Влияние экспрессии гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов в трансгенных растениях томата ( Solanum lycopersicum L.) на повышение их устойчивости к фитопатогенам
| Вид материала | Автореферат |
- Тема: Аминокислоты, пептиды, белки, 124.2kb.
- Ществ, влияя непосредственно или через изменение экспрессии генов различных белков,, 219.65kb.
- Синтез пуриновых нуклеотидов, 49.64kb.
- План лекций по биологической химии для студентов лечебного факультета, 66.35kb.
- Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени инбредных, 408.21kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 365kb.
- Лекарственные растения и сырье, содержащие сердечные (кардиотонические) гликозиды, 226.62kb.
- К. Б. Терёшкина молекулярная динамика белков и пептидов методическое пособие, 1231.52kb.
- На прошлой лекции было дано краткое введения в биоинформатику днк-биочип-экспериментов, 172.51kb.
- Вопросы к экзамену по курсу «Молекулярная биология» (вечернее отделение), 36.64kb.
Рисунок 6. Сегменты листа устойчивой (А) и чувствительной (Б) трансгенных линий томата (соответственно линии 3/35 и 6/11), а также нетрансформированного контроля (В) на 7 сутки после инокуляции зооспорангиями изолята ИК3 Phytophthora infestans (Mont.) de Bary.
Кроме того, у трех линий, содержащих ген ас, и у двух линий, содержащих ген amp2, площадь инфекционного пятна в месте нанесения инокулюма была минимальной (не превышала 0,1 см2) и существенно отличалась от соответствующего значения контрольного нетрансгенного образца (0,96 см2). Показано, что все линии, содержащие ген Rs-intron-Shir, не отличались повышенной устойчивостью к «картофельному» изоляту по сравнению с контролем №1.
Достоверное снижение устойчивости к изоляту ИК3 P. infestans (Mont.) de Bary по сравнению с нетрансформированной линией ЯЛФ в тесте с отделенными листьями наблюдали у 3 из 16 трансгенных растений (18,8%). Так, площадь инфекционного пятна у линий, экспрессирующих ген amp1 (4/42) и amp2 (5/48), была существенно больше, чем у контроля №1. Кроме того, на поверхности сегментов листа линий 5/48 и 6/17 наблюдалось спороношение на уровне 2-3 баллов, которое не отмечено ни у нетрасформированного образца, ни у других тестируемых трансгенных линий. Причиной снижения устойчивости может служить негативное плейотропное воздействие трансгена, отмеченное также при интродукции гена хитиназы в геном картофеля (Шахбазов и др., 2008).
По результатам проведенной оценки испытуемых линий с использованием изолята ИК3 P. infestance (Mont.) de Bary все линии были подразделены на следующие классы, различающиеся по степени устойчивости (в порядке убывания): I – линии, у которых не отмечено симптомов развития болезни; II – линии, у которых в месте нанесения инокулюма наблюдалось образование инфекционного пятна, площадь которого не превышала 0,1 см2 и была существенно ниже, чем у контроля №1; III – линии, у которых в месте нанесения инокулюма наблюдалось образование инфекционного пятна, площадь которого статистически незначимо отличалась по сравнению с контролем №1; IV – линии, у которых в месте нанесения инокулюма площадь инфекционного пятна была больше и существенно отличалась по сравнению с контролем №1; V – линии, у которых в месте нанесения инокулюма площадь инфекционного пятна была на уровне или больше, чем у контроля №1, а также наблюдалось спороношение.
Таким образом, установлено, что при инокуляции сегментов листьев изолятом ИК3 P. infestance (Mont.) de Bary три линии, экспрессирующие ген ас, три линии, экспрессирующие ген amp2, и одна линия, экспрессирующая ген amp1, достоверно отличались повышенной устойчивостью по сравнению с нетрансформированным контролем. Полученные результаты свидетельствуют о положительном влиянии экспрессии генов хитинсвязывающего белка из Amaranthus caudatus L. и гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. в трансгенных растениях томата селекционной линии ЯЛФ на повышение устойчивости к возбудителю фитофтороза. Экспериментальные данные позволяют предположить перспективность использования вышеперечисленных гетерологичных генов для генетической трансформации промышленных сортов с целью повышения устойчивости к P. infestance (Mont.) de Bary и соответственно увеличения их продуктивности и качества товарной продукции. Одним из таких перспективных промышленных сортов томата является Рекордсмен, включенный в 2004 г. в Государственный реестр селекционных достижений, допущенных к использованию на территории РФ. Сорт предназначен для выращивания в открытом грунте и находит широкое применение в Астраханской, Волгоградской и ряде других областей, являющихся основными отечественными поставщиками томата на российский рынок. Товарная продукция рекомендована для приготовления томатопродуктов.
