Вирусологические исследования морских прибрежных вод

Вид материала

Документы

Содержание Результаты и обсуждение Список используемой литературы

Подобный материал:

• Записка Исполнительного секретаря, 595.39kb.
• Правовая охрана и использование морских живых ресурсов в национальных законодательствах, 444.4kb.
• Методические рекомендации по формализованной комплексной оценке качества поверхностных, 53.08kb.
• Рекомендации Международной научной конференции «Современное состояние водных биоресурсов, 132.94kb.
• Информационное письмо №1 Организационный комитет сообщает Вам, что в сентябре 2011, 22.5kb.
• Очистка сточных вод на морских и речных судах, 13.11kb.
• Высшего Арбитражного Суда рф, материалы судебной практики, а также специальная литература, 9326.42kb.
• Методы очистки сточных вод, 28.89kb.
• Задание на проектирование Свидетельство №П. 037. 26. 1319. 07. 2010, 1040.95kb.
• Математика. Естественные науки 78. Айбулатов Н. А. История прибрежных исследований, 1151.9kb.

Вирусологические исследования морских прибрежных вод.

Луценко Е.С.

г. Мурманск, МГТУ


Сведения о морском виропланктоне, куда входят самые многочисленные среди других гидробионтов организмы с размерами от 0.02 до 0.2 мкм (Sieburth, 1979), находятся в настоящее время в стадии накопления. В группу представителей этой размерной фракции помимо микоплазм, фильтрующихся форм спирохет, бактериальных клеток минимальных размеров, сходных с риккетсиями, включены и вирусные частицы (Мишустина и др.,1985), отличающиеся, прежде всего, большой экологической пластичностью и, соответственно, большим адаптивным потенциалом к быстро изменяющимся условиям окружающей среды.

Выявлено, что численность вирусных частиц в водоеме зависит от сезона, температуры среды, солености и многих других факторов (Muscillo et al.,1997; Noble, Fuhrman, 2001; Sigari, Losi, 1999), а выживаемость при низких температурах может повышаться, составляя для большинства из них зимой не менее 56, а летом не менее 30 дней (Мишустина и др.,1985).

Основная масса вирусов гидросферы представлена бактериофагами – группой вирусов, паразитирующих на бактериях (Современная…,2005). Привнесенные с пресными стоками в морскую среду, они способны адаптироваться к новым условиям с изменением спектра хозяев, что может привести к непредсказуемым последствиям для гидробионтов (Степанова, 2004).

В зависимости от типа вызываемой у бактерий инфекции бактериофаги делят на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги дают литическую продуктивную инфекцию, в результате чего образуется новая генерация фагов. Максимально возможное количество адсорбировавшихся на клетке-хозяине вирусных частиц может достигать сотен штук. В модельных экспериментах было показано, что выход колифага (его урожай) из одной инфицированной клетки E.coli в среднем составлял 47 частиц (Шлегель, 1987). Их количественное определение обычно проводят прямым методом электронной микроскопии и непрямыми методами наиболее вероятного числа и агаровых слоев по А. Грациа – визуально устанавливая формирование на плотных средах, засеянных клетками хозяина, участков лизиса, т.н. негативных колоний или бляшек (Лабинская, 1978). Число фаговых частиц при этом выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ). Одна БОЕ соответствует наименьшей концентрации вирусов, которая образует одну бляшку на монослое гомологичных фагу клеток. Необходимо отметить, что ныне существующие непрямые методы количественного учета вирусных частиц в водоемах достаточно трудоемки и разработаны лишь для санитарно-микробиологического анализа питьевой воды.

Единичные исследования вирусов в прибрежных районах Баренцева моря были предприняты в семидесятых годах прошлого века (Трунова и др., 1977). С тех пор изучение этой составной части виропланктона не проводилось. Существующие микробиологические данные (Пономарева, 1978; Перетрухина, 2001; Молчановский, 2002) свидетельствуют о наличии в распресненных зонах прибрежных морских акваторий бактерий аллохтонного происхождения, позволяющих предположить присутствие в морской воде и соответствующих им бактериофагов.

