Geum.ru

Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита 03. 00. 06 вирусология

Вид материалаАвтореферат диссертации
Поведение популяции ВКЭ при смене хозяина
Подобный материал:
1   2   3   4   5

Поведение популяции ВКЭ при смене хозяина



Как было показано в табл. 1, адаптированный к клещам вариант М образовывал мелкие (<1 мм) бляшки в культуре клеток СПЭВ, при чем на 100 мелких бляшек практически всегда можно было обнаружить 1-2 крупные бляшки. Из популяции варианта М были клонированы крупная и мелкие бляшки (табл. 8) в культуру клеток СПЭВ. После первого же пассажа клоны, которые были взяты при клонировании как мелкая бляшка, приобретали крупнобляшечный или смешанный фенотип. При следующем пассаже в культуре клеток вирус, образующий крупные бляшки, вытеснял мелкобляшечный вариант. Для устранения примеси мелкобляшечного вируса были сделаны дополнительные клонирования. При клонировании отбирали крупные бляшки. Только после 3 клонирований точечные бляшки при титровании перестали появляться. Новые клоны 160/57, 118/58, и 103/84 образовывали в культуре клеток СПЭВ бляшки, похожие на бляшки родительского штамма ЭК-328, которые к 8 дню достигали размера 6-8 мм и продолжали расти в течение всeго периода наблюдения. Клон 116/59 образовывал бляшки диаметром 4-5 мм. В параллельных экспериментах было предпринято клонирование для получения мелкобляшечного вируса. Только в результате четырех клонирований мелких бляшек были получены клоны 424 и 298, которые практически не содержали в популяции крупнобляшечных вариантов.

Оценка свойств вирионов клонов, полученных из популяции варианта М клонированием методом бляшек, показала, что крупнобляшечные клоны

Таблица 8. Характеристика клонов, выделенных из популяции варианта М в культуре клеток СПЭВ

вирус
Диаметр бляшки до выделения
Диаметр бляшки, мм

на 8 сутки*

клон 57
1 мм
тчк:4:7=(1:1:7)

клон 58
1 мм
7

клон 59
1 мм
4

клон 83
1 мм
7:3:тчк=(2:2:1)

клон 84
5 мм
тчк:7 = (2:1)

клон 86
5 мм
7

ЭК-328



7

вариант М



тчк:7 = (100:1)

* - в скобках указано соотношение бляшек разного размера; тчк - точечного размера, т.е. <1мм.


восстановили свойства родительского штамма ЭК-328, а мелкобляшечные клоны сохранили характеристики варианта М. Вирионы клонов 160/57, 118/58, 103/84 и 116/59 обладали ГА, а также образовывали преципитат с АТ в РИЭФ, направленный к катоду (рис. 7). Клоны 424 и 298, подобно варианту М, не обладали ГА и в РИЭФ не образовывали подобной ракеты.


Рисунок 8. Анализ с помощью РИЭФ антигенных структур ВКЭ, накапливающихся в КЖ клеток СПЭВ, инфицированных клонами из популяции варианта М. 1 – клон 118/58, 2 – клон 116/59, 3 – клон 103/84, 4 – клон 160/57, 5 – клон 298.



анод
катод


Для клонов, полученных из популяции варианта М и прошедших 3-4 пассажа в культуре клеток СПЭВ, была определена нуклеотидная последовательность генов белка Е, а также фрагментов РНК, включающих позиции, где были выявлены различия между штаммом ЭК-328 и вариантом М. Мелкобляшечный клон 298 сохранил аминокислотные остатки в белке Е, характерные для варианта М (табл.9). Все крупнобляшечные клоны имели треонин в позиции 426, как у штамма Эк-328. Следовательно, эта позиция имеет прямое отношение к реверсии свойств полученных нами клонов.


Таблица 9. Фенотипические и генетические свойства клонов, выделенных из популяции варианта М.

вирус
фено тип
кол-во клонирований
19нт 5’НТО
42нт 5’НТО

1

prM
64 E
122 E
124 E
2190

нт E
426 E
2362нт E
52 NS2A
22 NS4A
41 NS4A

ЭК-328
Э



a
c
A
K
E
K
c
T
t
K
S
R

Вариант M
M



g/а
a
V
K
G
K
t
I
c
N
G
K

160/57
Э
3
а
а
V
K
G
E
t
T
c

N
G
K

118/58
Э
3
а
а
V
K
E
K
t
T
с
N
G
K

116/59
Э
3
g
a
V
K
G
Q
t
T
с
N
G
K

103/84
Э
1
a
a

V
Q
G
K
t
T
c
N
G
K

клон 298
M
4
g
a
V
K
G
K
t
I
c

N
G
K

клон 424
M
4
н/о
н/о
н/о
K
G
K
t
I
c

н/о
н/о
н/о

н/о – не оценивали; прописные буквы – аминокислоты, строчные – нуклеотиды.

