Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата ( Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам

Вид материала

Содержание

Научный руководитель
Ведущая организация
Ученый секретарь диссертационного совета
Общая характеристика работы
Цель и задачи исследования.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Апробация работы.
Структура и объем диссертации.
Объекты и методы исследований
Штаммы Agrobacterium tumefaciens
CaMV35S). Для отбора трансгенных растений векторные конструкции содержали селективный ген nptII
Регенерация побегов томата.
Агробактериальная трансформация томата.
Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений томатов.
Флуориметрический анализ активности GFP.
Адаптация трансгенных регенерантов к условиям
Лабораторная оценка устойчивости трансгенных растений томата к
Наследование селективного гена в поколении Т
Результаты исследований
P. infestans
...
Полное содержание

Подобный материал:

1 2 3

а правах рукописи

ХАЛИЛУЕВ МАРАТ РУШАНОВИЧ

Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата (Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам

Специальность 03.01.06. – биотехнология (в том числе бионанотехнология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии растений Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИСБ РАСХН).

Научный руководитель: кандидат сельскохозяйственных наук

Сергей Владимирович Долгов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Александр Александрович Соловьев,

доктор биологических наук

Илья Александрович Шилов.

Ведущая организация: Институт общей генетики

имени Н.И. Вавилова РАН.

Защита состоится «_____» 2011 г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при ГНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42.

Тел.: 8 (499) 977 6544; Факс: 8 (499) 977 0947; e-mail: iab@iab.ac.ru

Автореферат разослан « » мая 2011 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Ученый секретарь диссертационного совета:

кандидат биологических наук

Светлана Александровна Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Томат (Solanum lycopersicum L.) является одной из важнейших продовольственных культур, занимающих первое место среди продуктов овощеводства как по своему значению, так и по объему производства. По данным ФАО, в 2009 г. томат в России промышленно выращивался на площади 117 тыс. га, а валовой сбор товарной продукции составил около 2,2 млн. т. Высокий спрос на эту культуру обуславливает непрерывное совершенствование сортимента, что, в свою очередь, требует постоянного улучшения целого ряда хозяйственно-ценных признаков и может быть достигнуто как традиционной селекцией, так и методами генетической инженерии. Применение трансгенных форм томата может существенно повысить окупаемость сельскохозяйственного производства, резко сократить загрязнение окружающей среды пестицидами, а также, во многих случаях, реализовать потенциальную урожайность культуры.

Устойчивость к биотическим стрессам и, в частности, к грибным и бактериальным патогенам – одно из приоритетных требований, предъявляемых к современным сортам и гибридам томата. Несмотря на достигнутые успехи в получении генотипов с повышенной устойчивостью к отдельным болезням, проблема комплексной устойчивости к неблагоприятным факторам биотической природы по-прежнему остается неразрешенной. Это относится также и к наиболее опасным болезням, таким как фитофтороз.

Прямые потери урожая томата от фитофтороза в годы эпифитотии составляют больше, чем от всех других болезней вместе взятых и в полевых условиях достигают 100%. Фитофтороз приносит значительные экономические убытки в России, особенно в ее Средней полосе, где потери достигают критических величин, а также во многих странах Европы и США. Одной из приоритетных возможностей противостояния фитофторозу томата является получение и последующее промышленное выращивание устойчивых сортов.

В последние десятилетия для повышения устойчивости растений томата к фитопатогенам все более широкое применение находят методы генетической инженерии. Этому способствовал прогресс в частичном установлении молекулярной природы защитных механизмов, обеспечив возможность разработки новых стратегий борьбы с заболеваниями в дополнение к существующим традиционным подходам. Одной из них является привнесение в геном томата чужеродных генов, кодирующих защитные PR-белки и антимикробные пептиды (Broekaert et al., 1997; Edreva et al., 2005; Van Loon et al., 2006).

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлось получение трансгенных растений томата (Solanum lycopersicum L.), содержащих гены PR-4 семейства хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов, и оценка влияния экспрессии гетерологичных генов на устойчивость к фитопатогенам.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