Целью нашей работы явилось: выявить наличие бактериофагов в морской воде, определить их численность, получить картину распределения фагов по акватории южного колена Кольского залива - наиболее подверженного действию пресного стока. Исходя из микробиологических показателей, оценить состояния его водной среды. В связи с этим в весенний (с 24 марта по 14 апреля) и летний (с 5 по 19 июня) периоды 2006 года была проведена серия микробиологических наблюдений на стационарных точках расположенных вдоль восточного и западного берега южной части залива.


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДы

Пробы воды отбирали с поверхностного горизонта стерильной стеклянной емкостью, с придонного - пластиковым батометром Нискина, предварительно обработанным спиртом. Координаты станций отбора проб: ст.1 (68°58′ с.ш. и 33°04′ в.д.), ст.2 (68°59′ с.ш. и 33°02′ в.д.), ст.3 (68^о57' с.ш. и 33^о02' в.д.). Всего было отобрано 14 проб и проведено 52 анализа. Отбор проб морской воды проводился в светлое время суток и был приурочен к последней фазе приливного цикла. Микробиологический анализ включал: количественный учет колифагов на среде СПА с паспортизованной тест-культурой E.coli (МУК 4.2.1018-01), определение численности их предполагаемых хозяев – бактерий группы кишечной палочки (БГКП) на среде Кесслера, общее микробное число (ОМЧ) аллохтонных (при 37^оС) и автохтонных (при 20^оС) микроорганизмов на среде СПА. Количество вирусных частиц выражали в бляшкообразующих единицах (БОЕ) в 100 мл, сапрофитных бактерий - в колониеобразующих единицах (КОЕ) в мл.


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе отработки методов учета вирусных частиц предварительный анализ показал их наличие в пробах морской воды отобранных в весенний период. Косвенным указанием на незначительные количества бактериофагов явился факт их выделения из проб лишь после дополнительной процедуры подсева гомологичной культуры-хозяина.

Численность предполагаемых бактерий-хозяев для бактериофагов (БГКП) в морской воде исследуемого периода в среднем составляла десятки клеток в мл при общем содержании автохтонных и аллохтонных микроорганизмов тысячи и сотни кл/мл соответственно.

Количественное определение фагов в южной части залива проводилось на трех исследуемых станциях в летний период, где их численность в среднем составила десятки БОЕ в 100мл (табл.1). В четырех пробах из десяти она превышала показатель 16.1 являющийся максимальным в используемых расчетных таблицах по применяемым нами методическим указаниям. При разбросе значений в один порядок, максимумы содержания бактериофагов регистрировались в поверхностном, минимумы - в придонном слоях. Известно, что вирусонейтрализующая способность морской воды пропорциональна степени ее минерализации (Микробиология …,1976). В этой связи, полученные нами количественные показатели фагов для придонного горизонта можно объяснить исходя из показателей солености водных масс южной части Кольского залива составивших за исследуемый период 33.1‰.

В распределении колифагов поверхностного горизонта акватории южного колена Кольского залива была выявлена их большая приуроченность к станциям восточного берега – наиболее подверженного загрязнению городскими мало очищенными промышленно-бытовыми стоками.

Показано, что суммарная численность различных типов вирусных частиц в прибрежной воде, определяемая при помощи электронной микроскопии, достигала 10^7-8 в одном мл (Hara,Koike,1990). С учетом действия разбавления приливными явлениями стоков привносимых в Кольский залив, полученные нами численные значения для колифагов в поверхности, превышающие показатель 16.1 БОЕ/100мл, могут рассматриваться как значительные.


Таблица 1.

Данные бактерио- и вирусологических исследований морской воды южного колена Кольского залива в июле 2006г.