- Разработка эффективной системы регенерации в условиях in vitro промышленного сорта томата Рекордсмен.
Одним из важнейших условий осуществления генетической трансформации является наличие высокой способности к регенерации полноценных фертильных побегов из культивируемых тканей и органов. При проведении агробактериальной трансформации растительные ткани подвержены целому ряду стрессовых факторов. Среди них можно отметить поранение экспланта, непосредственный контакт с патогенным микроорганизмом, как правило, длительное культивирование на средах с регуляторами роста и селективными антибиотиками, а также сама инсерция Т-ДНК в геном. В связи с этим, регенерация целого растения является одним из наиболее критических этапов всей процедуры переноса гетерологичной ДНК, что требует проведения ряда экспериментов, направленных на разработку протокола эффективной и стабильной регенерации целых растений в культуре in vitro с частотой не ниже 80%.
Анализ литературных данных свидетельствовал о том, что ранее морфогенетическая реакция в культуре ткани томата сорта Рекордсмен не изучалась, поэтому одной из задач настоящего исследования было оценить регенерационную способность различных типов эксплантов и на ее основе разработать методику эффективной регенерации.
При помещении сегментов гипокотилей и семядолей на питательные среды различного состава наблюдалось увеличение размера клеток у обоих типов эксплантов. Так, уже на 5 сутки культивирования образовывались утолщения в виде разросшихся тканей, на которых впоследствии формировалась каллусная ткань.
У
становлено, что добавление в состав питательной среды регуляторов роста оказывало существенное влияние на процесс каллусогенеза (рис. 7). Рисунок 7. Эффективность каллусообразования эксплантов семядолей и гипокотилей при культивировании на питательных средах с различными типами и концентрациями регуляторов роста.
Так, на среде, не содержащей регуляторов роста (MS0), интенсивность нарастания каллусной ткани у гипокотилей была слабой, а у семядолей каллусогенез отсутствовал вовсе. В последнем случае наблюдалась массовая гибель клеток, в результате чего экспланты семядолей были полностью подвержены некрозу и прохождение дальнейших процессов морфогенеза отсутствовало.
При помещении семядолей на питательные среды с добавлением регуляторов роста частота каллусообразования была максимальной и составила 100%. Аналогичные результаты наблюдались и при культивировании сегментов гипокотилей на средах MS2, MS3, MS4, MS5 и MS7, содержащих 1 и 2 мг/л зеатина в сочетании с различными типами и концентрациями ауксина. Повышение концентрации зеатина (3-5 мг/л), а также использование большинства концентраций 6-БАП (MS11, MS12, MS13) в составе питательной среды существенно ингибировало процесс формирования каллуса у эксплантов гипокотилей. В целом, установлено, что каллусообразующая способность семядолей была существенно выше (93,8%), чем гипокотилей (86,2%).
Образующаяся на семядолях и гипокотилях каллусная ткань при культивировании на различных вариантах сред была преимущественно светло-зеленого или желто-зеленого цвета, плотной зернистой структуры (рис. 8).
Рисунок 8. Формирование каллусной ткани у эксплантов семядолей (А) и гипокотилей (Б) томата сорта Рекордсмен.
Данный тип каллуса обладал высокой морфогенетической способностью, в результате чего в конце первого – начале второго пассажей отмечалось образование большого количества меристематически активных участков, на которых впоследствии и происходила регенерация побегов.
Наибольшая частота регенерации побегов из семядолей отмечена при культивировании эксплантов на среде MS1, содержащей 1 мг/л зеатина и 0,1 мг/л индолилуксусной кислоты (93,3%). Однако этот вариант статистически незначимо отличался от питательных сред, содержащих 1 и 2 мг/л зеатина в сочетании с более высокими концентрациями ИУК (MS2, MS3, MS6), а также при использовании НУК в качестве ауксинового компонента (MS4, MS7) (табл. 5).
Таблица 5.