получение трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ с генами хитинсвязывающих белков из растений рода Amaranthus и гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L.;
оценка экспрессии гетерологичных генов в полученных трансгенных растениях томата селекционной линии ЯЛФ и изучение ее влияния на устойчивость к возбудителю фитофтороза;
изучение характера наследования селективного гена в потомстве трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ;
разработка методики эффективной регенерации и генетической трансформации растений из различных типов эксплантов томата промышленного сорта Рекордсмен.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены трансгенные растения томата, содержащие гены PR-4 семейства хитинсвязывающих белков из растений рода Amaranthus (A. caudatus L. и A. retroflexus L.), а также гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. Впервые продемонстрировано влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата на повышение устойчивости к оомицету Phytophtora infestans (Mont.) de Bary. В результате проведенных экспериментов разработана система эффективной регенерации растений из различных типов эксплантов томата промышленного сорта Рекордсмен с частотой более 85%. Методом агробактериальной трансформации получены растения томата сорта Рекордсмен, экспрессирующие репортерный ген gfp. Полученные экспериментальные данные являются основой для проведения фундаментальных исследований в области изучения механизмов действия белков PR-4 семейства и гевеин-подобных антимикробных пептидов в защитных реакциях растений против фитопатогенов, а также использования вышеперечисленных генов для повышения устойчивости к биотическим стрессам генно-инженерными методами промышленных сортов томата и других представителей рода Solanum.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на VII, IX и XI молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии» (2007, 2009, 2011), III Всероссийском симпозиуме «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (2010), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, входящих в перечень научных изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 21 рисунок. Библиографический список включает 286 источников, из них 259 на иностранном языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Растительный материал. В качестве растительного материала для экспериментов использовали следующие образцы томата: селекционную линию ЯЛФ и промышленный сорт Рекордсмен. Для введения томата в культуру in vitro использовали семена. Стерилизованные семена помещали в культуральные сосуды с питательной средой MS (Murashige and Skoog, 1962), дополненной 30 г/л сахарозы и 7 г/л агара. Донорные растения и экспланты культивировали при температуре 23-25ºС, освещенности 2500 люкс и фотопериоде 16/8 часов (день/ночь).

Штаммы Agrobacterium tumefaciens и бинарные векторы. Для проведения экспериментов по генетической трансформации томата применяли следующие обезоруженные супервирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens:

СВЕ21 (Ревенкова и др., 1993) с бинарными векторами pBINmGFP5ER, pBI121ac и pR830;
AGL0 с бинарными векторами pB-AMP1 и pB-AMP2 .

В состав Т-ДНК бинарного вектора pBINmGFP5ER входит оптимизированный для экспрессии в растениях ген gfp, содержащий N-концевой сигнальный пептид хитиназы Arabidopsis thaliana и С-концевой пептид HDEL, обеспечивающие локализацию продукта в эндоплазматическом ретикулуме.

Бинарные векторы pBI121ac и pR830 содержат соответственно хитинсвязывающий ген ас из Amaranthus caudatus L. и гибридный ген RS-intron-Shir, кодирующий сигнальную последовательность и первые шесть аминокислот дефензина редьки (Rs) c интроном, а также хитинсвязывающий белок из Amaranthus retroflexus L. (Shir).

Бинарный вектор pB-AMP2 содержит ген amp2, кодирующий лидерный пептид, два гевеин-подобных антимикробных пептида (SmAMP1 и SmAMP2), разделённых спейсером, и С-концевую часть из звездчатки (Stellaria media L.). В отличие от pB-AMP2, несущего полную копию кДНК гена звездчатки, pB-AMP1 содержит ген amp1, кодирующий только лидерную последовательность и один из антимикробных пептидов (SmAMP1).

Все целевые гены находились под контролем сильного конститутивного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты ( CaMV35S). Для отбора трансгенных растений векторные конструкции содержали селективный ген nptII, обуславливающий устойчивость к антибиотику канамицину.

Бинарные векторы с генами хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов сконструированы во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной биотехнологии и любезно предоставлены А.А. Гулевичем (pBI121ac), В.Г. Луниным (pR830) и А.В. Бабаковым (pB-AMP1, pB-AMP2).

Регенерация побегов томата. Ранее сотрудниками лаборатории генной инженерии растений ГНУ ВНИИСБ РАСХН (И.В. Корнеевой, Е.В. Парашиной) были проведены исследования, позволившие оценить регенерационную способность селекционной линии ЯЛФ томата. Было установлено, что оптимальной средой для регенерации побегов томата из семядолей является среда MS, содержащая 5,0 мг/л 6-БАП и 0,1 мг/л ИУК.

Для изучения регенерационной способности томата сорта Рекордсмен в качестве эксплантов использовали семядоли и сегменты гипокотилей длиной 7–10 мм, полученные от асептически выращенных 10-12 дневных проростков. Индукцию органогенеза побегов осуществляли как на базовой питательной среде, составленной по прописи MS (MS₀), так и на средах с добавлением различных типов и концентраций регуляторов роста (MS₁-MS₁₅) (табл. 1).

Таблица 1.

Состав питательных сред MS для индукции регенерации побегов томата сорта Рекордсмен.