Дата отбора	Точка отбора	Горизонт	БГКП, кл/мл	ОМЧ 37*С, КОЕ/мл	ОМЧ 20*С, КОЕ/мл	Бактерио-фаги, БОЕ/100 мл
05.07.06	Станция 1	Пов-ть	45	160	740	16.1
12.07. 06	Станция 1	Пов-ть	25	1480	2730	9.3
12.07.06	Станция 2	Пов-ть	9	350	610	0
13.07.06	Станция 3	Пов-ть	25	940	2300	> 16.1
13.07.06	Станция 1	Пов-ть	9	550	1970	> 16.1
13.07.06	Станция 1	Дно	9	60	330	9.3
18.07. 06	Станция 3	Пов-ть	75	940	6320	> 16.1
19.07.06	Станция 2	Пов-ть	450	290	1820	> 16.1
19.07.06	Станция 1	Пов-ть	4	180	880	16.1
19.07.06	Станция 1	Дно	0	420	660	16.1

Численность предполагаемых клеток-хозяев (БГКП), гомологичных выделенным фагам в поверхностном горизонте трех станций за исследуемый период колебалась от единиц до десятков клеток в мл, составляя в придонном слое единицы клеток в мл. При сравнении численности этой группы аллохтонных бактерий в поверхностном слое ст.2 и придонном слое ст.1 их показатели практически совпадают. Исключением явилась проба от 19 июля, когда число БГКП достигло в 1 мл 450 клеток.

При анализе полученных результатов зависимости количества фаговых частиц от числа БГКП в акватории залива выявлено не было. Максимальные показатели числа БОЕ выявлялись в пробах как с высокой (сотни кл/мл), так и с низкой (единицы кл/мл) концентрацией гомологичных фагам бактерий.

Общее число учитываемых в нашей работе аллохтонных сапрофитных бактерий в поверхностном горизонте исследуемых станций, выращенных при 37°С, в среднем составило сотни КОЕ/мл изменяясь от 60 до 1480 КОЕ/мл. В придонном слое этот показатель уменьшился и в среднем составил 240 КОЕ/мл. ОМЧ автохтонных сапрофитов, выращенных при 20°С, изменялись в поверхности от 330 до 6320 КОЕ/мл в среднем составив 2170 КОЕ/мл. В придонном слое его величина в два раза превысила показатели для аллохтонных бактерий.

На рис.1 приведена гистограмма соотношений аллохтонной и автохтонной микрофлоры поверхностного горизонта в исследуемых точках южной части залива. В работе по годовому микробиологическому мониторингу вод Кольского залива (Перетрухина, 2003) указано на достаточный потенциал самоочищения его экосистемы, позволяющий ей справиться с антропогенной нагрузкой в виде неочищенных бытовых стоков. В нашей работе количество автохтонных микроорганизмов в 3.6 раз превышает количество привнесенной с бытовыми сточными водами микрофлоры, что так же свидетельствует о существующих возможностях самоочищения экосистемы залива от биологического загрязнения.




Рис. 1. Количество аллохтонной и автохтонной микрофлоры в поверхностном слое южной части Кольского залива в летний период 2006г.


Оцененная в наших исследованиях по южному колену залива численность аллохтонных бактерий почти на порядок ниже в полученной ранее работе (Молчановский, 2002). Причиной этому, возможно, послужил факт отбора проб воды без учета фаз приливо-отливного цикла, играющего важную роль в процессе элиминации привнесенной микрофлоры.


ЗАКЛЮЧЕНИЕ


В ходе отработки метода непрямого определения числа вирусных частиц в весенний период были выявлены незначительные количества бактериофагов в морской воде южной части Кольского залива. Микробиологические исследования летнего периода показали наличие в отдельных пробах колифагов в количестве, превышающем 16.1 БОЕ в 100мл. Максимальные численности вирусных частиц были приурочены к поверхностному горизонту станций вдоль восточного берега залива.