Эффективность органогенеза побегов томата сорта Рекордсмен и их морфометрическая характеристика.
| Вариант среды | Частота регенерации1, % | Количество побегов на один эксплант2, шт. | Длина побега3, см | |||
| семядоли | гипокотили | семядоли | гипокотили | семядоли | гипокотили | |
| MS0 | 0,0 a | 39,3 efg | 0 a | 2,65 de | - | 2,47 ± 0,21 |
| MS1 | 93,3 h | 50,0 efg | 2,28 fg | 2,10 cde | 1,67 ± 0,1 | 0,9 ± 0,17 |
| MS2 | 90,8 gh | 88,4 h | 2,35 g | 2,65 e | 2,11 ± 0,18 | 0,57 ± 0,01 |
| MS3 | 77,8 fgh | 61,8 fgh | 2,06 efg | 1,59 bcde | 1,82 ± 0,02 | 0,51 ± 0,14 |
| MS4 | 68,9 efgh | 67,1 gh | 1,82 defg | 1,72 bcde | 1,24 ± 0,1 | 0,61 ± 0,06 |
| MS5 | 4,5 ab | 1,2 a | 0,61 abc | 0,54 ab | 0,65 ± 0,15 | 0,6 |
| MS6 | 58,7 cdefgh | 36,0 defg | 1,46 сdefg | 1,34 abcde | 1,61 ± 0,24 | 1,1 ± 0,14 |
| MS7 | 64,1 defgh | 58,5 fgh | 1,59 cdefg | 1,37 abcde | 1,29 ± 0,13 | 0,75 ± 0,04 |
| MS8 | 16,4 abc | 53,3 efg | 0,80 abcd | 1,50 bcde | 1,14 ± 0,04 | 0,48 ± 0,02 |
| MS9 | 34,8 bcdef | 28,5 cdefg | 1,19 bcdef | 1,40 abcde | 1,02 ± 0,37 | 0,54 ± 0,18 |
| MS10 | 25,0 bcde | 26,5 bcdef | 0,90 bcd | 1,53 bcde | 1,03 ± 0,1 | 0,59 ± 0,15 |
| MS11 | 19,3 abcd | 2,4 ab | 0,99 bcde | 0,30 a | 0,81 ± 0,16 | 1,25 |
| MS12 | 22,2 abcde | 4,5 abc | 1,16 bcdef | 0,61 ab | 0,77 ± 0,31 | 0,95 ± 0,15 |
| MS13 | 10,8 ab | 19,3 abcde | 0,69 abc | 0,99 abc | 2,9 ± 0,6 | 1,24 ± 0,29 |
| MS14 | 22,2 abcde | 4,5 abc | 1,56 cdefg | 0,46 ab | 2,97 ± 1,72 | 0,5 ± 0,2 |
| MS15 | 2,4 ab | 23,2 bcdef | 0,30 ab | 0,99 abc | 0,75 | 0,88 ± 0,31 |
| Средняя | 38,2 a | 35,3 a | 1,24 a | 1,36 a | - | - |
1 – частота регенерации побегов с учетом преобразования с помощью угол – арксинус
;2 – количество побегов на одном экспланте с учетом преобразования с помощью
;3 – длина побега ± ошибка средней;
Примечание. Варианты, сопровождаемые одинаковыми буквами, статистически незначимо отличаются по критерию Дункана (α=0,05).
Снижение процессов морфогенеза наблюдалось при применении высоких концентраций зеатина. Аналогичные результаты обнаружены и при культивировании сегментов гипокотилей, за исключением варианта с использованием среды MS2, где была достигнута максимальная частота регенерации (88,4%), тогда как применение среды МS1 было не столь эффективным (50,0%).
В результате проведенного исследования установлено, что высокая концентрация НУК (0,5 мг/л) способствовала сильному ингибированию пролиферации побегов как из эксплантов семядолей, так и из гипокотилей. Кроме того, регенеранты, полученные на этом варианте, имели редуцированный статус (менее 1 см в длину), а количество побегов, полученных от одного экспланта, было сравнительно низким. Отмечена значительно более высокая частота регенерации побегов и большее их число при культивировании семядолей и гипокотилей на средах, содержащих 1 и 2 мг/л зеатина в сочетании с ауксином в низких концентрациях (0,1 и 0,2 мг/л) по сравнению со средами, содержащими 6-БАП в качестве источника цитокинина. Кроме того, при использовании зеатина в низких концентрациях регенерация адвентивных побегов начиналась на 3-5 дней быстрее, чем в вариантах с 6-БАП.
