Каршиева Саида Шамильевна Роль индукторов дифференцировки в комбинированной терапии злокачественных новообразований 14. 00. 14 онкология автореферат
| Вид материала | Автореферат |
- Проблема радиочувствительности и радиорезистентности злокачественных опухолей, 78.65kb.
- Дистанционная гамма терапия на этапах комбинированного лечения с интраоперационной, 302.64kb.
- Нейтронная и нейтронно-фотонная терапия злокачественных новообразований слюнных и щитовидной, 340.88kb.
- Известные причины зно (злокачественных новообразований), 104.24kb.
- Роль радиотермометрии при хирургическом лечении непальпируемых новообразований молочной, 450.48kb.
- Запорожан В. Н., Голант М. Б., Хаит, 62.84kb.
- В. В. Яковлев лечение рака и других злокачественных новообразований новым растительным, 518.58kb.
- «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И. П. Павлова, 672.82kb.
- Журнал для врачей всех специальностей Терра Медика, 87.94kb.
- С. 48-53. Достижения малоинвазивной эндоскопии в лечении доброкачественных и ранних, 372.55kb.
Действие Dcr на фенотипический профиль клеток отличается уменьшением экспрессии маркеров CD33 в 1,3-2,0 раза и CD38 в 2,0-5,5 раз относительно контроля. Экспрессия СD11b и CD15 в зависимости от концентрации либо колеблется на уровне контрольных значений, либо уменьшается в 2,5-2,0 раза, а экспрессия адгезивной молекулы CD54 остается на уровне контроля. Возможно, такое влияние на антигенный профиль клеток NB4 связано со сдвигом дифференцировки более ранних предшественников лимфоидного (CD38) и миелоидного (CD38, CD33) ростков без запуска терминальной дифференцировки. Уменьшение CD15 и CD11b при некоторых концентрациях Dcr, скорее всего, связано с гибелью клеток, что проявляется в резком уменьшении экспрессии CD71 (в 78 раз) и Ki67 (в 43 раз), а также в положительной тенденции распределения клеток по фазам клеточного цикла: небольшим накоплением покоящихся клеток в фазе G0/G1≈43% и обеднением пролиферирующихся клеток в S-фазе до 55%.
Исследование ЦДА на клетках HL60 по различным параметрам дифференцировки показало (рис. 2, табл. 2-4), что каждый из индукторов имеет своеобразный профиль активности. Так, ПТРК вызывает незначительное снижение маркера-предшественника миелоидного ряда CD33 и не влияет на экспрессию CD13, одновременно с этим повышая экспрессию CD38 в 5,5 раз относительно контроля. Это может быть связано с индукцией дифференцировки CD38 на более ранних этапах дифференцировки и пополнением популяции CD33 клеток.
Таблица 2.
Влияние ПТРК, ДМСО и Dcr на экспрессию дифференцировочных антигенов в клетках линии HL60
| Антигены | Среднее значение экспрессии в процентах (М+m) | |||
| Контроль | ПТРК 0,3 мкг/мл | ДМСО 1,3 мг/мл | Dcr 2,1 мкг/мл | |
| CD33 | 96,7+3,6 | 90,1+0,5 | 90,3+0,4 | 92,0+0,9 |
| CD13 | 98,4+0,9 | 94,0+4,9 | 95,6+6,0 | 97,6+1,8 |
| CD11b | 0,8+0,5 | 37,6+10,0* | 32,5+4,3* | 1,2+0,1 |
| CD38 | 11,3+13,3 | 60,9+0,3* | 35,4+10,4* | 1,1+0,9 |
| CD15 | 85,6+4,5 | 44,6+28,3* | 45,2+21,5* | 49,3+13,1* |
| CD18 | 7,5+8,9 | 16,6+10,2 | 37,7+45,6 | 17,6+23,6 |
| CD54 | 2,8+0,1 | 70,0+8,6* | 78,1+4,4* | 8,7+7,6 |
| CD14 | 0,4+0,4 | 9,5+2,7 | 71,2+1,3* | 3,6+2,0 |
| CD71 | 20,1+16,1 | 6,2+3,1 | 3,9+1,4 | 12,1+11,3 |
Примечание: *p≤0,05
ПТРК также вызывает увеличение экспрессии адгезивной молекулы CD54 в 25 раз, миелоидного антигена CD11b в 47 раз, специфического маркера промоноцитов и моноцитов СD14 в 24 раза с одновременным уменьшением гранулоцитарного маркера CD15 в 2 раза. Замещение популяции CD15 клеток популяцией CD14 клеток можно расценить как коммитирование миелоидных предшественников в сторону гранулоцитарного и моноцитарно/макрофагального рядов. Это отражается в повышении, как фагоцитарной активности, так и люминесценции, значения которых, однако, не позволяют говорить о терминальной дифференцировке до зрелых фагоцитов (табл. 3). Кроме того, ПТРК вызывает снижение CD71 в 3,2 раза, значительное увеличение фракции покоящихся клеток G0/G1-74,1% и обеднение фракции делящихся и синтезирующих клеток S - 18,0% и G2/M - 7,9%.
Под действием ДМСО фенотипический профиль клеток HL60 меняется аналогично ПТРК. Экспрессия CD33 и CD13 колеблется в пределах контроля, зато увеличивается в 3 раза экспрессия СD38, в 41 раз - CD11b и в 178 раз - CD14. Одновременно с этим происходит в 2 раза уменьшение экспрессии CD15. Все это говорит о сходстве экспрессии дифференцировочных антигенов на клетках HL60 под действием ДМСО и ПТРК. Результатом может быть неполная гранулоцитарная и/или относительно более выраженная моноцитарная дифференцировка, о чем свидетельствует соотношение популяций CD14 и СD11b клеток. Процент фагоцитирующих клеток того же порядка, что и при действии ПТРК, хотя свечение при стимуляции зимозаном в случае ПТРК выше.
Таблица 3.
