Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита 03. 00. 06 вирусология

Вид материала

Характеристика моноклонАТ
Взаимодействие вирионов ВКЭ с рецепторами на поверхности клеток
Изменение патогенетических характеристик ВКЭ при адаптации к клещам и переадаптации к млекопитающим

Подобный материал:

1 2 3 4 5

^a Аминокислотная позиция в соответствующем белке, нумерация с начала соответствующего белка

сорбированы на ГС, инкубированы в течение 1 часа при комнатной температуре при периодическом перемешивании. В отдельных пробирках готовили контрольные вирусы, которые выдерживали в тех же условиях. После адсорбции сефарозу осаждали, супернатант собирали. Полученные пробы несорбированного на сефарозе и контрольного вируса титровали методом бляшек в культуре клеток СПЭВ (Romanova et al., 2007). Сорбция вирионов адаптированного к клещам варианта М на ГС оказалась выше, чем у вирионов штамма Эк-328 (рис.3), т.е. М вариант обладает ГАГ-связывающим фенотипом.

Варианты с подобным ГАГ-связывающим фенотипом описаны для многих вирусов (Byrnes and Griffin, 2000; Hulst et al., 2000; Lin et al., 2000), в том числе и флавивирусов японского энцефалита (ЯЭ), лихорадки Западного Нила (ЛЗН) и энцефалита Долины Муррей (ЭДМ) (Lee and Lobigs, 2002; Lee et al., 2004), в частности ВКЭ (Mandl et al., 2001; Goto et al., 2003). Для всех подобных вариантов характерна низкая виремия и низкая НИ для лабораторных мышей.

Рисунок 3. Процент вируса, сорбированного на ГС, для штамма ЭК-328, варианта М и клонов 160/57, 116/59 и 103/84.

ЭК-328 вар.М Клон клон клон

160/57 116/59 103/84

В наших экспериментах появление вируса с ГАГ-связывающим фенотипом наблюдали при адаптации штамма ВКЭ сибирского генотипа к клещам H. m. marginatum. Доктор Чунихин с соавт. (1986) адаптировали к клещам H. anatolicum 4 штамма ВКЭ, выделенных в Сибири и на дальнем Востоке. Во всех случаях в результате пассажей на клещах были получены мелкобляшечные варианты с низкой НИ для мышей. Вирионы всех полученных вариантов, подобно нашему варианту М, не образовывали преципитата с АТ в РИЭФ. Таким образом, разные штаммы ВКЭ имели сходную изменчивость при адаптации к клещам, относящимся к роду Hyalomma, которые не являются переносчиками этого вируса в природных очагах. Доктор Labuda с соавт. (1994) получили сходное изменение свойств ВКЭ при пассировании штамма европейского генотипа к клещам I.ricinus, которые являются основным переносчикам этого вируса. При этом авторы наблюдали снижение НИ вируса и выявили а.к. замену в позиции 84 белка Е, которая приводит к повышению положительного заряда вирионов и может обеспечивать ГАГ-связывающий фенотип полученного мутанта. Все перечисленные факты позволяют предположить, что появление вариантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом является закономерностью при адаптации ВКЭ к клещам.

Для оценки влияния выявленных в белке Е замен на антигенные свойства вирусов были изучены вирионы штамма ЭК-328 и варианта М с помощью моноклональных АТ (моноклонАТ) в иммуноферментном анализе (ИФА) и с использованием преципитации меченых вирусных белков (РИП) из лизатов инфицированных клеток СПЭВ. Для сравнения брали штамм Софьин (дальневосточный генотип) и штамм Рс (европейский генотип) так, чтобы в реакции были представлены все 3 генотипа ВКЭ. ИФА проводили по непрямому методу (Романова и др., 2006). С помощью ИФА определили, что моноклонАТ E6B значительно слабее взаимодействуют с вариантом М, по сравнению со штаммами ЭК-328, Рс и Софьин (табл. 3). E6B является нейтрализующим и обладающим антиГА активностью моноклоном к эпитопу, принадлежащему к антигенному домену е2 белка Е, согласно эпитопной карте Цехановской с соавт. (1993). МоноклонАТ Е4А, не обладающие нейтрализующими и антиГА свойствами, также различили штамм ЭК-328 и вариант М.