Вариант	Вид и концентрация регулятора роста, мг/л
Вариант	зеатин	6-БАП	ИУК	НУК
MS₀	-	-	-	-
MS₁	1,0	-	0,1	-
MS₂	1,0	-	0,2	-
MS₃	1,0	-	0,5	-
MS₄	1,0	-	-	0,1
MS₅	1,0		-	0,5
MS₆	2,0	-	0,1	-
MS₇	2,0	-	-	0,1
MS₈	3,0	-	0,1	-
MS₉	4,0	-	0,1	-
MS₁₀	5,0	-	0,1	-
MS₁₁	-	5,0	0,1	-
MS₁₂	-	5,0	-	0,1
MS₁₃	-	2,5	0,1	-
MS₁₄	-	2,5	-	0,1
MS₁₅	1,0	2,5	0,1	-

Культивирование эксплантов проводили на чашках Петри, которые содержали 30 мл среды. Каждый вариант опыта включал 3 повторности, количество эксплантов составляло 10 штук в каждой повторности.

Оценку эффективности морфогенеза побегов проводили после 45 дней культивирования эксплантов по показателю частоты каллусообразования и регенерации побегов, количеству регенерантов, полученных от одного экспланта, а также по их морфометрической характеристике.

Агробактериальная трансформация томата. Эксперименты по трансформации растений томата проводили методом кокультивации эксплантов с суспензией агробактерии. Ночную культуру агробактерии наращивали в 20 мл неагаризованной среды LB (Sambrook et. al, 1989), дополненной соответствующими селективными антибиотиками, на качалке (180 мин^-1) в течение 24 часов при 26⁰С в темноте. В экспериментах по трансформации использовали экспланты 10-12 дневных проростков. За трое суток до инфицирования их помещали на агаризованную питательную среду для прекультивации. В случае использования семядолей перед инокуляцией у эксплантов отсекали небольшую часть у основания и верхушки, а на абаксиальную поверхность наносили 2-5 поперечных надсечек. Экспланты переносили в подготовленную бактериальную суспензию (OD₆₀₀=0,4-0,6) и, периодически перемешивая, выдерживали в течение 30 мин. Подсушенные на воздухе экспланты переносили на бумажные фильтры, помещённые на поверхность чашки Петри со средой МS, и кокультивировали в темноте при температуре 18 ºС в течение 48 часов. После периода кокультивации экспланты отмывали неагаризованной средой МS с добавлением 300 мг/л тиментина (тикарциллин + клавулановая кислота) и переносили на питательную среду для элиминации агробактерии, содержащую регуляторы роста в оптимальных концентрациях. В последующих пассажах для отбора трансгенного каллуса в состав питательной среды вводили селективный антибиотик канамицин в концентрации от 10 до 25 мг/л. Длительность каждого пассажа составляла 15 дней. По достижении регенерирующими предположительно трансгенными побегами размера 1,5 см их отделяли от каллусной ткани и переносили на среду для ризогенеза, содержащую ½ дозы макросолей от прописи МS, 2% сахарозы, 0,7% агара, 0,2 мг/л ИМК и канамицин в концентрации 50 и 100 мг/л.

Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений томатов. Для экстракции тотальной геномной ДНК томата использовали листья растений in vitro. Выделение проводили по модифицированной методике Edwards с соавторами (Edwards et al., 1991) c дополнительной экстракцией фенолом.

Подтверждение интеграции чужеродных генов проводили с помощью ПЦР-анализа. Реакционная смесь общим объемом 25 мкл состояла из следующих компонентов: по 2,5 mМ каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов, 1мкл Taq-полимеразы с активностью 5 ед/мкл, 10 пмоль прямого и обратного праймеров, 2,5 мкл 10x ПЦР-буфера для Taq-полимеразы, 3 мкл ДНК и стерильной бидистиллированной воды.

Интеграцию в растительный геном селективного гена nptII определяли при помощи праймеров 5'-CGCGGGTTTCTGGAGTTTAATGAGCTAAG-3' и 5'-GCATGCGCGCCTTGAGCCTGG-3'. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 742 п.н.

Интеграцию в растительный геном репортерного гена gfp определяли при помощи праймеров 5’-GGACGACGGGAACTACAAGA-3’ и 5’CATGCCATGTGTAATCCCAG-3’. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 397 п.н.

Для идентификации присутствия гена ас использовали праймеры к последовательности промотора CaMV35S (5'-CTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCC-3') и целевого гена (5'-TTGAACACATTCACCAACTCCCATAGAT-3'). Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 300 п.н.

Для амплификации последовательности гена Rs-intron-Shir использовали олигонуклеотиды на лидерную часть гибридного гена (5'-CTCTCTTCTAGAATGGCTAAGTTTGCTTCTATCGTC-3') и терминатора pA35S (5'-TGTCACTGGATTTTGGTTTTAGGAA-3'). Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 1050 п.н.