Фагоцитарная активность и хемилюминесценция клеток линии HL60 после применения различных индукторов дифференцировки
| Агент | Концентрация, мкг/мл | Фагоцитирующие клетки, % | Люминесценция, % | ||
| Без сыворотки | С сывороткой | Без стимуляции | Зимозан | ||
| - | - | 1,6+0,7 | 4,2+0,8 | 0,741+0,2 | 0,883+0,2 |
| ПТРК | 0,3 | 17,8 | 68,5 | 1,802 | 80,0 |
| ДМСО | 13000 | 14,6+7,7 | 61,9+8,9 | 1,103+0,3 | 19,03+3,1 |
| Dcr | 2,1 | 2,9 | 8,5 | 0,750 | 5,478 |
| 0,2 | 2,3 | 12,5 | 0,665 | 3,740 | |
| 21,0 | 2,3 | 10,7 | 0,681 | 3,694 | |
| 142,8 | 3,0 | 14,4 | 1,022 | 2,918 | |
Действие Dcr на фенотип клеток HL60 отличается от ПТРК и ДМСО по отсутствию влияния на экспрессию гранулоцитарного маркера CD11b при подавлении экспрессии CD38 в 10 раз. Dcr также вызывает уменьшение экспрессии CD15 в 2 раза и увеличение экспрессии CD14 в 9 раз, а CD54 в 4 раза. Сдвиг дифференцировки ранних предшественников миелоидного и лимфоидного ростка CD38 клеток на несколько ступеней под действием Dcr способствует дифференцировке CD15 клеток, коммитированных в сторону моноцитарного/макрофагального ростка до промоноцитов, что сопровождается слабым повышением фагоцитарной активности клеток (табл. 4). Кроме того, Dcr снижает экспрессию маркера CD71 в 2 раза и приводит к накоплению G0/G1-клеток со снижением доли S-клеток и G2/M до 6,9 и 40,7%, соответственно.
Исследование фенотипического профиля и функциональную активность клеток ОПЛ человека линии NB4 и HL60 под влиянием индукторов дифференцировки позволяет заключить, что все агенты запускают дифференцировку клеток, причем терминальную – только ПТРК. Как и следовало ожидать, клетки NB4, в которых присутствует аберрантная форма рецептора ретиноевой кислоты RAR-α, оказались наиболее чувствительными к действию ПТРК. Это объясняется механизмом действия ПТРК, который подробно описан в обзоре литературы. ДМСО в отличие от ПТРК только существенно сдвигает дифференцировку NB4 в сторону гранулоцитов и/или моноцитов. Dcr в широком диапазоне концентраций способен запускать дифференцировку на дискретном этапе ранних миелоидных предшественников. При этом модуляция экспрессии антигена CD33 в клетках лейкоза NB4 свидетельствует о том, что, скорее всего, происходит сдвиг блока дифференцировки на несколько ступеней.
Таблица 4.
Влияние ПТРК, ДМСО, Dcr на распределение клеток NB4 и HL60 по фазам клеточного цикла
| Агент | Концентрация, мкг/мл | Фазы клеточного цикла | |||||
| NB4 | HL60 | ||||||
| G0/G1 | G2/M | S | G0/G1 | G2/M | S | ||
| Без индуктора | - | 40,06% | 1,35% | 58,59% | 47,13% | 10,78% | 42,09% |
| ПТРК | 0,3 | 47,88% | 8,44% | 43,68% | 74,1% | 7,85% | 18,0% |
| ДМСО | 13000 | 68,37% | 3,56% | 28,04% | 92,79% | 2,32% | 4,89% |
| Dcr | 2,1 | 43,2% | 0,97% | 55,83% | 52,41% | 6,92% | 40,68% |
Изучение цитодифференцирующих свойств различных индукторов на экспериментальных гемобластозах in vivo
Изучение ЦДА и их комбинаций на модели дифференцирующегося развившегося п/к ЭБФ (рис. 3) показало (табл. 5), что в монорежиме ПТРК, Dcr и РФН кратковременно ингибируют рост лейкоза. Достоверный максимальный эффект наблюдается сразу после окончания лечения и затем в течение 6 с. ПТРК вызывает плохо воспроизводимый эффект, ТРО=50-71% (p≤0,05 только в одном опыте), а РФН и Dcr - воспроизводимый эффект, ТРО=64-66% (p≤0,05) и 73-78% (p≤0,05), соответственно. Эти данные подтверждают, что ПТРК и РФН в монотерапии не способны ингибировать опухоли больших размеров, что согласуется с данными литературы [Уоррел Р.П., 2002]. Dcr по характеру действия близок как обоим индукторам, но также как РФН оказывает хорошо воспроизводимое ингибирующее действие. При гистологическом изучении результатов цитодифференцирующей терапии Dcr, ПТРК и РФН в п/к ЭБФ показано (табл. 6), что при применении ЦДА в монорежиме наибольшие изменения по зоне некроза вызывал РФН, менее активным был Dcr, самым слабым – ПТРК. По степени ингибирования митоза в клетках ЭБФ более выраженное действие оказали РФН и Dcr. По индукции апоптоза все ЦДА оказались практически одинаковыми. Показано, что все агенты вызывали дифференцировку клеток ЭБФ (табл. 6), при чем Dcr и РФН индуцировали лимфоидную и миелоидную дифференцировку клеток, а ПТРК – только лимфоидную.
Таблица 5.
Эффективность монотерапии ПТРК, Dcr или РФН п/к трансплантированного ЭБФ в серии опытов
| Препарат | Разовая доза** | Суммарная доза | ТРО% на сутки после лечения | ||
| Контроль (физ. р-р) | 0,2 мл/мышь | 1,0 мл/мышь | 1-4 | 6-7 | 9-11 |
| ПТРК | 0,3 мг/кг | 1,5 мг/кг | 50-71* | 57 | 15-50 |
| Dcr | 4,5 мг/кг | 22,5 мг/кг | 61-78* | 73* | 40-53 |
| РФН | 10 тыс. МЕ/кг | 50 тыс. МЕ/кг | 58-66* | 64* | 39-68 |
Примечания: *различия с контролем достоверны, p<0,05; **введение на 2-6 сутки после трансплантации
Таблица 6.
