Geum.ru

Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата ( Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам

Вид материалаАвтореферат
Результаты исследований
P. infestans
Phytophthora infestans
Подобный материал:
1   2   3

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
  1. Агробактериальная трансформация томата селекционной линии ЯЛФ бинарными векторами, содержащими гены хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов.

Ранее сотрудниками лаборатории генной инженерии растений ВНИИСБ разработана система агробактериальной трансформации селекционной линии ЯЛФ при использовании эксплантов семядолей (Корнеева и др., 2005). Установлено, что генотип обладает высокой отзывчивостью к интеграции чужеродных генов (Долгов и др., 2008; Korneeva et al., 2008).

Одним из основных этапов генетической трансформации является эффективная доставка векторных конструкций в клетки-мишени, компетентные к регенерации растений. Многочисленными исследованиями показано, что при проведении процедуры трансформации и последующем культивировании трансформированной ткани регенерационная способность существенно снижается. До настоящего времени неоднозначным является выбор системы селекции трансгенной ткани. С одной стороны, использование высоких концентраций селективных агентов сразу с первых этапов культивирования позволяет проводить жесткий отбор трансгенной ткани и с высокой вероятностью избавляться от эскейпов. С другой стороны, сильное стрессовое воздействие селективных агентов и высокая к ним чувствительность эксплантов томата влечет за собой существенную потерю морфогенетического потенциала в результате ингибирования закладки регенерационных зон даже у трансгенных клеток (Дрейпер и др., 1991). В связи с этим, в исследовании была использована стратегия постепенной адаптации эксплантов к селективному агенту, исключающая их шок и массовую гибель (первый пассаж без канамицина, второй – 10 мг/л, третий и последующие – 25 мг/л).

За трое суток до инфицирования бактериальной суспензией экспланты семядолей помещали на среду для прекультивации, в результате чего происходило увеличение эксплантов в размере.

После инфицирования бактериальной суспензией и этапа кокультивации экспланты переносили на среду для каллусообразования и регенерации, в результате чего в конце пассажа по краям срезов и в местах поранений наблюдалось формирование светлой плотной каллусной ткани. Отмечено, что экспланты, трансформированные бинарными векторами с генами хитинсвязывающих белков ас и Rs-intron-Shir, отличались меньшей способностью к формированию каллуса по сравнению с семядолями, трансформированными рВ-АМР1 и рВ-АМР2 (табл. 2).


Таблица 2.

Эффективность каллусообразования и селекции эксплантов семядолей при трансформации генетическими конструкциями, содержащими гены хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов.


Бинарный вектор
Количество эксплантов

общее
образовавших каллус
погибших
прошедших селекцию

шт.
%
шт.
%
от бактерии
от канамицина
шт.
%

шт.
%
шт.
%

рВI121ac
90
100
58
64,4
19
21,1
65
72,2
6
6,7

pR830
120
100
69
57,5
7
5,8
103
85,8
10
8,4

рВАМР2
125
100
109
87,2
38
30,4
70
56,0
17
13,6

рВАМР1
115
100
96
83,5
30
26,1
72
62,6
13
11,3



Несмотря на относительную легкость получения каллусных тканей, регенерация из них полноценных трансгенных побегов оказалась более трудной задачей. После переноса эксплантов на питательную среду с добавлением 10 мг/л селективного антибиотика происходило снижение интенсивности нарастания каллусных тканей, их частичная некротизация, причем степень ее значительно усиливалась при возрастании концентрации канамицина в последующих пассажах. Побеги, регенерировавшие на ранних этапах культивирования, впоследствии проявляли признаки хлороза и не были трансгенными. В то же время на образовавшейся каллусной ткани некоторых эксплантов происходило формирование плотных зелёных глобулярных меристематически активных участков, не проявляющих признаков отрицательного воздействия селективного агента и интенсивно нарастающих на среде, содержащей канамицин в концентрации, сублетальной для нетрансгенной ткани (25 мг/л). Тем не менее, высокая чувствительность эксплантов и каллуса к селективному антибиотику являлась причиной гибели большей части растительной ткани, которая в зависимости от генетической конструкции составила от 56,0 до 85,8%. Кроме того, во всех экспериментах наблюдалась бактериальная контаминация части эксплантов, которая также служила причиной исключения их из дальнейшего культивирования.