Таблица 3. Сравнение антигенной структуры вирионов штамма Эк-328 и варианта М с помощью набора моноклональных АТ к белку Е.

Сыворотка и моноклональные АТ	Характеристика моноклонАТ*			Антигены
Сыворотка и моноклональные АТ	РНБ	РНБ	РНБ	Эк-328	Вариант М	Софьин	Рс
ИФА
Контр.сыворотка к ВКЭ				1600	800	1600	800
Е4А	-	-	н.о.	>25600	64	>25600	>25600
EB1	-	-	е2	>25600	12500	>25600	>25600
E6B	+	+	е2	>25600	640	25600	25600
Иммунопреципитация радиоактивно меченных белков
6B9	-	-	е1-е2	0,9±0,2	0,5±0,1	0,2±0,1	0,5±0,1
7F10	-	-	е1	1,4±0,3	0,7±0,2	0,2±0,3	0,2±0,2
4C7	-	+	е1	0,7±0,2	0,6±0,3	0,0±0,1	0,3±0,1
10H10	-	+	е2	1,7±0,3	1,9±0,3	2,7±0,4	1,3±0,2
13F2	-	-	е2	0,1±0,1	0,2±0,1	0,1±0,2	0,4±0,2

* по опубликованным данным (Гайдамович и др., 1990; Протопопова и др., 1996, 1997).

В РИП оценивали количество белка, которое преципитируют моноклонАТ из лизатов клеток СПЭВ, инфицированных вышеперечисленными штаммами, по отношению к количеству белка, преципитированного из этого лизата g-глобулином против ВКЭ (Романова и др., 2006). МоноклонАТ 7F10 к эпитопу в домене е1 статистически достоверно более активно преципитировали белок Е штамма ЭК-328, по сравнению с вариантом М.

МоноклонАТ, различившие в данной работе белок Е варианта М и исходного штамма ЭК-328, связываются с эпитопами в разных антигенных доменах белка Е. Следовательно, изменение антигенной структуры у варианта М затрагивает удаленные эпитопы этого белка.

Взаимодействие вирионов ВКЭ с рецепторами на поверхности клеток

Представленные выше данные показывают, что адаптация к клещам приводит к селекции вариантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. В связи с этим мы попытались более подробно изучить адсорбцию вирионов ВКЭ на клетках с целью лучше понять, какую роль в процессе проникновения вирионов в клетку могут играть ГАГ. К началу данного исследования сведения о природе рецепторов на поверхности клеток для флавивирусов и, в частности, для ВКЭ отсутствовали.

Для анализа связывания вирионов ВКЭ использовали штамм Софьин. Вирионы метили по РНК при выращивании в клетках почек зеленых мартышек 46-47 в присутствии [Н3]-уридина (Timofeev et al., 1991). Меченые вирионы концентрировали с помощью ультрацентрифугирования и использовали для экспериментов по адсорбции на клетках СПЭВ. Клетки выращивали в 96-лучночных пластинах. К монослоям добавляли возрастающие концентрации меченого вируса. Проводили адсорбцию в течение 2 часов при +4⁰С. После адсорбции собирали не связавшийся с клетками вирус, промывали клеточный монослой средой и собирали клетки. Определяли количество связавшегося и свободного вируса. Полученные результаты представляли в координатах Скэтчарда (Scatchard, 1949). Взаимодействие лиганда с одним рецептором в этих координатах описывается прямой линией, которая отсекает на оси ординат константу связывания, а на оси абсцисс – количество рецепторов данного типа. Если лиганд связывается с двумя или большим количеством типов рецепторов, то в данной системе процесс описывается гиперболой или линией более высокого порядка. Асимптоты к плечам гиперболы характеризуют соответствующие типы рецепторов, которые различаются аффинностью связывания с лигандом. Под одним типом рецепторов могут выступать химически разные молекулы.