Влияние монотерапии ПТРК, РФН и Dcr на морфологические показатели ЭБФ через сутки после лечения
| Показатели, % | Контроль | Dcr | ПТРК | РФН |
| Бластные | 95,0 | 85,0 | 90,0 | 85,0 |
| Лимфоидые | 3,0 | 10,0 | 8,0 | 10,0 |
| Гранулоциты | 2,0 | 5,0 | 2,0 | 5,0 |
| Клетки с фигурами митзов | 1,5-2,0 | 0,5-1,0 | 1,5-2,0 | 0,5-1,0 |
| Клетки с признаками апоптоза | 0,5 | 1-1,5 | 1-1,5 | 1-1,5 |
| Площадь некрозов | 5-10 | 10-20 | 10-15 | 20-30 |
Примечание: *препараты вводили на 2-6 сутки после трансплантации гемобластоза.
Комбинированное лечение п/к ЭБФ проводили по 2-м схемам с одновременным или последовательным введением препаратов. Дозы препаратов и режим их введения при этом не менялись (2-6 сутки). Результаты опытов с одновременным введением ПТРК, РФН и Dcr показали (табл. 7А), что самой эффективной комбинацией оказалась РФН+Dcr, причем эффект был устойчивым и стабильным в течение 9-18 суток после окончания терапии ТРО=77-85%. При сочетании Dcr+ПТРК ингибирующий эффект не превышал 69-71% и был менее длительным – 9 дней после отмены лечения. Увеличение суммарной дозы РФН+ПТРК при пролонгировании лечения было неэффективным. Отсутствие терапевтического выигрыша при одновременном введении Dcr и ПТРК было расценено как следствие возможной конкуренции 2-х миелоидных индукторов дифференцировки за мишень.
При введении Dcr первым (табл. 7Б) эффективность Dcr+ПТРК реализуется на уровне ТРО%=48-63% (p≥0,05). Отсутствие эффекта при введении ПТРК первой может быть следствием общей мишени на клетках. Эффективность комбинации реализуется за счет Dcr, РФН ничего не добавляет. При начале терапии с РФН введение Dcr пролонгирует эффект и удерживает его на достоверном уровне (ТРО%=61-67%, p≤0,05). Эффект гистологически верифицирован (табл. 8) и показано, что при сочетании Dcr с ПТРК или с РФН индуцируется выраженная лимфоидная и миелоидная дифференцировка с существенным перераспределением бластных клеток в сторону лимфоидного ростка.
Таблица 7.
Эффективность комбинированной терапии с использованием ПТРК, РФН и Dcr на ЭБФ
| А.Одновременное введение препаратов в серии опытов
Примечания: *p≤0,05, **введение на 2-6 сутки после трансплантации. | Б. Последовательное введение препаратов
Примечание: *p0,05; **I курс терапии на 2-6 сутки, II курс – на 7-11 сутки после перевивки опухоли. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Таблица 8.
Влияние двойных комбинаций ПТРК, РФН и Dcr на морфологические показатели ЭБФ в зависимости от последовательности их введения (1 и 6 сутки после окончания лечения)
| Вид клеток, % | Контроль | Dcr+ПТРК | ПТРК+Dcr | Dcr+РФН | РФН+Dcr | |||||
| 1 | 6 | 1 | 6 | 1 | 6 | 1 | 6 | 1 | 6 | |
| Бластные | 95,0 | 80,0 | 90,0 | 80,0 | 80,0 | |||||
| Лимфоидые | 3,0 | 15,0 | 8,0 | 15,0 | 15,0 | |||||
| Гранулоциты | 2,0 | 5,0 | 2,0 | 5,0 | 5,0 | |||||
| Клетки с фигурами митозов | 1,5-2,5 | 0,5-1,0 | 2,0-2,5 | 0,5-1,5 | 0,5-1,5 | |||||
| Клетки с признаками апоптоза | 0,5 | 1,5-2,0 | 0,5-1,0 | 1-1,5 | 1-1,5 | |||||
| Площадь некрозов | 15-20 | 20-25 | 15-20 | 20-30 | 5-10 | 20-30 | 30-40 | 30-40 | 40-50 | |
Примечание: *препараты вводили на 2-6 сутки после трансплантации гемобластоза.
Более значительные гистологические изменения получены при монотерапии Dcr или ПТРК, а также при различных их сочетаниях независимо от последовательности введения. На основании данных терапевтических опытов (динамика показателей эффективности ТРО и Т/С) и гистологических исследований п/к ЭБФ после применения Dcr, ПТРК и РФН в монорежиме и в различных комбинациях следует считать перспективными для дальнейшего изучения комбинации Dcr и РФН в прямой и обратной последовательности введения, а также Dcr и ПТРК с введением первым Dcr. Неудачи при комбинации Dcr и ПТРК могут быть следствием общих мишеней для их цитодифференцирующего действия.
Изучение дифференцирующих свойств различных индукторов на клетках меланомы человека
Показано, что клетки MS без воздействия (контроль) растут в центре более компактно, чем на периферии. Цитоплазма большинства клеток, особенно на периферии, относительно светлая, ее насыщенность зернистыми гранулами выражена слабо реже умеренно. Видно, что на 100-200 клеток приходится ~50% клеток со слабой насыщенностью цитоплазмы мелкими зернами, 30% - с умеренной и 20% - с высокой.
Таблица 9.