Вынужденное длительное культивирование растительных тканей на питательных средах с целью получения регенерантов, устойчивых к канамицину, способствовало постепенному накоплению веществ токсического действия (фенольных соединений), что приводило к формированию растений с измененной морфологией. Наблюдались такие нежелательные эффекты, как подавление пролиферации пазушных меристем, образование витрифицированных побегов и, как следствие, уменьшение или полная потеря их способности к укоренению.

В результате экспериментов по генетической трансформации бинарными векторами pBI121ac, pR830, pB-AMP2 и pB-AMP1 получено соответственно 6, 10, 17 и 13 независимых линий, интенсивно и полноценно развивающихся из каллусной ткани.

Для подтверждения интеграции целевого и маркерного генов в геном томата был проведен ПЦР-анализ. При амплификации с использованием специфических праймеров на последовательность гена nptII были получены фрагменты, соответствующие положительному контролю во всех случаях (рис. 1А, 2А). Интеграция целевых генов ас, Rs-intron-Shir (рис. 1Б) и amp1 (рис. 2Б), как и в случае маркерного гена, показана во всех проанализированных образцах. Полноразмерная копия кДНК гена Stellaria media L., интегрированная в геном томата при трансформации бинарным вектором pB-AMP2, отмечена только у 11 из 17 независимо регенерированных побегов.

Кроме того, у всех изученных образцов была проведена проверка препаратов тотальной ДНК на отсутствие бактериального гена virB с целью исключения ложноположительных результатов вследствие бактериальной контаминации. Все проанализированные образцы были свободны от агробактерии.








Рисунок 1. Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК регенерантов томата, трансформированных конструкциями с генами хитинсвязывающих белков, на наличие фрагментов маркерного (А) и целевых (Б) генов при помощи ПЦР-анализа: 1 – молекулярный маркер GeneRulerTM100 bp Plus DNA ladder; 2 – вода; 3 – отрицательный контроль (дикий тип); 4-9 – регенеранты томата, трансформированные конструкцией pBI121ac; 11-20 – регенеранты томата, трансформированные конструкцией pR830; 10, 21 – положительный контроль (плазмиды pBI121ac и pR830).





Рисунок 2. Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК регенерантов томата, трансформированных конструкциями с генами гевеин-подобных антимикробных пептидов, на наличие фрагментов маркерного (А) и целевых (Б) генов при помощи ПЦР-анализа: 1 – молекулярный маркер GeneRulerTM100 bp Plus DNA ladder; 2 – вода; 3 – отрицательный контроль (дикий тип); 4-16 – регенеранты томата, трансформированные конструкцией pB-АМР1; 18-34 – регенеранты томата, трансформированные конструкцией pB-АМР2; 17, 35 – положительный контроль (плазмиды pB-АМР1и pB-АМР2).


Таким образом, эффективность трансформации по целевому гену при использовании векторных конструкций pBI121ac, pR830, pB-AMP2 и pB-AMP1 составила соответственно 6,7; 8,4; 8,8 и 11,3%.

Анализ экспрессии целевых генов у трансгенных растений проводили методом ОТ-ПЦР. Поскольку РНК значительно менее стабильна, чем ДНК, необходимым условием при проведении ОТ-ПЦР-анализа является использование так называемого внутреннего маркера, в частности, гена актина для подтверждения сохранности РНК и синтезированной на её основе кДНК. При амплификации со специфическими праймерами на последовательность гена Tom 52 на электрофореграмме детектировались фрагменты соответствующего размера (450 п.о.) у всех изученных образцов (рис 3в, г, рис 4в, г).