Фенотип: Э - размер бляшек, свойства вирионов, как у штамма ЭК-328; М - размер бляшек, свойства вирионов, как у варианта М.


Как говорилось выше, замена в позиции 122 у варианта М приводит к повышению положительного заряда белка Е. У клона 118/58, который, как и штамм Эк-328, образовывал крупные бляшки в культуре клеток СПЭВ и давал преципитат с АТ в РИЭФ, мы наблюдали обратную замену глицина на глютаминовую кислоту. У трех клонов 160/57, 116/59 и 103/84, также обладающих фенотипом штамма ЭК-328, в позиции 122 сохранялся глицин, как у варианта М. Тем не менее, у клона 160/57 появлялась замена лизина на глутаминовую кислоту в позиции 124. У клона 116/59 в той же позиции лизин заменялся на глутамин, а у клона 103/84 аналогичная замена лизина на глутамин появлялась в позиции 64. Эти замены приводят к снижению положительного заряда. Как видно на рис. 3, у крупнобляшечных клонов способность связываться с ГС была даже несколько ниже, чем у штамма ЭК-328. Это свидетельствует о том, что замены в позициях 124 и 64 являются компенсирующими. У всех клонов нуклеотиды в позициях 2190 и 2362 совпадали с таковыми у варианта М, т.е. эти клоны являются истинными ревертантами. Вне зависимости от фенотипа все клоны, полученные из варианта М, имели те же аминокислотные остатки в сигнальной последовательности PrM и в белках NS2a и NS4a, что и вариант М, т.е. эти замены, по-видимому, не имеют прямого отношения к описанному фенотипу. Представленные данные не позволяют сделать однозначного заключения о роли замены в позиции 19 в 5'-НTO в изменении характеристик варианта М, но очевидно, что эта замены не могут определять свойства вирионов этого вируса.

Таким образом, при репродукции варианта М в культуре клеток СПЭВ образуется большой спектр ревертантов с различными компенсирующими заменами. Анализ ревертантов, полученных при выделении клонов из популяции варианта М, показал, что характерный для адаптированного к клещам варианта М фенотип определяется двумя заменами в белке Е в позициях 122 и 426, а также определенную роль может играть замена в позиции 19 5'-НТО.

Для клонов 160/57, 118/58, 116/59, и 103/84 провели оценку нейровирулентности и НИ для мышей линии BALB/c разного возраста (табл. 10). Клоны 118/58 и 116/59 восстановили НИ, однако у клонов 160/57 и 103/84 НИ осталась низкой. Клоны 160/57 и 116/59 имеют разные компенсирующие замены в позиции 124, клон 118/58 является обратным ревертантом, а клон 103/84 имеет компенсирующую замену, как клон 116/59, но в позиции 64. При этом, а.к. замены в других позициях у всех этих клонов одинаковы. Таким образом, отличия в НИ клонов варианта М, обладающих всеми другими фенотипическими признаками, свойственными родительскому штамму ЭК-328, могут быть связаны с конкретной аминокислотной заменой и ее позицией в белке Е, хотя также нельзя полностью исключить связь с заменами в других не изученных нами областях генома. Представленные данные позволяют предположить, что вирулентность вируса может определяться аффинностью связывания вирионов с рецепторами на каких-то определенных клетках, и компенсирующие замены модулируют взаимодействие с этими рецептороми.

Способность высоковирулентных вирусов персистировать в ЦНС была проверена на одном из клонов из популяции варианта М, восстановившим свою НИ. При и/п заражении мышей сублетальной дозой клона 116/59 3 мыши не заболели, а у 2 мышей развились параличи. На 6 неделе они полностью выздоровели. У всех животных, не заболевших и выздоровевших, на фоне иммунодепрессии, вызванной введением ЦФ, развития заболевания не наблюдалось, и инфекционный вирус в мозге не выявлялся. При проверке методом ОТ-ПЦР оказалось, что у всех мышей в мозге присутствует вирусная РНК. Таким образом, учитывая отсутствие клинических признаков заболевания и отдаленные сроки после начала инфекции, можно утверждать, что клон 116/59 в сублетальной дозе вызвал у них персистентную инфекцию.