Влияние ПТРК и Dcr на степень мелкогранулярной зернистости в цитоплазме клеток меланомы человека линии MS
| Группа | Концентрация | Процент клеток с мелкогранулярной зернистостью различной степени | ||
| Высокая | Умеренная | Слабая | ||
| Контроль | - | 20 | 30 | 50 |
| ПТРК | 1х10-6М | 60 | 30 | 10 |
| Dcr | 1х10-4М - 1х10-5М | 60 | 30 | 10 |
При добавлении ПТРК (табл. 9) в центре клетки лежат компактно. На периферии клетки образуют синцитий, соединяясь друг с другом с помощью отростков. Клетки полиморфные, преимущественно, удлиненной формы. Ядра округлые или овальные. Однако насыщенность цитоплазмы гранулярной зернистостью увеличивалась, о чем свидетельствует следующее перераспределение клеток: ~10% со слабой насыщенностью, 30% - с умеренной и 60% - с высокой. При добавлении Dcr (табл. 9) независимо от величины концентрации в клетках MS отмечали появления мелкозернистых гранул. В мазках видно, что на периферии клетки растут в виде синцития, в центре более компактно. Они преимущественно удлиненной формы, с отростками, которые соединяются друг с другом. Встречаются крупные клетки иногда с несколькими ядрами. Цитоплазма клеток во многих участках препарата насыщена мелкой зернистостью, при этом доля клеток со слабой насыщенностью зернистости не превышает 10%, с умеренной - 30%, а с высокой 60%. Контроль образования неспецифической зернистости в клетках MS показал, что после УФ-облучения только в чашках с клетками, обработанными ПТРК и Dcr, появилось потемнение ростовой среды. Таким образом, ПТРК в концентрации 1х10-6M и Dcr в концентрациях 1х10-4M и 1х10-5M способны вызвать 3-кратное увеличение фракции клеток меланомы человека MS с высокой степенью мелкогранулярной зернистости, что можно расценивать как запуск дифференцировки клеток по пути пигментообразования.
На клетках меланомы B16 и меланомы Mel5 изучено влияние Dcr и ИН-А отдельно и в комбинации. Dcr (табл. 10) в концентрациях 0,01-100,0 мкМ обнаружил дозозависимый возрастающий во времени значительный и устойчивый антипролиферативный эффект, который проявлялся замедлением роста клеток В16 в микроколониях в течение 72 ч. Максимальный эффект зарегистрирован при 100,0 мкМ, последовательное уменьшение клеток через 24-48-72 часа инкубации с препаратом снизилось до 33,7-17,7-16,9%, соответственно. После добавления в культуру 7 МЕ/мл ИН-А (табл. 14) содержание клеток в колониях сначала возросло до 112,1%, а затем по срокам снизилось до 38,6% и 33,1%, соответственно. При 70 МЕ/мл содержание клеток уменьшалось до 68,8-31,8-28,4%, соответственно, а при 700 МЕ/мл - до 36,9-24,3-22,6%, соответственно. Выживаемость клеток колебалась в пределах 89-103% и практически не отличалась от контроля. Таким образом, аналогично Dcr ИН-А в концентрации 7-700 МЕ/мл вызывал дозозависимый антипролиферативный эффект в клетка меланомы B16. При совместном добавлении в культуру клеток Dcr и ИН-А (табл. 15) антипролиферативный эффект усиливался. Сочетание 1,0 мкМ Dcr и 7,0 МЕ/мл ИН-А через 48 ч после инкубации приводило к уменьшению числа клеток до 26,1%, что было почти вдвое меньше, чем при добавлении препаратов отдельно в тех же концентрациях.
Таблица 10.
Влияние Dcr и/или ИН-А на пролиферацию клеток мышиной меланомы В16
| Группа | Концентрация в среде | Число клеток/микроколонию (% от контроля) на срок после добавления препарата | |
| 24 ч | 48 ч | ||
| Контроль | - | 100,0 | 100,0 |
| Dcr | 1,0 мкМ | 44,6 | 43,6 |
| 10 мкМ | 36,5 | 31,4 | |
| РФН | 7,0 МЕ/мл | - | 50,2 |
| 70,0 МЕ/мл | - | 44,5 | |
| 700,0 МЕ/мл | 35,8 | 29,0 | |
| Dcr+РФН | 1,0 мкМ+7,0 МЕ/мл | - | 26,1 |
| 10,0 мкМ+70,0 МЕ/мл | - | 16,0 | |
| 1,0 мкМ+700,0 МЕ/мл | 21,5 | 18,3 | |
| 10,0 мкМ+700,0 МЕ/мл | 16,2 | 13,0 | |
Сочетание 10,0 мкМ Dcr и 70,0 МЕ/мл ИН-А уменьшало содержание клеток в колониях через 48 ч до 16%, что также было вдовое меньше, чем при каждом из препаратов в этих концентрациях в отдельности. Таким образом, сочетание Dcr и РФН в диапазоне изученных концентраций привело к повышению антипролиферативного эффекта каждого из комбинантов почти в 2,0 раза через 48 ч инкубации.
На клетках меланомы человека Mel5 показано (табл. 11), что при 0,01 мкМ Dcr в те же сроки количество клеток в микроколониях уменьшалось до 92,7-68,9-58,4%, соответственно. Максимальный эффект наблюдался при 100,0 мкМ Dcr, количество клеток уменьшалось до 43,8-29,7-25,9%, соответственно. Выживаемость микроколоний при всех использованных концентрациях Dcr оставалась на уровне контрольных значений 91-100% (табл. 16). При добавлении 7,0 МЕ/мл ИН-А в течение 72 ч после количество клеток снижалось от 86,2% до 49,3%. При добавлении 70,0 МЕ/мл число клеток уменьшалось до 54,5-40,1-37,4%, соответственно. После 700,0 МЕ/мл число клеток уменьшалось до 43,1-29,7-27,7%, соответственно срокам. Выживаемость колоний клеток Mel5 была на уровне интактных клеток 96-100% (табл. 16).
На клетках Mel5 комбинация 0,01 мкМ Dcr и 7,0 МЕ/мл ИН-А при одновременном добавлении в среду дала низкий эффект. При этом число клеток варьировало в пределах 47-50% в течение 72 ч. Улучшить эффект удавалось путем увеличения концентрации одного из препаратов. Максимальное ингибирование до 23,9-30,7% было только при высоких концентрациях обоих препаратов (табл. 11).
Таблица 11.