Как видно на рис. 4, в координатах Скэтчарда взаимодействие вирионов ВКЭ с клетками описывается гиперболой. Один из рецепторов характеризуется высокой константой связывания и представлен небольшим количеством на поверхности клеток. Второй, низкоаффинный рецептор, связывает практически все вирионы ВКЭ. Таким образом, адсорбция вирионов ВКЭ на клетках обусловлено взаимодействием с двумя типами рецептором: высокоаффинными и низкоаффинными.

+ - экспериментальные данные;

— -аппроксимированная кривая;

— асимптоты к аппроксимированной кривой. Аппроксимированная кривая рассчитана методом наименьших квадратов. Асимптоты рассчитаны, согласно работе Варфаламеева и др. (1980).

Рис.4. Результаты связывания меченных [³H]-уридином вирионов ВКЭ на монослое клеток СПЭВ, выраженные в координатах Скэтчарда.

Для выяснения природы клеточных рецепторов, обуславливающих вышеописанные взаимодействия вирионов ВКЭ с клетками, клетки СПЭВ обрабатывали раствором ТРСК-трипсина в течение 15 минут при комнатной температуре и проводили адсорбцию меченого вируса. Обработка клеток трипсином полностью блокировала высокоаффинное связывание вирионов с клетками. Эти данные позволили сделать предположение о белковой природе высокоаффинного рецептора.

Для более детального изучения предполагаемого клеточного белкового рецептора была получена антиидиотипическая сыворотка к поверхностному гликопротеину Е ВКЭ. Для этого мыши были однократно иммунизированы 50мкг

очищенного белка Е (Timofeev et al., 1991). Для получения сыворотки у мышей была взята кровь из супраорбитальной вены на 9 (нормальный иммунный ответ на введение антигена) и 35 сутки после иммунизации (время максимального накопления антиидиотипических антител). Сыворотка мышей, взятая на 9 сутки после иммунизации, преципитировала из лизата клеток СПЭВ, инфицированных ВКЭ, белок Е. Сыворотка, взятая у тех же мышей на 35 сутки после иммунизации белком Е, содержала антиидиотипические антитела к этому белку, поскольку в ИФА при взаимодействии с иммуноглобулином против ВКЭ вела себя, как антиген.

Обработка клеток сывороткой с антиидиотипическими антителами перед адсорбцией вируса практически полностью блокировала связывание вирионов ВКЭ на высокоаффинном рецепторе. Данная сыворотка в РИП белков, меченных смесью [C14]-аминокислот или [C14]-глюкозамином, из лизатов незараженных клеток СПЭВ преципитировала только гликопротеин с мол. массой около 110 кДа.

В последствие появился ряд работ, в которых с помощью антиидиотипических поликлональных и моноклонАТ был выявлен целый набор претендентов в рецепторы для вирионов ВКЭ (Протопопова и др, 1996, 1997; Kopecky et al., 2005). С помощью моноклонАТ к нейтрализующим моноклонАТ к белку Е (в том числе к использованным в данной работе Е6В) из нескольких культур клеток были выделены белки с мол. массами 43, 67, 110, 210 кДа (Протопопова и др., 1996, 1997). Было показано, что белок 110 кДа является β1-цепью, а белок 210 кДа –α3-цепью интегрина. Для вирусов ЛЗН и ЯЭ так же показано, что αvβ3-интегрин является общим для этих вирусов рецептором на поверхности клеток Vero, HeLa, N2A (клетки мышиной нейробластомы) (Chu and Ng, 2004), и этот рецептор опосредует проникновение вирионов в клетку.