Таблица 10. Вирулентность клонов варианта М для мышей линии BALB/c разного возраста.

Вирус
Вирулентность для мышей

Мыши 6 г

БОЕ /ЛД50

Мыши 12 г

БОЕ /ЛД50

и/ц
и/ц
и/п

ЭК-328
2
0,5
16

Вариант M
0,4
2,5

250000

клон 160/57
8
0,3
>500

клон 118/58
1,6
1,6
2,5

клон 116/59
1
0,3
1

клон 103/84
6,3
2
>500


Таким образом, мы показали, что варианты ВКЭ, обладающие повышенной аффинностью связывания с ГАГ, а также варианты, ревертировавшие по этому свойству как за счет обратной, так и за счет различных компенсирующих замен, могут вызывать все типы инфекций: инаппарантную, острую и персистентную.

Было изучено поведение популяции варианта М в пассажах in vitro и in vivo. Для оценки стабильности популяции варианта М при пассажах в культуре клеток СПЭВ была выбрана схема, предусматривающая пассирование вируса в двух режимах: три независимых линии вели таким образом, что КЖ инфицированных клеток брали для следующего пассажа до наступления ЦПД (24-36 ч после начала инфекции), а 3 линии – после наступления ЦПД (48-72 ч). Для всех линий пассажей 2 раза материал был заморожен между пассированием. Таким образом, было сделано 12 пассажей линий с ЦПД и 20 пассажей для линий без ЦПД. Полученные вирусы были оттитрованы методов бляшек.

Во всех линиях количество крупных бляшек увеличилось уже на первых пассажах до 7-10% и при дальнейшем пассировании колебалось от пассажа к пассажу, но оставалось на данном уровне. Во всех 6 линиях вирус не приобрел способности формировать направленный к катоду преципитат вирионов с АТ в РИЭФ. Для одной из линий, пассированной без выраженного ЦПД, была определена нуклеотидная последовательность в областях генома, где были найдены замены между штаммом ЭК-328 и вариантом М. Только в позиции в 5’НТО у пассированного в культуре клеток СПЭВ вируса наблюдали реверсию к штамму ЭК-328. НИ этого вируса повысилась до 600 БОЕ/ЛД50, однако не достигла уровня, свойственного штамму ЭК-328.

Полученные данные показывают, что в отличие от заражении с низкой множественностью, когда вирус клонировали из бляшки, при пассажах адаптированного к клещам варианта М в культуре клеток СПЭВ без выраженного эффекта "бутылочного горлышка" формируется стабильная гетерогенная популяция с содержанием 7-10% крупнобляшечного варианта.

При пассировании варианта М через мозг юных мышей наблюдали постепенное нарастание количества крупных бляшек. К 12 пассажу соотношение крупных и мелких бляшек было 1:1. Полученный вирус был назван RNm. Вирионы этого вируса нерегулярно образовывали катодный преципитат с АТ в РИЭФ. Секвенирование фрагмента РНК варианта RNm, кодирующего белок Е, показало, что он сохранил нуклеотидную последовательность варианта М (табл.10). Тогда из популяции варианта RNm были выделены 2 крупнобляшечных клона 46 и 48. Вирионы всех клонов вели себя в РИЭФ, как вирионы штамма ЭК-328. При секвенировании генов Е этих клонов было установлено, что все они имели нуклеотидную последовательность, аналогичную таковой родительского штамма ЭК-328, включая нуклеотиды в позициях 2190 и 2362, по которым вариант М отличается от родительского штамма Эк-328. У этих клонов и в позиции 9888 был уридин, как у штамма Эк-328. Аминокислотные замены могут иметь адаптивный характер и ревертировать при изменении селективного воздействия, однако, реверсия трех н.т. замен в разных частях генома крайне маловероятна, и их можно использовать в качестве маркера, позволяющего различить вариант М и штамм ЭК-328. Таким образом, крупнобляшечные клоны, выделенные из популяции варианта М, переадаптированного к мозгу белых мышей, оказались примесью родительского штамма ЭК-328, сохранившейся в популяции варианта М в процессе 17 пассажей через клещей. Это показывает, что ВКЭ может существовать в виде гетерогенной популяции не только при репродукции в клетках млекопитающих, но и в клещах.