Влияние Dcr и/или ИН-А на пролиферацию клеток меланомы человека Mel5
| Группа | Концентрация препаратов в среде | Число клеток/микроколонию (% от контроля) на срок после добавления препарата | ||
| 24 ч. | 48 ч. | 72 ч. | ||
| Контроль | - | 100 | 100 | 100,0 |
| Dcr | 0,01 мкМ | 84,2 | 73,6 | 70,2 |
| 1,0 мкМ | 69,0 | 50,0 | 49,1 | |
| ИН-А | 7,0 МЕ/мл | 111,3 | 94,8 | 73,0 |
| 70,0 МЕ/мл | 53,7 | 51,9 | 48,8 | |
| Dcr+ИН-А | 0,01 мкМ+7 МЕ/мл | 79,1 | 49,1 | 46,9 |
| 0,01 мкМ+70 МЕ/мл | 40,5 | 34,9 | 31,7 | |
| 1,0 мкМ+7 МЕ/мл | 54,7 | 36,9 | 33,3 | |
| 1,0 мкМ+70 МЕ/мл | 30,7 | 24,5 | 23,9 | |
Примечание: критерий оценки – задержка роста микроколоний.
Таким образом, опыты по изучению дифференцирующего действия Dcr, ИН-А и ПТРК на клетки различных вариантов меланомы показали, что Dcr и ИН-А в относительно высоких концентрациях дозозависимо замедляют пролиферацию клеток, не влияя на их выживаемость. Сочетание Dcr и ИН-А усиливает ингибирующий эффект. ПТРК и Dcr в относительно низких концентрациях индуцируют образование мелкогранулярной зернистости в клетках меланомы MS. Замедление скорости пролиферации и запуск меланинсинтезирующей функции клеток отдельных видов меланомы животных и человека, которые проявляются при достижимых концентрациях всех 3-х указанных агентов, свидетельствуют о неспецифическом цитодифференцирующем действии. Анализ полученных результатов показал, что Dcr и ИН-А близки по уровню антипролиферативной активности и относительно высоким ингибирующим концентрациям, но, возможно, имеют разные мишени на клетке, т.к. их сочетание приводит к существенному усилению ингибирования пролиферации. Аналогично для Dcr и ПТРК получено восстановление меланинсинтезирующей функции в клетках меланомы, но без существенного влияния на интенсивность роста клеток и их морфологию. Результаты опытов in vitro не однозначны, т.к. не всегда действие агентов сопровождается замедлением пролиферации или остановкой роста клеток. Поскольку указанные эффекты реализуются при достижимых in vivo концентрациях, была проведена серия опытов с изучением эффективности всех 3-х ЦДА на перевиваемых меланомах животных и человека.
Изучение эффективности комбинированной терапии меланомы животных и человека под влиянием цитодифференцирующих агентов
Изучение эффективности комбинаций проведено на перевиваемых меланомах В16, Mel7 и Mel6. Для химиотерапии использованы ЦП и DTIC, входящие с основные схемы лечения диссеминированной меланомы [Носов Д.А., 2001 г.; Переводчикова Н.И., 2005 г.]. В качестве ЦДА использованы РФН, который используется в схемах адъювантной химиотерапии меланомы, а также Dcr в разовых доз от 0,5 до 4,5 мг/кг при разных схемах лечения. Показано (табл. 12), что меланома В16 чувствительна к Dcr (ТРО=69-93%, p≤0,05) при всех изученных дозах. Прослежена зависимость ингибирующего действия от величины разовой дозы при 5-кратном курсе: при увеличении дозы от 1,5 до 4,5 мг/кг ТРО возрастало от 69 до 93%. При 30-кратном введении увеличение разовой дозы также сопровождалось возрастанием ТРО с достоверным УПЖ=41% (p≤0,05). Аналогичные результаты получены при 15-кратном введении Dcr в разовой дозе 4,5 мг/кг.
Таблица 12.
Оптимальные дозы и схемы введения Dcr на меланоме В16
| Разовая доза, число введений | Максимальный противоопухолевый эффект | |||
| Суммарная доза, мг/кг | УПЖ% | ТРО% | Сохранение эффекта | |
| 0,5 мг/кг x 10 | 5,0 | 1 | 29 | - |
| 1,5 мг/кг x 5 | 7,5 | - | 69* | +* |
| 4,5 мг/кг x 5 | 22,5 | - | 93* | +++ |
| 4,5 мг/кг x 13 | 58,5 | - | 93* | +++ |
| 0,5 мг/кг x 30 | 15,0 | 19 | 78* | + |
| 1,5 мг/кг x 30 | 4,5 | 13 | 61* | + |
| 4,5 мг/кг x 30 | 13,5 | 41* | 91* | +++ |
Примечания: *p≤0,05; (+) - 7 дней.
В серии экспериментов с различными схемами применения Dcr установлено (табл. 12), что хорошо воспроизводимые от опыта к опыту результаты можно получить при применении разовых доз Dcr 1,5-4,5 мг/кг в режиме 5-30 дневных курсов введения (диапазон курсовых доз 22,5-58,5 мг/кг). При этом следует ожидать наступления максимального ответа опухоли на 10-13 сутки от начала лечения с сохранением достоверного эффекта в случае продолжения лечения. Эти схемы и были использованы в комбинированной терапии. Гистологическое и ДНК-цитометрическое исследования показали (табл. 13), что под влиянием Dcr в п/к трансплантированной меланомы В16 происходит существенное снижение доли пролиферирующих клеток в срезах в 1,2-2,0 раза и в популяции в 1,8 раз. Гибель клеток путем апоптоза и некроза возросла в 2 раза относительно контроля. Указанные изменения плюс накопление клеток в стационарной G0/G1 фазе клеточного цикла (90% против 82% в контроле) возрастали при продолжении введения препарата. На эти же сроки наблюдалось снижение доли пролиферирующих клеток в S- и G2/M-фазах почти в 2 раза. Полученные результаты свидетельствовали о том, что Dcr реализует лечебный патоморфоз в меланоме В16 путем перераспределения клеток из пролиферирующей фракции в стационарную, которое проявляется в снижении их митотической активности, усилении процесса апоптоза и увеличении зоны некроза.