Выявленный белок с мол. массой 67 кДа оказался - ламининсвязывающим белком (ЛСБ) и был предложен авторами в качестве рецептора для ВКЭ с константой связывания 2,5х10⁷М^-1, т.е. низкоаффинного рецептора (Protopopova et al., 1997; Локтев и др., 2002). Представленные данные позволяют высказать предположение, что на поверхности белка Е ВКЭ есть участок, структурно близкий рецепторной области ламинина, который может взаимодействовать с разными типами рецепторов для ламинина. Таким образом, взаимодействие ЛСБ и ГАГ с белком Е ВКЭ может иметь сходный механизм, поскольку ГАГ могут выполнять функции ко-рецепторов для ламинина.. Выявленная нами замена в 122 позиции белка Е глутаминовой кислоты на глицин, повышает положительный заряд белка Е и приводит к повышению связывания с ГАГ клетки. В наших экспериментах, в отличие от родительского штамма ЭК-328 вариант М, имеющий такую замену, слабо взаимодействует с моноклонАТ Е6В к эпитопу белка Е ВКЭ, отвечающему за связывание с ЛСБ на поверхности клетки. Это позволяет предположить, что ГАГ и ЛСБ могут служить в качестве одного из ко-рецепторов для разных вариантов ВКЭ, при этом адаптация к новому хозяину может сопровождаться изменением связывания с этими рецепторами.

Таким образом, нами впервые было показано, что ВКЭ имеет два типа рецепторов на поверхности клетки: высокоаффинный, по-видимому, белковой природы, с которым связывается менее 1% сорбированных вирионов, и низкоаффинный, с которым связывается основная масса вирионов ВКЭ.

Изменение патогенетических характеристик ВКЭ при адаптации к клещам и переадаптации к млекопитающим

Сравнение вирулентности штамма Эк-328 и варианта М проводили на мышах линии Balb/c разного возраста, которые были инокулированы и/ц и интраперитонеально (и/п). Для сравнения использовали штамм Абсеттаров ВКЭ, обладающий высокой нейроинвазивностью для мышей этой линии.

Как видно из табл. 4, все изученные вирусы обладали близкой нейровирулентностью для мышей 6 и 12 г. В экспериментах на взрослых мышах штамм Эк-328 продемонстрировал несколько меньшую НИ, чем штамм Абсеттаров, исходя из данных о количестве БОЕ, необходимых для того, чтобы вызвать 50% гибель животных. НИ варианта М была в 10000 раз ниже, чем у штамма ЭК-328.

Таблица 4. Вирулентность штамма Эк-328, варианта М и штамма Абсеттаров ВКЭ для мышей BALB/c разного возраста

вирусы	и/ц заражение			и/п заражение
	Мыши 5-7г		Мыши 12 г	Мыши 5-7г
	ЛД₅₀(БОЕ)	СПЖ(сутки)*	ЛД₅₀(БОЕ)	ЛД₅₀(БОЕ)	СПЖ(сутки)**
Абсеттаров	0,1	4,2±0,2	0,1	3	9,90,5
ЭК-328	0,5	5,0±0,0	0,5	18	121,2
Вариант М	0,4	5,1±0,3	2,5	250 000	5 месяцев ***

* доза заражения 5,5 lg ЛД₅₀; ** доза заражения 10 ЛД₅₀; *** - период наблюдения.

Для характеристики инфекции мыши линии Balb/c 12г были инокулированы и/п 1000 БОЕ данными вирусами. Ежедневно у 3-х мышей брали кровь и органы, содержание инфекционного вируса в которых определяли методом бляшек. На 7-8 день по три мыши для каждого вируса были использованы для патоморфологического исследования.

У мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров, после и/п введения 1000 БОЕ инфекция протекала остро. Все животные заболели на 6-7 сутки и к 9 дню погибли. Гистологическое исследование выявило характерную для ВКЭ картину менингоэнцефалита. У животных наблюдали двухволновую виремию с более выраженным вторым пиком (табл. 5). В мозгу вирус появлялся, начиная с 5 суток.

