привести к таким нежелательным эффектам, как снижение эффективности лечения за счет уменьшения пролиферативного пула опухолевых клеток или блокирования общей с иммунокорректором мишени.
В связи с этим, чрезвычайно актуально обоснование в эксперименте рациональных схем применения комбинаций с использованием противоопухолевых цитостатиков и средств иммунотерапии с ЦДА.
Цель исследования
Выявить роль индукторов дифференцировки различного механизма действия в эффективности противоопухолевой терапии на моделях опухолей животных и человека.
Задачи исследования:
- Выявить in vitro и in vivo на моделях гемобластоза и меланомы степень модификации эффективности комбинированного лечения индукторами дифференцировки при различных схемах применения.
- Определить in vivo влияние цитодифференцирующих агентов ПТРК,
α2-ИФН и Dcr на опухолевый рост и эффективность некоторых схем комбинированной химиотерапии на моделях экспериментальных гемобластозов и меланом.
- Исследовать in vitro и in vivo возможный механизм антипролиферетивного и противоопухолевого действия индукторов дифференцировки на клеточном и тканевом уровнях.
Научная новизна
Впервые разработана модель перевиваемого дифференцирующегося гемобластоза на мышах линии DBA2 и гибридах BDF1 с использованием культуры клеток DS19 эритробластоза Френд (ЭБФ), адекватная для доклинического изучения цитодифференцирующих агентов in vivo.
Впервые в экспериментах на перевиваемом ЭБФ и меланомах мышей и человека in vitro и in vivo изучены свойства известных индукторов дифференцировки (ПТРК, α2-ИФН) и нового препарата Dcr в монорежиме, в сочетании друг с другом и с противоопухолевыми цитостатиками (дакарбазином (DTIC), цисплатином (ЦП).
Впервые определены терапевтические дозы Dcr на различных моделях опухолевого роста животных и человека в монорежиме и в сочетании с цитостатиками. Для мышиных опухолей установлен диапазон разовых терапевтических доз 0,5-4,5 мг/кг при 5-30-кратном введении per os, для опухолей человека диапазон разовых терапевтических доз 1,5-4,5 мг/кг при 5-10-кратном p/o введении.
Впервые найдены эффективные комбинации и подобраны режимы введения различных индукторов дифференцировки ( Dcr, α2-ИФН и ПТРК) и противоопухолевых цитостатиков (ЦП и DTIC). Установлен синергизм Dcr и α2-ИФН при последовательном введении в отношении ЭБФ и при одновременном введении в отношение ксенографтов меланомы человека Mel6. Найдено аддитивное усиление эффективности ЦП и DTIC при сочетании с Dcr и Dcr с ПТРК при последовательном введении.
Впервые найдены концентрации ПТРК, α2-ИФН и Dcr для проявления антипролиферативного и цитодифференцирующего действия на культурах клеток меланомы человека MS и Mel5, а также эффективные дозы in vivo на ЭБФ в монорежиме и в комбинациях.
Впервые установлено, что антипролиферативное и противоопухолевое действие ПТРК, α2-ИФН, ДМСО и Dcr сопряжено со следующими проявлениями цитодифференцировки: изменение фенотипического профиля клеток (промиелоцитарный лейкоз человека NB4, HL60) интенсификацией меланиногенеза (культуры клеток меланомы человека MS и Mel5, и п/к ксенографты Mel6); увеличение активности апоптоза, снижение активности митоза и возрастание зоны некроза в опухолях мышей и человека (гемобластоз ЭБФ, меланома В16, Mel6, Mel7); перераспределение клеток по фазам клеточного цикла - задержка клеток в стационарной фазе G0/G1 и накопление в фазе S без выхода в митоз (гемобластозы NB4, HL60, меланомы B16, Mel6, Mel7).
Научно-практическая значимость
В результате исследований получены новые данные о свойствах различных цитодифференцирующих агентов на моделях опухолевого роста, имеющие фундаментальное значение. Установлены новые феномены антипролиферативной активности ПТРК, α2-ИФН и Dcr на культурах клеток меланомы человека и животных MS, Mel5, B16, а также антипролиферативной и противоопухолевой активности Dcr на культурах клеток ОПЛ, перевиваемых гемобластозе и меланомах животных и человека.
Перспективными для клинического изучения являются экспериментальные данные, полученные:
- по способности Dcr ингибировать пролиферацию клеток и опухолевый рост меланомы животных и человека с увеличением выживаемости.