Таблица 13.
Влияние Dcr на патоморфологические показатели и популяционный состав клеток
меланомы B16
| Показатели (%) | Контроль | Dcr | ||||
| Сутки после трансплантации опухоли | ||||||
| 10 | 15 | 20 | 10(4)* | 15(2)* | 20(7)* | |
| Площадь некроза | 10,0-15,0 | 20,0-30,0 | 25,0-30,0 | 15,0-20,0 | 50,0-60,0 | |
| Митозы | 2,0-3,0 | 2,0-3,5 | 1,5-2,0 | 1,0-1,5 | ||
| Апоптоз | 0,1-0,2 | 0,2-0,4 | ||||
| G0/G1 | 86,0±8,0 | 87,0±7,3 | 82,0±7,1 | 88,0±9,0 | 89,0±9,1 | 90,0±9,2 |
| S | 7,0±1,1 | 7,0±0,9 | 9,0±0,8 | 6,0±0,7 | 6,0±0,5 | 5,0±0,7 |
| G2/M | 7,0±0,9 | 6,0±1,0 | 9,0±1,0 | 6,0±0,6 | 5,0±0,6 | 5,0±0,4 |
Примечание: *(4) – через 4 суток после 1 курса; (2) и (7) – через 2 и 7 суток после 2 курса лечения, соответственно.
Изучение комбинации Dcr+ЦП показало (табл. 14) более высокий эффект в сравнении с монохимиотерапией ЦП, как по ингибированию первичного узла меланомы В16 с длительным снижением скорости роста опухоли, ТРО%=85-88% против ТРО%=29-48%, так и по выживаемости мышей, УПЖ%=38% против УПЖ%=15%. Dcr реализовал в этом эксперименте свойства модификатора эффективности цитостатика. Все эффекты достоверны по отношению к контролю, p<0,05.
На п/к ксенографтах Mel6 Dcr был изучен в монорежиме в диапазоне разовых доз от 1,0 м/кг до 4,5 мг/кг при длительном (5-10 дней) пероральном введении. Первый вариант меланомы представляет собой гистологически слой полиморфных активно пролиферирующих (частота митозов 3-5%) и слабо пигментированных клеток (1-3-%). В течение 48 ч наблюдается незначительное увеличение пигментации клеток с ИИМ=5,1 и до ИИМ=8,2. Опухоль имеет слабо развитую строму, низкую долю апоптотирующих клеток (0,1-0,2%), площадь некрозов небольшая (1-5%). Показано (рис. 4), что 5-дневный курс Dcr в разовой дозе 1 мг/кг оказывает слабое кратковременное рост-ингибирующее действие (T/C%=80-96%). При гистологическом исследовании установлено (табл. 15), что уже через 12 ч после отмены препарата площадь некроза в опухоли увеличивается в 3-6 раз по сравнению с контролем, и в течение следующих 48 часов гибель клеток от некроза продолжается, и площадь некроза достигает 8-10%. Однако при этом не меняется митотическая активность клеток (частота митозов 3-5%) и лишь незначительно увеличивается доля апоптотических клеток до 2-3% только к концу наблюдения.
Таблица 14.
Эффективность терапии Dcr, ЦП и их комбинации на мышиной меланоме B16
| | Препарат | Разовая доза | Суммар- ная доза | Vt/Vt-1% на сутки после трансплантации опухоли | ТРО, % На сутки после лечения | УПЖ% | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| | 14 | 17 | 21 | 4 | 9 | 12 | 16 | |||||
| | Контрольфиз. р-р | 0,2 мл | 1 мл | 8,3 | 1,9 | 1,9 | ||||||
| | Dcr | 1,5 мг/кг | 15 мг/кг | 6,1 | 1,9 | 1,9 | 3 | 29 | 29 | 26 | 1 | |
| | ЦП | 3 мг/кг | 9 мг/кг | 8,4 | 2,1 | 1,7 | 49* | 48 | 41 | 48 | 15* | |
| | Dcr + ЦП | 1,5 мг/кг + 3 мг/кг | 15 мг/кг + 9 мг/кг | 6,8 | 2,3 | 2,5 | 85* | 88* | 85* | 81* | 38* | |
| | | |||||||||||
 Рис. 4. Динамика роста п/к ксенографта меланомы человека Mel6 под действием Dcr |
Таким образом, Dcr в течение 48 ч после окончания 5-дневного курса увеличивает в 2,2 раза по показателю ИИМ степень дифференцировки опухолевых клеток меланомы Mеl6 и в 1,3 раза количество меланосом в клетках и число содержащих меланосомы клеток.
Цитодифференцирующая активность Dcr, показателем которой является усиление меланинсинтезирующей функции клеток меланомы человека Mel6, была также подтверждена цитологическими исследованиями. Было показано, что Dcr в дозе 4,5 мг/кг вызывает статистически достоверное увеличение доли меланинсодержащих клеток в 3 раза по сравнению с контролем при 21-дневном курсе введения. Цитометрический анализ популяционного состава клеток показал (табл. 15), что Dcr в разовой дозе 1 мг/кг при 5-кратном курсе вызывает достоверное накопление опухолевых клеток в стационарной фазе клеточного цикла G0/G1. После прекращения введения Dcr задержка клеток в фазе G0/G1 прослеживается, по крайней мере, в течение 48 ч. Слабые изменения в пролиферирующей S-популяции опухолевых клеток были статистически не достоверны.
Таблица 15.