Таблица 5. Динамика появления инфекционного вируса (lgБОЕ/мл 10% суспензии) в крови органах и противовирусных АТ (ИФА) в сыворотках мышей после и/п введения 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М

штамм Абсеттаров
	дни после начала инфекции
	1	2	3	4	5	6	7	8
Кровь*	2	2,7	2,7	0	2	4	2,7	4,1
мозг	0	0	0	0	4,8	6,6	7,8	7,6
л/у	0	0	2	0	0	3	0	0
селезенка	0	4,7	2,4	3,9	4,9	4	0	5,8
AT	0	0	0	160	160	320	320	320
штамм ЭК-328
	дни после начала инфекции
	1	2	3	4	5	6	7	8
Кровь	2,3	4,3	4,1	0	2,3	2	0	0
мозг	0	0	0	3,2	4,3	4,7	6,8	7,2
л/у	0	0	0	0	0	0	3	0
селезенка	2	3	3,2	3,7	3,4	2,7	0	4,7
AT	0	0	0	160	160	160	320	320
вариант М
	дни после начала инфекции
	1	2	3	4	5	6	7	8
Кровь	0	0	0	0	0	0	0	0
мозг	0	0	0	0	0	0	0	0
л/у	0	0	2	0	0	0	0	3
селезенка	0	0	0	0	3**	2,7**	0	0
АТ	0	0	0	0	0	0	0	0

* для титрования использовали сгустки крови; ** популяция вируса была представлена характерными для варианта М точечными бляшками и бляшками с диаметром 5-6 мм, соотношение 1:1. 0 – титр вируса < 1,4 lgБОЕ/мл, титр АТ менее 1:8.

При инфицировании мышей 1000 БОЕ штамма Эк-328 наблюдали также острую инфекцию с двухволновой виремией с более выраженным первым пиком. В мозге мышей вирус появлялся на сутки раньше, чем при инфекции вызванной штаммом Абсеттаров, однако животные заболевали только на 8-9 сутки, погибая к 11 дню. При гистологическом исследовании был обнаружен менингоэнцефалит.

Введение 1000 БОЕ варианта М и/п не вызвало никаких признаков заболевания у 49 из 50 зараженных животных. Гистологический анализ не обнаружил каких-либо специфических повреждений в ЦНС инфицированных животных. Нам не удалось выявить инфекционный вирус в крови мышей, инфицированных вариантом М, в лимфоузлах и селезенках был найден вирус в невысоких титрах. У одной мыши из 50 на 7 сутки после начала инфекции наблюдали типичную для КЭ картину заболевания.

Сыворотки мышей, инфицированных штаммами Абсеттаров, Эк-328 и вариантом М были проверены на наличие противовирусных антител с помощью ИФА. При острой инфекции в сыворотках мышей, инфицированных шт. Абсеттаров и Эк-328, противовирусные АТ появлялись на 4 сутки после начала инфекции (табл. 5). При инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М, нам не удалось с помощью ИФА выявить противовирусные АТ.

Сыворотки мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров и вариантом М, полученные на 6 сутки после заражения, были проанализированы с помощью РИП вирусных белков из лизатов инфицированных клеток. Сыворотка мышей, зараженных штаммом Абсеттаров, преципитировала белок Е и высокомолекулярные неструктурные белки NS1, NS3 и NS5 из лизатов клеток СПЭВ, инфицированных как штаммом Абсеттаров, так и вариантом М. С помощью сыворотки мышей, зараженных вариантом М, никакие вирусные белки выявлены не были. С помощью лизата клеток СПЭВ, инфицированных дефектным аденовирусом Rad51, несущим ген белка NS1 вируса КЭ (Timofeev et al., 1998), мы выявили в небольших количествах АТ к белку NS1 в сыворотках мышей, инфицированных вариантом М, взятых на 7 и 28 дни инфекции.

Через 3 недели и 5 месяцев после и/п введения 1000 БОЕ варианта М мыши были умерщвлены, у них были взяты головной мозг, селезенки, лимфоузлы, а также были получены сгустки крови. Ни в исходных гомогенатах органов, ни в материалах после двух слепых пассажей этих гомогенатов в культуре клеток СПЭВ инфекционный вирус не был обнаружен. На эти сроки в мозге и селезенках мышей, инфицированных вариантом М, на фоне введения циклофосфана не удалось выявить вирусную РНК с помощью предложенного нами варианта ОТ-ПЦР с внутренним контролем (Романова и др., 2006).