В одном из экспериментов взрослые мыши линии BALB/c были и/п инфицированы 10000 БОЕ варианта М. Несколько мышей заболело. На пике болезни у них были взяты кровь и мозг. При титровании сгустка крови и мозговой суспензии методом бляшек была выявлена гетерогенность вирусной популяции. Соотношение крупных и мелких бляшек было примерно 1:1. Их этих популяций были изолированы крупнобляшечные клоны 51, 53 и 56. Вирионы всех клонов вели себя в РИЭФ как вирионы штамма ЭК-328. Секвенирование гена Е показало, что все эти клоны являются истинными ревертантами. Аминокислотные остатки в позициях 122 и 426, были как у штамма ЭК-328, но они сохранили н.т. замены, по которым вариант М отличается от штамма ЭК-328. Это свидетельствует о том, что при репродукции адаптированного к клещам варианта М in vivo изменение структуры популяции может идти за счет появления ревертантов.


Таблица 10. Характеристика ревертантов, появляющихся в популяции варианта М при пассажах in vivo.



вирус
Характеристика вируса и источник выделения клонов
Размер бляшек


РИЭФ*
замены в гене белка Е

несиноним.
синоним.

122
426
2190
2362

Эк-328
-
5-6
+
Glu
Thr
C
T

вариант M
-
<1mm
-
Gly
Ile
T
C

RNm
11 пассажей вариантаМ через мозг мышей
5mm:<1mm=1:1
+/-
Gly
Ile
T
C

Клон 46
RNm
5
+
Glu
Thr
C
T

Клон 48
RNm
5
+
Glu
Thr
C
T

Клон 51
Кровь от заболевшей мыши после и/п введения варианта М
5
+
Glu
Thr
T
C

Клон 53
мозг от заболевшей мыши после и/п введения варианта М
5
+
Glu
Thr
T
C

Клон 56
мозг от заболевшей мыши после и/п введения варианта М
5
+
Glu
Thr
T
C

*- + - наличие катодного преципитата вирионов с АТ, - отсутствие катодного преципитата вирионов.

Далее мы попытались оценить влияние данных вирусов друг на друга при одновременной репродукции. Для этого клетки СПЭВ были инфицированы раздельно и смесью вирусов, взятых в разных соотношениях. Полученное потомство оценивали по соотношению крупных и мелких бляшек при титровании в культуре клеток СПЭВ, а также по его поведению в РИЭФ. Очевидно, что такой эксперимент может дать только приблизительные данные о соотношении вирусов с разными фенотипами в популяции. Тем не менее, было поставлено 3 подобных эксперимента, и во всех были получены сходные результаты. Данные одного из этих экспериментах приведены в табл. 11. При равном количестве штамма Эк-328 и варианта М в инокуляте при средней множественности заражения вирусы с разным фенотипом не мешают репродукции друг друга, а при низкой множественности титры варианта М даже увеличиваются. При этом при определенных соотношениях вирусов в инокуляте вариант М может снижать титры штамма Эк-328 и наоборот.

Необходимы тщательные исследования по изучению взаимодействия описанных вирусов при смешанной инфекции на генетическом уровне, а также изучение механизмов описанной интерференции и комплементации. Тем не менее, этот эксперимент и результаты обратных пассажей адаптированного к клещам варианта М показывают, что в клетках млекопитающих ВКЭ может длительно существовать в виде стабильной гетерогенной популяции, в которой присутствует как варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции в клетках млекопитающих, так и варианты, имеющие преимущества при репродукции в членистоногих.

При выделении мелкобляшечных клонов из популяции варианта М, т.е. при создании эффекта «бутылочного горлышка», в результате 1 пассажа в культуре клеток мы получили целый набор ревертантов с обратными и различными компенсирующими мутациями. Это свидетельствует о том, что образование мутантов является при определенных условиях частым событием при репродукции ВКЭ. Нельзя исключить, что подобные мутанты в следовых количествах могут возникать и длительно существовать в любой популяции, тем не менее, за счет интерференции основной популяции они так и остаются в следовых количествах. При клонировании селективное давление основной популяции снижается, и это приводит к резкому изменению структуры популяции с преобладанием более приспособленного к данным условиям варианта вируса.