Влияние Dcr на патоморфологические показатели, популяционный состав и
интенсивность меланиногенеза в клетках меланомы человека Mel6
| Показатели | Срок после курса Dcr | |||||
| 12 ч | 24 ч | 48 ч | ||||
| Контроль | Dcr | Контроль | Dcr | Контроль | Dcr | |
| Площадь некроза, % | 1-2 | 6-7 | 2-3 | 7-9 | 3-5 | 8-10 |
| Митоз, % | 3-5 | 3-5 | 3-5 | 3-5 | 3-5 | 3-5 |
| Апоптоз, % | 0,1-0,2 | 0,1-0,2 | 0,1-0,2 | 0,2-0,3 | 0,1-0,2 | 0,2-0,3 |
| Клетки с пигментом, % | 1-2 | 2-3 | 1-2 | 2-4 | 2-3 | 3-5 |
| G0/G1 | 27,3±2,5 | 35,9*±2,9 | 30,4±2,2 | 39*±2,3 | 27,1±2,8 | 35,1*±4,5 |
| S+G2/M | 15,6±1,6 | 18,2*±2,3 | 16,4±2,0 | 18*±1,9 | 15,1±3,5 | 16,4±3,1 |
| Число клеток с меланосомами (на 500 клеток) | 135,0 | 175,0 | 144,0 | 210,0 | 159,0 | 227,0 |
| Среднее число меланосом на одну клетку | 19,0 | 28,0 | 21,0 | 35,0 | 26,0 | 42,0 |
| ИИМ | 5,1 | 9,8 | 6,0 | 14,7 | 8,2 | 19,0 |
Примечание:*p≤0,05
Анализ эффективности комбинации 1,5 мг/кг Dcr + 100 тыс. МЕ/кг РФН показал (табл. 16), что для достижения воспроизводимого ингибирующего эффекта (T/C=57-66%) минимально достаточно 5-дневного курса лечения. Продолжение лечения не приводит к усилению эффекта. Терапевтический выигрыш комбинации по сравнению с монотерапией каждым из препаратов отсутствует.
Применение 4,5 мг/кг Dcr при длительном курсе лечения п/к ксенографтов меланомы человека Mel7 (рис. 5) дало высокий ингибирующий эффект T/C=51% (p≤0,05), верифицированный по увеличению некротической (в 1,5-2 раза) и апоптотической (в 2-5 раз) гибели клеток при гистологическом исследовании.
Таблица 16.
Эффективность терапии Dcr, РФН и их комбинации на меланоме человека Mel6
| Препарат | Разовая доза | Суммар- ная доза | Vt/Vt-1 на сутки после трансплантации опухоли | T/C%* на сутки после лечения | |||||||
| 19(II) | 23(III) | 28(IV) | 32 (V) | I | II | III | IV | V | |||
| Контроль | 0,2 мл | 4,2 мл | 2,7 | 2,1 | 1,6 | 1,4 | |||||
| Dcr | 1,5 мг/кг | 31,5 мг/кг | 4,7 | 2,1 | 2,1 | 1,4 | 57 | 97 | 100 | 133 | 131 |
| РФН | 100 тыс МЕ/кг | 500 тыс. МЕ/кг | 3,9 | 1,8 | 2,4 | 1,4 | - | 57 | 50 | 74 | 76 |
| Dcr + РФН | 1,5 мг/кг + 100 тыс. МЕ/кг | 31,5 мг/кг + 500 тыс. МЕ/кг | 2,7 | 1,6 | 1,8 | 1,5 | 66 | 64 | 49 | 57 | 60 |
Примечание: *I- 5 сутки введения Dcr, II - 8 сутки введения Dcr и 5 сутки – РФН; III – 12 сутки введения Dcr и 4 сутки после курса РФН; IV – 17 сутки введения Dcr и 9 сутки после курса РФН; V – 21 сутки введения Dcr и 13 сутки после курса РФН.
 Рис. 5. Влияние Dcr на динамику роста ксенографтов меланомы человека Mel7 |
Таблица 17.
Влияние Dcr на патоморфологические показатели и популяционный состав меланомы человека Mel7
| Показатели | Контроль | Dcr | ||||
| Сутки после трансплантации опухоли | Сутки после лечения* | |||||
| 15(I) | 20(II) | 22(III) | I | II | III | |
| Площадь некроза, % | 8-10 | 15-20 | 20-25 | 15-20 | 20-30 | 25-35 |
| Митоз, % | 1,5-2,0 | 1,5-2,5 | 3,0-4,0 | 1,0-1,5 | 0,5-1,0 | 0,5-1,0 |
| Апоптоз, % | 0,2-0,3 | 0,2-0,3 | 0,2-0,3 | 0,3-0,5 | 0,5-1,0 | 1,0-1,5 |
| G0/G1, % | 65,3±4,5 | 84,0±3,6 | 84,0±3,0 | 81,3±1,1 | 78,0±4,5 | 85,3±1,5 |
| S, % | 10,6±0,6 | 11,0±3,6 | 7,7±1,5 | 10,3±1,5 | 11,3±2,1 | 7,7±1,1 |
| G2/M, % | 24,0±4,0 | 8,3±0,6 | 8,3±1,5 | 9,0±0,6 | 14,0±3,6 | 7,0±1,0 |
| ИП | 35,0±4,5 | 18,7±3,2 | 16,0±3,0 | 18,7±1,1 | 25,3±1,5 | 14,7±1,5 |
Примечание: *I – через 1 суток после 5-кратного введения; II и III – через 1 и 3 сутки после 10-кратного введения, соответственно.
Результаты лечения п/к ксенографтов Mel7 с использованием DTIC 200 мг/кг с 10 по 12 сутки и Dcr 4,5 мг/кг с 10 по 14 сутки после трансплантации показали (табл. 18) достоверно более высокое ингибирование опухоли, чем монохимиотерапия, (Т/С=3% против 5%, p<0,05) с достижением регрессии опухоли и увеличением продолжительности жизни мышей (УПЖ=29%). Важно, что Mel7 отвечала на монотерапию каждым комбинантом, но была высоко чувствительной к одному из наиболее высокоэффективных противомеланомных средств DTIC. Однако его применение без Dcr было достоверно менее эффективно по всем использованным показателям, т.к. привело к достоверно более слабому ТРО, более низкому УПЖ=21% и не вызвало регрессии опухоли.