Рисунок 3. Анализ экспрессии генов, кодирующих хитинсвязывающие белки (ас – a; RS-intron-Shir – б) и актин (Tom 52) (в, г), в трансгенных растениях томата методом ОТ-ПЦР: 1, 11, 23, 33 – молекулярный маркер FastRulerTM Low Range DNA ladder; 2, 12, 24, 34 – вода; 3, 13, 25, 35 – отрицательный контроль (нетрансгенное растение); 4-9, 26-31 – трансгенные растения, содержащие ген ас (соответственно линии 105, 106, 224, 250, 506, 702); 10, 32 – положительный контроль (плазмида pBI121ac); 14-21, 36-43 – трансгенные растения, содержащие ген RS-intron-Shir (соответственно линии 3/11b, 5/12, 6/11, 7/12, 8/14, 8/25, 12/11, 12/32); 22, 44 – положительный контроль (плазмида pR830).





Рисунок 4. Анализ экспрессии генов, кодирующих гевеин-подобные антимикробные пептиды (amp1 – a; amp2 – б) и актин (Tom 52) (в, г), в трансгенных растениях томата методом ОТ-ПЦР: 1, 15, 29, 43 – молекулярный маркер FastRulerTM Low Range DNA ladder; 2, 16, 30, 44 – вода; 3, 17, 31, 45 – отрицательный контроль (нетрансгенное растение); 4-13, 32-41 – трансгенные растения, содержащие ген аmp1 (соответственно линии 2/11, 2/21, 3/35, 4/33, 4/42, 5/11, 6/17, 8/25, 9/11, 9/32); 14, 42 – положительный контроль (плазмида pB-AMP1); 18-27, 46-55 – трансгенные растения, содержащие ген аmp2 (соответственно линии 3/13, 4/34, 5/32, 5/48, 5/51, 6/41, 8/12, 8/24, 9/44, 11/24); 28, 56 – положительный контроль (плазмида pB-AMP2).


Установлено, что экспрессия целевого гена на транскрипционном уровне отмечена у всех 6 регенерантов, содержащих в геноме хитинсвязывающий ген ас, а также у 7 из 8 проанализированных растений, содержащих гибридный ген Rs-intron-Shir (рис 3a, б). Использование праймеров на нуклеотидную последовательность генов, кодирующих гевеин-подобные пептиды, позволило установить образование мРНК у 6 из 10 трансгенных растений с геном amp2 и у 8 из 10 трансгенных растений с геном amp1 (рис. 4а, б).

Трансгенные регенеранты были клонально размножены, успешно адаптированы к условиям in vivo и выращены в условиях защищенного грунта (рис. 5).




Рисунок 5. Коллекция трансгенных линий томата с генами хитинсвязывающего белка ac (А) и гевеин-подобного антимикробного пептида amp2 (Б). Клональное размножение (В) и выращивание трансгенных линий томата в условиях защищенного грунта (Г).


В процессе выращивания были отмечены линии, фенотипически отличающиеся от контрольных растений, которые характеризовались большей высотой, количеством междоузлий, формированием утолщенных листовых пластинок. Установлено, что у ряда линий не происходило формирование плодов и соответственно семян. В некоторых случаях происходило образование бессемянных деформированных плодов.

Потомство Т1-трансгенных линий, полученных в результате самоопыления, проанализировано на определение характера наследования гена npt II по признаку устойчивости к канамицину. По результатам генетического анализа было установлено, что у большинства проанализированных линий соотношение канамицин-устойчивых к канамицин-чувствительным проросткам соответствует 3:1, что свидетельствует об интеграции в геном одной копии гена npt II. Установлено, что у линии с гибридным геном Rs-intron-Shir (8/14) большая часть потомства от самоопыления оказалась устойчивой к канамицину, что свидетельствует о присутствии в геноме двух вставок гена npt II. Кроме того, у одной линии, содержащей ген amp 2 (8/12), семенное потомство проявляло канамицин-чувствительный фенотип, что свидетельствует о полной потери экспрессии гена npt II (табл. 3).