- о синергизме между α2-ИФН и Dcr
- об аддитивном усилении эффективности комбинаций с включением цитостатиков ЦП или DTIC и цитодифференцирующих препаратов ПТРК или Dcr.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на заседании Ученого Совета НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, 2006 г.; на VI и VII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», (М/о, с-з «Московский», 2007, 2008 гг.); на Российской конференции по меланоме c международным участием, проводимой совместно с Европейской школой онкологии и Всемирной рабочей группой по меланоме (Москва, 2008 г.); 7 июня 2008 г. на межлабораторной конференции в НИИ ЭДиТО ГУ РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН с участием лаб. клеточного иммунитета, лаб. фармакокенетики, лаб комбинированной терапии опухолей, лаб. фармакологии и токсикологии, лаб. экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей, лаб. синтетических противоопухолевых веществ, а также лаборатории фармакологии и химиотерапии ГУ НИИНА им. Гаузе РАМН.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 научные статьи в рецензируемых журналах и 2 тезиса.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 193 страницах машинописного текста и состоит из введения, главы «обзор литературы», главы «материалы и методы», 4 глав собственных результатов, выводов, списка литературы, списка сокращений. Список литературы включает 133 публикаций, из них 40 отечественных и 93 иностранных источников. Работа иллюстрирована 62 рисунками и 34 таблицами.
Материалы и методы исследования
Использованные в работе ЦДА. 1) Дикарбамин (Dcr, ООО «Фарминтерпрайсез») представляет собой 2-(имидазол-4-ил)-этанамид пентандиовой-1,5 кислоты (М.м. 225) в разовых дозах 1,0-4,5 мг/кг р/о ежедневно в течение 5-13 дней. 2)Политрансретиноевая кислота (ПТРК, Sigma) вводили мышам п/к ежедневно в течение 5 дней в разовой дозе 0,3 мг/кг. 3)РФН (α2а-ИФН) вводили мышам п/к в разовой дозе 10 тыс. МЕ/кг ежедневно в течение 5-ти дней; 4)Интрон-А (ИН-А (α2b-ИНФ), Шеринг-Плау) использовали в концентрациях 7-70-700 МЕ/мл инкубировали в культуре клеток в течение 72 часов. Противоопухолевые средства. 1)Цисплатин (ЦП, Teva) вводили в разовой дозе 3 мг/кг в/б 3-кратно с интервалом в 48 часов ; 2)Дакарбазин (DTIC, Lachema) вводили мышам в разовой дозе 200 мг/кг в/б ежедневно в течение 3-х дней (суммарная доза 600 мг/кг).
Лабораторные животные
Эксперименты выполнены на изогенных мышах-самках DBA2, C57Bl6 и BDF1 разведения ГУ РОНЦ и из питомника РАМН «Столбовая», которых содержали в виварии ГУ РОНЦ на брикетированных кормах. Для трансплантации опухолей человека использованы иммунодефицитные мыши-cамки Balb/с nude разведения ГУ РОНЦ, которых содержали в специализированном кондиционированном отсеке с соблюдением требований, предъявляемым к конвенциональным животным.
Модели опухолевого роста. Использованы культуры клеток опухолей человека и перевиваемые опухоли мышей и человека из Банка опухолевых штаммов ГУ РОНЦ. Культуры клеток: 2 линии клеток ОПЛ человека HL60 и NB4 с транслокацией t(15;17), способных к дифференцировке под действием ЦДА в гранулоциты, моноциты и макрофаги; 1 линия меланомы мышей В16 и 2 линии клеток меланомы человека MS и Mel5 с различной способностью к меланиногенезу. Клетки перевиваемых клеточных линий культивировали в соответствующих питательных средах, после чего рассевали в пластиковые флаконы фирмы Costar (25см2), добавляли тестируемые агенты, с которыми инкубировали клетки. Штаммы перевиваемых опухолей животных и человека (2-17-й пассажи): эритролейкоз Френд (ЭБФ), полученный из клеточной линии DS19, солидная пигментированная мышиная меланома B16, 2 штамма меланомы человека - слабо пигментированная дифференцирующаяся Mel6 и беспигментная Mel7. Опухоли трансплантировали мышам подкожно (п/к) по стандартным методикам.
Основные критерии оценки эффективности. Об эффективности индукторов дифференцировки in vitro судили по стандартным показателям дифференцировки: по динамике специфических маркеров CD11b, CD38, CD15, CD18, CD54, CD14, CD71, CD33, CD13, Ki67, по функциональной активности клеток, по уровню их пролиферативной активности, а также по распределению клеток по фазам клеточного цикла. О противоопухолевой эффективности препаратов in vivo судили по кинетическим показателям (Vt/Vt-1) и по торможению (ТРО%, Т/С%) роста опухолей в опытных и контрольных группах, а также по увеличению продолжительности жизни (УПЖ%) мышей, которые определяли стандартными способами [Барышников А.Ю, 2003 г.; Софьина З.П. и соавт., 1979 г.; Трещалина Е.М. и соавт., 2005 г.; B. Taicher et al., 2004].