Таким образом, на различных моделях меланомы животных и человека выявлена эффективность индукторов дифференцировки: известного препарата РФН и нового - Dcr и установлены оптимальные дозы и режимы применения. Показано, что терапевтический эффект РФН в отношении пигментированной меланомы человека Mel6 реализуется при разовой дозе 100 тыс. МЕ/кг при 5-дневном курсе лечения и проявляется в незначительном и кратковременном ингибировании роста опухоли.
Таблица 18.
Эффективность DTIC и/или Dcr при лечении мышей Balb/c nude с п/к ксенографтами меланомы человека Mel7
| Группа | Разовая доза, мг/кг | Суммар ная доза, мг/кг | Т/C% | Vt/Vt-1 | УПЖ, % | |||||||
| на сутки после окончания лечения | ||||||||||||
| I | II | III | IV | I | II | III | IV | |||||
| Контроль | - | - | - | - | - | - | 9,8 | 4,1 | 5,1 | 2,0 | ||
| DTIC | 200 | 600 | 33* | 23* | 13* | 5* | 3,2 | 2,7 | 2,8 | 0,8 | 21 | |
| Dcr | 4,5 | 22,5 | 66* | 60* | 62* | 79 | 6,4 | 3,7 | 5,2 | 2,6 | 5 | |
| DTIC+Dcr | 200+4,5 | 600+22,5 | 37* | 13** | 9* | 3** | 3,6 | 1,5 | 3,4 | 0,6 | 29* | |
Примечание: DTIC вводили ежедневно на 10-12 сутки после трансплантации опухоли; Dcr - ежедневно на 10-14 сутки отдельно или в комбинации с DTIC на 13-17 сутки после трансплантации опухоли;
I – 1 сутки после окончания лечения DTIC, II – 1 сутки после окончания лечения Dcr, III – 1 сутки после окончания лечения DTIC+Dcr, IV – 4 сутки после окончания лечения DTIC+Dcr;
*отличие достоверно относительно контроля, p≤0,05;
**отличие достоверно относительно группы DTIC, p≤0,05.
Терапевтический эффект Dcr реализуется при пероральном применении в разовых дозах 1,5-4,5 мг/кг в режиме 5-30 дневного курса и характеризуется ингибированием роста подкожных узлов на 51-93%, в ряде случаев с увеличением продолжительности жизни мышей на 29-41%. Для мышей с меланомой В16 оптимальной является схема применения Dcr в разовых дозах 1,5-4,5 мг/кг с введением в течение 15-30 дней. Эффективные суммарные дозы должны быть более 22,5 мг/кг. Для мышей с ксенографтами меланомы человека оптимальной схемой является длительное (не менее 5-10 дней) введение в разовой дозе 4,5 мг/кг. Более высокую чувствительность мышиной меланомы В16 к действию Dcr можно объяснить отсутствием иммунологического компонента эффекта препарата у иммунодефицитны мышей. Во всех экспериментах с моделями меланомы терапия РФН или Dcr не вызывала каких-либо побочных или токсических эффектов. Механизм ингибирующего противомеланомного действия изучен только для нового препарата Dcr. Его действие иллюстрирует распределение клеток по фазам клеточного цикла и их функциональное состояние (способность к меланиногенезу, активность митозов и апоптоза). Для всех 3-х использованных моделей меланомы показано, что Dcr реализует своей ингибирующий эффект путем усиления в 1,5-6,0 раз некротической гибели опухолевых клеток и в 1,5-5,0 раз активности апоптоза. Комбинированная химиотерапия ЦП в сочетании с последующим введением цитодифференцирующего препарата Dcr в разовой дозе 1,5 мг/кг при лечении пигментированной метастазирующей мышиной меланомы В16 оказалась достоверно более эффективной в сравнении с монохимиотерапией как по торможению роста опухоли на 63-76%, так и в 2 раза по выживаемости мышей. Примененный в субтерапевтической разовой дозе Dcr реализовал в этом эксперименте свойства модификатора эффективности цитостатика. При комбинированном лечении пигментированной меланомы человека Mel6 одновременное использование 2-х цитодифференцирующих агентов Dcr в разовой дозе 1,5 мг/кг и РФН в сравнении с монотерапией каждым из препаратов, хотя и не позволило добиться высокого противоопухолевого эффекта, но способствовало уменьшению прогрессии опухоли за счет длительной стабилизации роста в течение по меньшей мере 2-х недель после окончания терапии. Dcr и РФН проявили синергизм при лечении меланомы. Комбинированная химиотерапия DTIC беспигментной метастазирующей меланомы человека Mel7 в сочетании с последующим введением Dcr в разовой дозе 4,5 мг/кг достоверно более эффективна, чем монохимиотерапия. Это выражалось в усилении ингибирования роста опухоли в 1,5 раза, частичной регрессии опухоли и увеличении продолжительности жизни мышей на 29%.
Эти данные свидетельствуют о том, что цитодифференцирующая терапия меланомы с использованием РФН или Dcr эффективна в отношение РФН моделей животных и/или человека. РФН проявляет синергизм с Dcr при лечении меланомы. Dcr оказывает противомеланомное действие в широком диапазоне доз при длительном пероральном применении путем перераспределения клеток из пролиферирующей фракции в стационарную, снижения их митотической активности, усиления процесса апоптоза и увеличения зоны некроза а также увеличения степени дифференцировки клеток путем интенсификации меланиногенеза. Поскольку Dcr прошел клинические испытания по 1 фазе, выявленная его противомеланомная активность дает основания для клинического испытания препарата в монорежиме по 2 фазе в качестве средства поддержания ремиссии у пациентов исчерпанными возможностями лечения. Для повышения эффективности интерферонотерапии может быть рекомендована комбинация с одновременным применением РФН и Dcr. Эффективность комбинированной химиотерапии ЦП или DTIC в сочетании с Dcr (применение между курсами химиотерапии) может служить основанием для клинических испытаний в качестве средства повышения эффективности лечения у пациентов с диссеминированной меланомой.