Рядом авторов приводятся сведения о положительном эффекте двух типов цитокининов на клеточную дифференциацию эксплантов томата in vitro (Osman et al., 2010; Krasnyanski et al., 2001). В настоящем исследовании сочетание 1 мг/л зеатина и 2,5 мг/л 6-БАП не только не способствовало увеличению, а, наоборот, существенно редуцировало частоту регенерации побегов из эксплантов семядолей и гипокотилей, а также снижало их количество по сравнению со средой MS2, содержащей один источник цитокина (зеатин) в концентрации 1 мг/л.
Данные дисперсионного анализа не установили статистически значимых различий между типами эксплантов (в среднем по всем изученным вариантам питательных сред) по показателям частоты регенерации побегов (38,2% у семядолей и 35,3% у гипокотилей), а также по их количеству с одного экспланта (1,24 побега на семядолях и 1,36 побега на гипокотилях).
Таким образом, разработан протокол эффективной регенерации растений из соматических тканей томата промышленного сорта Рекордсмен. Использование 1 мг/л зеатина в сочетании с 0,2 мг/л ИУК обеспечивало наибольший выход регенерантов как из эксплантов семядолей, так и гипокотилей. Данный состав питательной среды впоследствии был использован в эксперименте по генетической трансформации.
- Разработка системы агробактериальной трансформации томата промышленного сорта Рекордсмен.
Успех в получении трансгенных растений во многом зависит от выбора концентрации селективного агента, позволяющего проводить селекцию трансформированных клеток, которые составляют весьма небольшую часть среди всех клеток экспланта. Для определения оптимальной концентрации селективного агента была проведена оценка влияния канамицина на прохождение процессов морфогенеза из эксплантов семядолей и гипокотилей. Установлено, что привнесение канамицина в состав регенерационной среды приводило к возрастанию степени некротизации обоих типов эксплантов и ингибированию процессов морфогенеза. Определено, что оптимальной концентрацией канамицина для отбора трансформированных клеток является 25 мг/л.
В эксперименте по генетической трансформации бинарным вектором pBINmGFP5ER было использовано 150 эксплантов семядолей и 100 сегментов гипокотилей. После периода инокуляции и совместного кокультивирования с агробактерией экспланты помещали на регенерационную среду, содержащую регуляторы роста в оптимальном соотношении (1 мг/л зеатина и 0,2 мг/л ИУК) и антибиотик тиментин в концентрации 300 мг/л для элиминации агробактерии. В результате в начале первого пассажа происходило увеличение размера клеток растительной ткани и образование многочисленных глобулярных очагов каллусной ткани на всей поверхности трансформированных и контрольных семядолей. Частота каллусообразования эксплантов семядолей составила 90,0%. Что касается сегментов гипокотилей, формирование небольших очагов каллуса происходило по краям срезов и отмечалось лишь у 10,0% эксплантов.
После переноса эксплантов на среду с добавлением 10 мг/л селективного антибиотика наблюдалась некротизация каллусной ткани трансформированных и контрольных эксплантов, причем интенсивность ее значительно увеличилась при последующем культивировании на более высоких концентрациях канамицина (25 мг/л). Побеги, регенерированные в течение 1-го – 2-го пассажей, впоследствии проявляли признаки хлороза. Помимо высокой реакции чувствительности эксплантов к канамицину, у части семядолей наблюдалась бактериальная контаминация. Отмеченные явления приводили к тому, что после 1,5 месяцев культивирования большинство эксплантов погибло (табл. 6).
Таблица 6.
Эффективность каллусообразования и селекции трансформантов томата сорта Рекордсмен при использовании векторной конструкции pBINmGFP5ER.
| Тип экспланта | Количество эксплантов | |||||||||
| общее | образовавших каллус | погибших | прошедших селекцию | |||||||
| шт. | % | шт. | % | от бактерии | от канамицина | шт. | % | |||
| шт. | % | шт. | % | |||||||
| семядоли | 150 | 100 | 135 | 90,0 | 18 | 12,0 | 131 | 87,3 | 1 | 0,7 |
| гипокотили | 100 | 100 | 10 | 10,0 | 0 | 0 | 100 | 100 | 0 | 0 |
Рисунок 9. Этапы генетической трансформации томата сорта Рекордсмен при использовании вектора pBINmGFP5ER: А) трансформированные и контрольные экспланты семядолей; Б) формирование каллуса и начало регенерации побегов на селективной среде с добавлением 25 мг/л канамицина; В) массовая регенерация канамицин-устойчивых побегов; Г) укоренение побегов на среде для ризогенеза с добавлением 100 мг/л канамицина.
В результате проведенного ПЦР-анализа было установлено, что все пять полученных канамицин-устойчивых регенерантов являются трансгенными как по селективному, так и репортерному генам (рис. 10).