Интеграцию генов антимикробных пептидов определяли при помощи пары праймеров 5'-TCATTCCATAGACTTGTTTATGA-3' и 5'-CTTACATACAAAAGCTAGTCAC-3'. Размеры амплифицируемых фрагментов у образцов, трансформированных конструкцией рВ-АМР1 и рВ-АМР2, составляют соответственно 445 и 765 п.н.

Для амплификации фрагмента бактериального гена virB использовали пару праймеров 5'-GGCTACATCGAAGATCGTATGAATG-3' и 5'-GACTATAGCGATGGTTACGATGTTGAC-3'. Длина амплифицируемого фрагмента – 670 п.н.

Анализ экспрессии генов проводили с помощью метода ОТ-ПЦР. Выделение РНК проводили с использованием набора реагентов RNA-ExtraSorb (лаборатория молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ГНУ ВНИИСБ РАСХН) в соответствии с протоколом изготовителя. Синтез кДНК осуществляли в стандартных условиях (Маниатис и др., 1984) с использованием шестичленных случайных праймеров (Синтол, Россия) (метода рассеянной затравки). В качестве контроля был использован ген актина томата Tom52 (NCBI, U60482). Для его амплификации использовали пару праймеров 5’-GCCAGGTATTGTGCTGGACT-3’ и 5’-ATCAGCAATACCAGGGAACA-3’. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 450 п.н.

Для оценки экспрессии гена ас использовали пару праймеров 5’-GCGAGCTCGGTACCCCCGAA-3’ и 5’-ACCTGGACTACCAGCACCAGCA-3’. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 298 п.н.

Экспрессию на транскрипционном уровне гена Rs-intron-Shir определяли с помощью специфических праймеров 5’- CGCCCTTCTCTTCGCTGCTCT-3’ и 5’-TGCCAGATGGGCATCTACCT-3’. Ожидаемый размер амплифицируемого фрагмента – 120 п.н.

Экспрессию генов amp1 и amp2 определяли с использование праймеров, приведенных выше.

Визуализацию продуктов амплификации проводили методом электрофореза в агарозном геле с концентрацией 1% в 1х ТАЕ буфере с добавлением этидиум бромида. Размеры амплифицированных фрагментов определяли с помощью маркера FastRuler^TMLow Range DNA ladder и GeneRuler^TM100 bp Plus DNA ladder (Fermentas, Литва).

Флуориметрический анализ активности GFP. Детекцию экспрессии гена gfp проводили под флуорисцентным микроскопом Leica MZ FLIII (Leica Microsystems, Германия), укомплектованным барьерными фильтрами, имеющими λ = 450-490 нм (длина волны возбуждения) и λ = 515-550 нм (длина волны экстинкции белка GFP).

Адаптация трансгенных регенерантов к условиям in vivo. Укорененные in vitro побеги отмывали от остатков агаризованной среды и высаживали в смесь торфа и песка (3:1). Адаптацию и последующее выращивание трансгенных растений проводили в теплице станции искусственного климата «Биотрон» ФИБХ РАН со следующими условиями: температура в пределах 22-25 ⁰С днем и 18-19⁰С ночью, влажность 60-70%, освещенность 2500 люкс.

Лабораторная оценка устойчивости трансгенных растений томата к Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Лабораторную оценку устойчивости к фитофторозу проводили методом искусственного заражения отделенных сегментов листьев томата, полученных от взрослых вегетирующих Т₀-растений, выращенных в условиях защищенного грунта. Инокуляцию осуществляли зооспорангиями (5000 шт./мл суспензии) 10-суточной культурой трех изолятов Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, два из которых были выделены из плодов (ТПМ) и листьев (ТЛЗ) томата, а третий – из листьев картофеля сорта Ильинский (ИК3). Инфекционные капли объемом 50 мкл наносили на адаксиальную поверхность сегментов листа, помещенных в чашку Петри на фильтровальную бумагу, увлажненную раствором кинетина (10 мг/л). Чашки Петри помещали в климокамеру с оптимальной температурой для развития патогена (19-21°С). Через 24 часа после инокуляции остатки суспензии удаляли фильтровальной бумагой, а сегменты листа помещали абаксиальной стороной вверх. Оценку развития инфекции осуществляли на 7 сутки после заражения по размеру инфекционного пятна (см²), а также наличию и интенсивности спороношения (балл). Опыт проводили в трехкратной повторности, каждая из которой содержала три сегмента листа.

Наследование селективного гена в поколении Т₁ томата. Отбор трансгенных растений в потомстве томата проводили по признаку устойчивости к канамицину (экспрессии гена nptII). Семена, полученные в результате самоопыления, вводили в культуру in vitro и помещали на питательную среду MS, содержащую 150 мг/л канамицина. Оценку результатов проводили после 4 недель селекции.

Blog

Содержание