В те же сроки через 3 недели и через 5 месяцев после и/п введения 1000 БОЕ варианта М мыши были разрешены 100 ЛД50 штамма Абсеттаров. Все мыши, предварительно инфицированные вариантом М, были защищены от последующего введения вирулентного вируса КЭ. Формирование длительного протективного иммунитета после и/п введения варианта М было показано в трех независимых экспериментах.

Отсутствие клинических признаков заболевания и повреждений в ЦНС показывают, что вариант М при и/п введении мышам вызывает инаппарантную форму инфекции, характеризующуюся отсутствием вируса в крови и ЦНС, хотя чувствительность использованного метода (45 БОЕ в пробе) не позволяет полностью исключить попадание небольшого количества вируса и его персистенции в ЦНС.

Для ГАГ-связывающих мутантов переносимых комарами флавивирусов ЯЭ и ЭДМ было показано, что после внутривенного введения вируса они быстро попадают в печень, где, по-видимому, элиминируются макрофагами печени (Lee and Lobigs, 2003). Вирионы могут попадать в печень в свободном состоянии или связанными с клетками крови. Мы проверили сорбцию вирионов изучаемых вирусов на эритроцитах мыши. Для этого у здоровых мышей были взяты эритроциты, к эритроцитам были добавлены вирусы. После инкубации несвязавшийся с клетками вирус был собран, и были определены титры свободного и связанного с эритроцитами вируса. На рис. 5А представлена динамика сорбции вирионов родительского штаммов Абсеттаров, ЭК-328, и варианта М на эритроцитах мыши. Насыщение эритроцитов вирионами происходит в первые 10 мин после добавления вируса. На рис. 5Б показана доля связанного вируса при разных соотношениях эритроцитов и вирионов. В любых условиях доля вирионов варианта М, связанных с эритроцитами, в 50-100 раз больше, чем этот показатель для штаммов Эк-328 и Абсеттаров.

Для оценки активации раннего неспецифического противовирусного иммунного ответа проводили определение содержания /-ИФН, ФНО-, ИЛ-10 и ИЛ-12 в крови мышей на начальных этапах инфекции после и/п введения 1000 БОЕ вирусов в виде вируссодержащей мозговой суспензии или КЖ инфицирпованных клеток СПЭВ.

Содержание /-ИФН в сыворотках крови, взятых от трех мышей через разные сроки после начала инфекции, определяли по подавлению цитопатического действия (ЦПД) вируса энцефаломиокардита мышей (ЭММ) (Бабаянц и др., 1985). В качестве контроля использовали сыворотку от трех мышей, которым вместо вируса вводили мозговую суспензию (МС) от здоровых мышей в соответствующем разведении. В сыворотке крови контрольных мышей через 5 часов после введения МС от здоровых мышей обнаружили /-ИФН в титрах 1:8, который отсутствовал в пробе, взятой через следующие 5 часов. Как представлено на рис. 6, штамм ЭК-328 оказался слабым индуктором ИФН 1 типа.

Рис. 5. Характеристика адсорбции штаммов Абсеттаров,

Эк-328 и

варианта М на эритроцитах мыши.

Штамм Абсеттаров и вариант М индуцировали /-ИФН в сопоставимых титрах, но при инфекции, вызванной вариантом М, ИФН появлялся в крови животных уже через 5 часов, а у мышей, зараженных штаммом Абсеттаров, только через 10 часов после введения вируса.

Уровень остальных ключевых цитокинов в сыворотках крови животных, зараженных и/п 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, ЭК-328 и варианта М в виде КЖ инфицированных клеток СПЭВ, устанавливали с помощью коммерческих наборов для определения соответствующих цитокинов методом ИФА. Количество цитокинов в сыворотках крови инфицированных мышей сравнивали с уровнем цитокинов в контрольных сыворотках, полученных от животных, которым и/п была введена питательная среда 199.