Очевидным является вопрос. Если адаптация ВКЭ к клещам приводит к появлению таких мутантов с ГАГ-связывающим фенотипом, то подобные вирусы должны постоянно выявляться в клещах. Естественно нельзя ожидать, что все изоляты ВКЭ, выделенные из клещей, должны обладать таким фенотипом, поскольку неизвестно, на какой стадии адаптации в клещам находится этот вирус и как быстро такой вариант может отбираться в клещах в природных условиях, поскольку ВКЭ может длительное время циркулировать в популяции клещей без попадания в млекопитающих на счет трансфазовой или трансовариальной

Таблица 11. Характеристика вирусного потомства при смешанной инфекции клеток СПЭВ вариантом М и штаммом Эк-328 , взятых в разных соотношениях.


Инокулят-множественность заражения (БОЕ/клетку)
Вирусное потомство

Общая
Эк-328
М вариант
Титр вируса lgБОЕ/мл
РИЭФ***

общий
Эк-328*
вариантМ**

1,000
1,000
-
7,6
7,6
-
+

0,100
0,100
-
7,3
7,3
-
+

1,000
-
1,000
6,7
-****
6,7
-

0,100
-
0,100
6,7
-****
6,7
-

0,010
-
0,010
6,7
-****
6,7
-

1,000
0,500
0,500
7,1
7,1
6,7
+

0,550
0,500
0,050
7,1
7,1
5,5
+

0,550
0,505
0,005
6,3
6,3
-
+

0,550
0,050
0,500
6,7
6,0
6,7
-

0,100
0,050
0,050
7,1
7,1
8,5
-



* - оценивали по количеству крупных бляшек; ** - оценивали по количеству точечных бляшек; *** - + - наличие катодного преципитата вирионов, - отсутствие катодного преципитата вирионов. В предварительных экспериментах было показано, что вирионы штамма ЭК-328, полученные при концентрировании КЖ, содержащей 6lgPFU, образуют катодный преципитат с АТ в РИЭФ. **** - как отмечалось ранее, так и данном эксперименте, при титровании варианта М иногда на фоне большого количества точечных бляшек можно было выявить 1-2 крупные бляшки.


передачи. Из клещей, собранных в разных регионах России, часто выделяют вирусы с мелкобляшечным фенотипом. Нами были просмотрено более 100 вируссодержащих клещевых суспензий, выделенных в разных регионах РФ. Более половины имели мелкобляшечный фенотип или представляли собой смешанную популяцию, которая в процессе лабораторных пассажей через мозг белых мышей или в культуре клеток СПЭВ превращались в вирусы с крупными бляшками (Карганова, 1991; Погодина и др., 1991; Карганова и др., 1992, 1994; неопубликованные данные). Часть из них были изучены подробнее, и было показано, что их свойства близки свойствам варианта М, в том числе у этих вирусов отсутствует ГА, вирионы не образуют преципитаты с АТ в РИЭФ. Естественно, нужны специальные исследования, чтобы установить, что представляют собой изоляты ВКЭ из клещей с мелкобляшечным фенотипом, связана ли мелкая бляшка с особенностями связывания вирионов в ГАГ клетками, и какую роль в их возникновении играет длительность пребывания в клещах. Тем не менее, очевидно, что в природной популяции в клещах циркулируют вирусы, обладающие фенотипом, близким адаптированному в лабораторных условиях к клещам варианту М, который представлен в данной работе.

Полученные данные относятся к лабораторной модели, которая не может быть просто экстраполирована на природную популяцию вируса КЭ. Тем не менее, описанный нами полиморфизм популяции вируса КЭ позволяет объяснить его способность к быстрой адаптации к новому хозяину. Схематично это можно объяснить следующим образом. Быстрое размножение вируса в новом хозяине осуществляется за счет активной репродукции либо уже присутствующих в популяции, либо вновь возникших мутантов, приспособленных к репродукции именно в этом виде хозяина. При этом основная популяция не может подавлять репродукцию этих мутантов, т.к. новый хозяин является для нее непермиссивной системой. При этом, по-видимому, наиболее неожиданные мутанты могут быть получены при репродукции вируса в совершенно новом хозяине, с которым этот вирус еще не встречался. Представленные нами данные показывают, что важную роль в этом играют мутации, определяющие начальные этапы взаимодействия вируса КЭ с клетками. Вероятно, определенное значение могут иметь и мутации, определяющие наиболее эффективное взаимодействие вирусной РНК и белков и клеточных факторов, формирующих репликативный комплекс, или участвующих в подавлении защитных средств клетки, в первую очередь, индукцию ИФН или ИФН сигнальные пути.