Флуориметрический анализ установил наличие стабильной экспрессии репортерного гена GFP в листьях и корнях трансгенных растений (рис. 11).
Рисунок 10. Электрофореграмма продукта амплификации геномной ДНК канамицин-устойчивых регенерантов томата на наличие фрагментов генов gfp (А), nptII (Б) и virB (В) при помощи метода ПЦР-анализа: 1 – молекулярный маркер FastRulerTM Low Range DNA ladder; 2 – вода; 3 – отрицательный контроль (дикий тип); 4-8 – трансгенные регенеранты томата; 9 – положительный контроль (плазмида pBINmGFP5ER).
Рисунок 11. Детекция экспрессии гена gfp в листьях и корнях растений томата: 1) контрольное (нетрансгенное) растение; 2) трансгенное растение; а) лист; б) корень.
Таким образом, в результате проведенных исследований разработана система агробактериальной трансформации томата промышленного сорта Рекордсмен. Эффективность трансформации при использовании эксплантов семядолей составила 0,7%, тогда как применение гипокотилей не привело к получению трансгенных растений. Полученные результаты согласуются с литературными данными, что коммерчески значимые сорта обладают меньшей, чем модельные генотипы эффективностью трансформации и требуют индивидуальной разработки протоколов агробактериальной трансформации (Дрейпер и др., 1991; Sharma et al., 2009; Chaudhry and Rashid, 2010). Разработанная система генетической трансформации позволяет впоследствии интегрировать гетерологичные гены в геном томата промышленного сорта Рекордсмен, в том числе, гены, кодирующие хитинсвязывающий белок из Amaranthus caudatus L. и гевеин-подобные антимикробные пептиды из Stellaria media L.
ВЫВОДЫ
- Методом агробактериальной трансформации получены трансгенные растения томата селекционной линии ЯЛФ (6, 7, 6 и 8 независимых линий с генами ас, Rs-intron-Shir, amp1 и amp2 соответственно), у которых экспрессия гетерологичных генов хитинсвязывающих белков и гевеин-подобных антимикробных пептидов подтверждена молекулярно-генетическим анализом.
- Экспрессия генов хитинсвязывающих белков из Amaranthus caudatus L. и гевеин-подобных антимикробных пептидов из Stellaria media L. в трансгенных растениях томата селекционной линии ЯЛФ приводит к повышению устойчивости к возбудителю фитофтороза.
- Установлен различный характер наследования селективного гена npt II в поколении Т1-трансгенных растений томата селекционной линии ЯЛФ. У семи трансгенных линий содержится одна инсерция гена npt II, у одной линии – две инсерции гена npt II. У одной линии наблюдалось замолкание экспрессии селективного гена.
- Разработана методика эффективной регенерации и агробактериальной трансформации томата промышленного сорта Рекордсмен.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Халилуев М.Р., Харченко П.Н., Долгов С.В. Разработка системы регенерации и изучение трансформационного потенциала томата промышленного сорта // Доклады РАСХН. 2010. № 3. С. 22-26.
- Халилуев М.Р., Харченко П.Н., Долгов С.В. Генетическая трансформация томата (Solanum lycopersicum L.) генами защитных хитинсвязывающих белков и антимикробных пептидов // Известия ТСХА. 2010. № 6. С. 75-83.
- Чабан И.А., Халилуев М.Р., Долгов С.В. Цитоэмбриологическое изучение трансгенных растений томатов с аномальным фенотипом // Тезисы III Всероссийского симпозиума «Физиология трансгенного растения и фундаментальные основы биобезопасности» (Москва, 18-21 октября 2010 г). С. 84.
- Халилуев М.Р., Мамонов А.Г., Смирнов А.Н., Долгов, С.В. Получение трансгенных растений томата (Solanum lycopersicum L.) с повышенной устойчивостью к фитофторозу // Тезисы Всероссийского симпозиума «Растение и стресс» (Москва, 9-12 ноября 2010 г). С. 373-374.
БЛАГОДАРНОСТИ
Автор выражает искреннюю благодарность всем соавторам по публикациям, которые оказывали неоценимую помощь на разных этапах работы. Благодарю за многочисленные ценные советы, помощь при проведении исследований и дружескую поддержку всех сотрудников лаборатории генной инженерии растений Всероссийского НИИ сельскохозяйственной биотехнологии. Особую признательность автор выражает всем своим близким, в особенности, родителям, за всестороннюю помощь, поддержку и терпение.