Рис. 6. Динамика появления ИФН-1типа в сыворотках мышей, и/п инфицирован-ных штаммами Абсеттаров, Эк-328 и вариантом М в дозе 1000БОЕ.

В первые часы после заражения животных изучаемыми штаммами ВКЭ мы наблюдали повышение в крови уровня ФНО- и ИЛ-10. ФНО- является провоспалительным цитокином (табл. 6). Его появление в крови свидетельствует об активации макрофагов и нейтрофилов. ФНО- индуцирует синтез ИЛ-10, а ИЛ-10 в свою очередь, подавляет синтез ФНО- (van der Pool et al., 1994). В нашем эксперименте ИЛ-10 выявляли одновременно с ФНО-, после чего концентрация ФНО- в крови животных понижалась до уровня контроля. Известно, что ИЛ-10, являясь регулятором иммунных реакций, подавляет продукцию таких основных провоспалительных цитокинов, как ИЛ-6, ФНО-, экспрессию на клеточной мембране МНС-II и антигенпрезентирующую способность моноцитов/макрофагов, продукцию цитокинов Тh-1 лимфоцитами (-ИФН, ИЛ-2), продукцию цитокинов натуральными киллерами (НК), пролиферацию Т-лимфоцитов (Кашкин, 1998). Таким образом, ВКЭ, попадая в организм мыши, индуцирует состояние иммунодепрессии у инфицированных животных в первые часы после заражения, при этом штаммы ВКЭ могут различаться по выраженности и длительности вызываемой ими иммунодепресии.

В отличие от штамма Абсеттаров через 10 часов после заражения штаммом ЭК-328 и вариантом М в крови мышей в высоких концентрациях выявляли ИЛ-12, который на ранних стадиях инфекции свидетельствует об активации антигенпрезентирующих и фагоцитирующих клеток (Хаитов и Пинегин, 2000; Biron & Sen, 2002). Появление в крови этого интерлейкина и /-ИФН может приводить к активации НК.

Таблица 6. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей на ранних этапах инфекции после и/п введения 1000 БОЕ шт. Абсеттаров, ЭК-328 и варианта М (пкг/мл)

вирус	ФНО-			ИЛ-10		ИЛ-12
вирус	5 ч	10 ч	18 ч	10 ч	18 ч	10 ч
Абсеттаров	К	107±19	К	301±30	20±0	К
ЭК-328	К	К	75±10	К	75±10	352±42
ВариантМ	К	116±32	К	151±20	1 118±21	348±21

Примечание: концентрация ИЛ в контрольных сыворотках крови (К), полученных от животных после введения среды 199 на растворе Эрла (пкг/мл): ФНО- - 23±3; ИЛ-10 – 8±4; ИЛ-12 - 131±56.

На 4-е сутки у животных, зараженных штаммом Абсеттаров, в сыворотках крови обнаруживали ИЛ-6 и незначительное количество -ИФН (табл. 7). У животных, зараженных шт. ЭК-328, ИЛ-6 и -ИФН появились на сутки раньше. Повышение концентрации ИЛ-6 свидетельствует об активации Th2-лимфоцитов, которые обеспечивают формирование гуморального иммунного ответа. Об этом свидетельствует и появление в это время противовирусных антител в сыворотках крови мышей, инфицированных штаммами Абсеттаров и Эк-328. Продукция -ИФН связана с активностью ИЛ-12. При инфекции штаммом Абсеттаров мы наблюдали однократный подъем уровня ИЛ-12 на 2 сутки, а при инфекции шт. ЭК-328 – двукратный подъем через 10 часов и на 4 сутки после заражения животных. При этом второе повышение количества ИЛ-12 в крови мышей, инфицированных штаммом ЭК-328, не сопровождалось последующей продукцией -ИФН.