Методы электронной и световой микроскопии. Использованы стандартные методы с окраской гистологических срезов гематоксилин-эозином и фиксацией материала для электронной микроскопии (ЭМИ) в глутаральдегиде. Для количественной оценки степени дифференцировки опухолевых клеток при ЭМИ подсчитывали общее количество клеток в нескольких ультратонких срезах с разных блоков (5 блоков, количество клеток до 500), количество содержащих меланосомы клеток и среднее число меланосом на одну такую клетку. Индекс интенсивности меланинообразования (ИИМ) определяли по формуле: ИИМ=КМхМК/500, где КМ - количество клеток, содержащих меланосомы, а МК – среднее количество меланосом на клетку [Райхлин Н.Т., 1979].
Иммунофлуоресцентный метод. Для проведения непрямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции клетки сначала инкубировали с МКА, а затем с FITC-меченной антисывороткой. Для проведения прямой реакции поверхностной иммунофлуоресценции использовали МКА, напрямую меченные флуорохромами флуоресцеином (FITC) или фикоэритрином (PE). Реакцию анализировали на проточном цитофлуориметре FACScan (Becton Dickinson, USA) [Docik G. et al., 1980].
ДНК-цитометрический анализ. ДНК-цитометрический анализ проводили в импульсном проточном цитофлуориметре ICP-22 (фирма «Фиве», ФРГ) с использованием флуоресцентных красителей этидиум-бромида и митрамицина. Уровень люминесценции окрашенных клеток (ядер) был пропорционален содержанию ДНК, стандарт - нормальные лимфоциты человека или спленоциты мыши. Расчет распределения клеток по фазам клеточного цикла (G0/G1, S, G2/M) выполняли по коэффициенту вариации индекса ДНК (ИДНК). При анализе структуры популяции значения плоидности пиков на ДНК-гистограммах выражали ИДНК, который вычисляли как отношение номера канала анеуплоидного пика к номеру канала пика нормальных диплоидных клеток (стандарту). Значимыми считали пики >5% от числа 20-100 и более тыс проанализированных клеток. Данные в автоматическом режиме вводились в ЭВМ РС-286 и обрабатывались с помощью специальных алгоритмов и программ.
Статистическая обработка данных. Конечные результаты всех опытов обрабатывали статистически, вычисляли средние значения с учетом «σ» или доверительного интервала средних сравниваемых величин. Достоверность оценивали по методу Стьюдента с 95% вероятностью [Гланц С, 1999 г.].
Результаты исследований и их обсуждение
Изучение дифференцирующих свойств индукторов на клетках ОПЛ человека
Показано (рис. 1, табл. 1, 4) уменьшение экспрессии маркера миелоидных предшественников CD33 в 2 раза относительно контроля под действием ПТРК с одновременным увеличением экспрессии маркеров зрелых клеток – CD15 в 2 раз и CD11b в 6 раз. Повышение адгезивных свойств, фагоцитарной активности и люминесценции клеток говорят о дифференцировке клеток NB4 в сторону гранулоцитарного ростка до зрелых терминально дифференцированных нейтрофилов, что согласуется с [Breitman T.R., 1980]. ПТРК оказывает значимый антипролиферативный эффект, как по уменьшению экспрессии маркера митотической активности Ki67 в 30 раз, так и по увеличению доли покоящихся (G0/G1≈40%) и уменьшению доли синтезирующих (S≈44%) клеток.
ДМСО также вызывал уменьшение экспрессии CD33 в 2 раза и повышение СD11b в 3 раза относительно контроля, но уменьшал экспрессию CD15 в 1,5 раз, CD38 в 6 раз и молекул адгезии CD54 в 2,5 раза. Это показывает, что на уровне монобластов-промоноцитов утрачивается экспрессия маркера CD15. Таким образом, ДМСО, скорее всего, стимулирует как гранулоцитарную, так и макрофагальную дифференцировку клеток, причем эти процессы терминально не завершенные. Этим объясняется повышение фагоцитарной активности клеток в 2-3 раза и люминесценции 1,5-2 раза относительно контроля, которое не достигает уровня нормальных зрелых фагоцитов.
 |  |
| Рис. 1. Изменение экспрессии дифференцировочных антигенов на клетках линии NB4 под влиянием Dcr, ПТРК и ДМСО. | Рис. 2. Изменение экспрессии дифференцировочных антигенов на клетках линии NB4 под влиянием Dcr в различных концентрациях. |
| Таблица 1. Фагоцитарная активность и хемилюминесценция клеток линии NB4 после применения различных индукторов дифференцировки | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Тем не менее, ДМСО оказывает выраженный антипролиферативный эффект, что проявляется в уменьшении экспрессии