Таблица 3.

Анализ наследования гена npt II в поколении Т1-трансгенных растений томата.



Ген
Линия
Количество проростков, шт.
χ2
Расщепление

общее
KmR
KmS

RS-intron-Shir
8/14
151
138
13
1,43
15:1

7/12
79
60
19
0,04
3:1

5/12
108
80
28
0,05
3:1

amp1
6/17
79
63
16
0,95
3:1

4/42
140
110
30
0,95
3:1

4/33
105
86
19
2,67
3:1

amp2
4/34
124
96
28
0,39
3:1

9/44
82
61
21
0,02
3:1

8/12
124
0
124
-
-
Примечание: KmR – канамицин-устойчивые проростки;

KmS – канамицин-чувствительные проростки;

χ2 теор. = 3,84 (df=1; α=0,05)


Для лабораторной оценки на устойчивость к фитофторозу было отобрано по пять линий Т0 с каждым гетерологичным геном. Проанализированы растения, экспрессирующие гены хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов, исходная линия ЯЛФ (контроль №1), а также трансгенные линии, у которых не происходило образование мРНК целевых генов (контроль №2).

В результате заражения сегментов листа зооспорангиями P. infestans (Mont.) de Bary установлено, что изоляты, выделенные из томата, обладают значительно большей агрессивностью, чем изолят, выделенный из картофеля. Первые симптомы развития болезни, выражающиеся в появлении инфекционного пятна у большинства трансгенных образцов в месте нанесения суспензии, проявились на вторые сутки после инокуляции изолятом ИК3. Следует отметить, что заражение контроля №1 происходило несколько позже (через 72 часа после инокуляции), но существенно активнее в динамике. В случае инокуляции тестируемых образцов «томатными» изолятами ТПМ и ТЛЗ первые симптомы проявления фитофтороза отмечались также позже, чем при заражении изолятом ИК3. Однако на 5 сутки отмечено активное проявление болезни (интенсивное спороношение на уровне 3-4 баллов) у всех трансгенных линий, экспрессирующих гены ас, Rs-intron-Shir, amp2 и amp1, а также контрольных образцов. Это способствовало тому, что к завершению эксперимента их листовая ткань полностью некротизировалась. Таким образом, все изученные растения были сильно восприимчивы к изолятам ТПМ и ТЛЗ P. infestans. Статистически значимых различий по устойчивости между вариантами не установлено.

Существенные различия по степени устойчивости были обнаружены при инокуляции тестируемых линий изолятом ИК3 (табл. 4; рис. 6). Установлено, что у двух линий, экспрессирующих соответственно ген amp1 и amp2, на 7 сутки эксперимента не наблюдалось никаких признаков проявления болезни.


Таблица 4.

Оценка устойчивости трансгенных и контрольных растений томата к изоляту ИК3 Phytophthora infestans (Mont.) de Bary.


Ген
Линия
Площадь инфекционного пятна (см2)1
Класс устойчивости

ac
106
0,37 abcd
III

224
0,06 ab
II

250
0,02 a
II

506
0,10 abc
II

702
0,49 abcde
III

Rs-intron-Shir
3/11b
0,90 cdef
III

5/12*
0,25 abcd
III

6/11
1,28 efg
III

7/12
0,85 bcdef
III

8/14
0,30 abcd
III

amp1
3/35
0 a
I

4/33*
0,35 abcd
III

4/42
2,46 h
IV

6/17
1,53 fgh
V

9/32
0,44 abcde
III

amp2
3/13
0 a
I

5/48
2,24 gh
V

8/12
0,06 ab
II

9/44*
0,37 abcd
III

11/24
0,02 a
II

-
ЯЛФ

0,96 def
III



* – трансгенные растения без экспрессии целевого гена (контроль №2);

1 – площадь инфекционного пятна с учетом преобразования с помощью ;

Примечание. Варианты, сопровождаемые одинаковыми буквами, статистически незначимо отличаются по критерию Дункана (α=0,05).