При инфекции вариантом М на 3 сутки в крови животных повысился уровень ИЛ-2 и -ИФН. Это говорит об активации Th1-лимфоцитов, которые обеспечивают развитие клеточного иммунитета. -ИФН в крови животных далее выявлялся на протяжении всего срока наблюдения.

На 7 сутки после заражения в крови мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров, обнаружили в высоких титрах ИЛ-10, -ИФН, ИЛ-6 и ФНО-. В эти же сроки отмечали выраженные симптомы заболевания, высокий титр инфекционного вируса в крови и мозге, развитие менингоэнцефалита. Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови животных, заболевших на 7-е сутки после и/п введения 1000 БОЕ штамма ЭК-328, также был высоким. Появление провоспалительных цитокинов в крови инфицированных животных в высоких титрах на этой стадии острого заболевания КЭ свидетельствует о выраженном патологическом процессе в ЦНС и нарушении гематоэнцефалического барьера.

Таблица 7. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей после и/п введения 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М (пкг/мл)

штамм Абсеттаров
Цитокины	Срок после заражения животных
	1 сут	2 сут	3 сут	4 сут	5 сут	6 сут	7 сут
ФНО-	К	К	К	К	К	К	31543
ИЛ-10	10134	К	К	К	К	К	4514 ¹
-ИФН	К	К	К	275	39	К	28436
ИЛ-12	К	32817	К	К	н/и	н/и	н/и
ИЛ-6	К	К	К	699	К	К	64085
ИЛ-2	К	К	К	К	К	К	К

штамм ЭК-328

Цитокины	Срок после заражения животных
Цитокины	1 сут	2 сут	3 сут	4 сут	5 сут	6 сут	7 сут
ФНО- 	К	К	К	К	1074	К	н/и
ИЛ-10	К	К	К	К	К	К	331 ¹
-ИФН	К	К	302	494	К	К	н/и
ИЛ-12	К	К	К	29298	н/и	н/и	н/и
ИЛ-6	К	К	746	К	К	К	1139
ИЛ-2	К	К	К	К	К	К	н/и

вариант М

Цитокины	Срок после заражения животных
Цитокины	1 сут	2 сут	3 сут	4 сут	5 сут	6 сут	7 сут
ФНО- 	К	К	К	К	К	К	К
ИЛ-10	78	К	К	121	315	К	К
-ИФН	К	К	965	428	11667	10114	16770
ИЛ-12	К	41442	К	К	н/и	н/и	н/и
ИЛ-6	К	К	К	К	К	К	576
ИЛ-2	К	К	253	К	416	К	396

Примечание: концентрация ИЛ в контрольных сыворотках крови (К), полученных от животных после введения среды 199 на растворе Эрла (пкг/мл): ФНО- - 233; ИЛ-10 – 84; -ИФН - 25±2; ИЛ-12 - 131±56; ИЛ-6 - 16±1; ИЛ-2 – 103. 1 – указаны данные для заболевших животных; у мышей без клинических проявлений болезни содержание ИЛ в указанный срок было К.

При инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М, на 7 сутки после заражения мы наблюдали присутствие в крови в небольших концентрациях ИЛ-2, ИЛ-6 и -ИФН. При этом все животные были клинически здоровы, вирус из головного мозга не выделялся, и патоморфологическое исследование ЦНС не выявило каких-либо изменений. Наличие в крови ИЛ-2, ИЛ-6 и -ИФН свидетельствует о развитии к 7-м суткам после заражения сбалансированного (Th1 и Th2) иммунного ответа при данном типе инфекции.

Таким образом, инаппарантная форма КЭ, вызванная вариантом М, характеризуется развитием более раннего неспецифического иммунного ответа и развитием сбалансированного специфического иммунного ответа. Острая форма КЭ, вызванная штаммами Абсеттаров и ЭК-328, характеризуется более поздней активацией неспецифического иммунитета и преобладанием выраженного гуморального ответа, которого оказывается недостаточно для предотвращения развития заболевания.

Blog

Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита 03. 00. 06 вирусология