По количеству выделяемых фаговых частиц, степени загрязнения бактериями кишечной группы и обсемененности воды аллохтонной микрофлорой исследуемую акваторию залива условно можно разделить на три зоны: сильно загрязненной считать поверхностный слой ст. 3, средней степени загрязненности – поверхностные слои ст. 1 и ст. 2, условно чистой – придонный слой ст. 1.

Даже с учетом методологических ограничений непрямого определения числа вирусных частиц длительность их сохранения в низкотемпературных условиях морской среды в сравнении с гомологичными им бактериями позволяет использовать фаги в качестве более чувствительного индикатора биологического загрязнения. О потенциальной возможности экосистемы залива ему успешно противостоять свидетельствует превышение численности автохтонной микрофлоры над аллохтонной.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Sieburth J.McN. Sea microbes. - N.Y., Oxford Univ. Press, 1979.
   
2. Мишустина И. Е., Щеглова И. К., Мицкевич И. Н. Морская микробиология. Учеб. пособие. - Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 1985. 181 с.
   
3. Muscillo et al. Enteric virus detection in Adriatic seawater by cell culture, polymerase chain reaction and polyacrylamide gel electrophoresis // Water res. – 1997. - 31, N8. – P. 1980 – 1984.
   
4. Noble R. T., Fuhrman J. A. Enteroviruses detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction from the coastal waters of Santa Monica Bay, California: low correlation to bacterial indicator levels // Hydrobiologia. – 2001. 460, N 1-3. – P. 175 – 184.
   
5. Sigari G., Losi E. Gastroenteritis and hepatitis A viruses in mussels // Ig. Mod. – 1999. – 111, N 3. – P. 225 – 238.
   
6. Современная микробиология. Прокариоты: в 2-х томах. Т. 1.- М.: Мир, 2005. 656 с.
   
7. Степанова О. А.. Экология аллохтонных и автохтонных вирусов Черного моря. - Севастополь: «Мир», 2004. с.308.
   
8. Шлегель Г. Общая микробиология.- М.: Мир, 1987. 567 с.
   
9. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. – М.: Медицина, 1978. 394 с.
   
10. Трунова О.Н., Молчановская Т.И., Пилипас Н.И. Санитарное состояние прибрежной зоны Баренцева и Белого морей в связи с хозяйственно-бытовыми и нефтяными загрязнениями. – Апатиты: изд-во КНЦ РАН, 1977. с.3-11.
    
11. Пономарева Л.В. Санитарно микробиологическая характеристика Кольского залива. Автореф. дисс. канд. биол. наук. Саратов, 1978. 65 c.
    
12. Перетрухина А.Т. Микробиологический мониторинг водных экосистем Кольского Заполярья. Автореф. докт. дисс. М.: МГУ, 2001. 59 с.
    
13. Молчановский И. А. Санитарно-микробиологическая характеристика Кольского залива и оценка его способности к самоочищению //Материалы XX юбилейной конференции молодых ученых Мурманского морского биологического института, (г. Мурманск, апрель 2002 г.). – Мурманск: ММБИ КНЦ РАН, 2002. с. 111-114.
    
14. Методические указания 4.2.1018-01. Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды. - М.: Минздрав России, 2001. С. 17-24.
    
15. Микробиология загрязненных вод. /Под ред. Р. Митчелла. - М.: Медицина, 1976. 323 с.
    
16. Hara S., Koike J. Abundance of bacterial phage in the ocean // Abstr. 5^th Int. Symp. Microb. Ecol., Kyoto. August 27 – September 1, 1989. – Kyoto, 1990. – P. 161.
    
17. Перетрухина И.В. Изучение соотношения распределения и сезонной динамики бактериопланктона с ведущими биотическими факторами среды обитания // Материалы Всесоюзной научно-технической конференции «Наука и образование - 2003». (Мурманск, 2-16 апреля 2003г.). – Мурманск: МГТУ, 2003. с. 191 – 195.