Биоремедиация объектов окружающей среды yглеводородокисляющими микроорганизмами рода Pseudomonas 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 16 экология

Вид материала

Автореферат

Содержание Цель исследования Задачи исследования Научная новизна Pseudomonas aeruginosa Основные положения, выносимые на защиту Pseudomonas aeruginosa Практическая ценность работы. Pseudomonas aeruginosa Связь диссертации с планами НИР. Апробация работы. Личный вклад диссертанта в разработку научных результатов, выносимых на защиту. Структура и объем диссертационной работы. Основная часть 2.2 Материалы исследования Методы исследований 3.1 Восстановление окружающей природной среды от углеводород-ного загрязнения на основе использования микробных культур рода Pse 3.1.2 Изучение идентификационных признаков и свойств выделенных углеводородокисляющих бактерий 3.2 Деструкция нефти и нефтепродуктов бактериями рода Pseudomonas P. putida P. aeruginosa ... Полное содержание

Подобный материал:

• Задачи дисциплины: ознакомить студентов с существующими методами химического и физико-химического, 20.52kb.
• Программа дисциплины Практикум по аналитической химии объектов окружающей среды Новосибирск, 158.39kb.
• Контрольная работа по дисциплине Микробиология По теме Общая и специальная микробиология, 208.97kb.
• Программа дисциплины дпп. Р. 01 Экология и охрана окружающей среды цели и задачи курса, 147.68kb.
• Окружающей среды республики, 1450.06kb.
• Л. Г. Наумова Б. М. Миркин Основы общей экологии Б. М. Миркин, Л. Г. Наумова Основы, 2543.68kb.
• Изучение влияния фитонцидов цветочно-декоративных культур закрытого грунта на микробиологическую, 63.59kb.
• Бактерии рода enterococcus в озере байкал: Распределение, видовой состав, механизм, 275.08kb.
• Взаимосвязь пластического и энергетического об­мена веществ, 1100.63kb.
• Рабочая программа дисциплины «химический анализ объектов окружающей среды» Направление, 311.39kb.

УДК 502. 521: 579. 841.11 На правах рукописи


ДЖУСУПОВА ДАРИЯ БЕКАЙДАРОВНА


Биоремедиация объектов окружающей среды

yглеводородокисляющими микроорганизмами рода Pseudomonas


03.00.07 - микробиология

03.00.16 – экология


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Республика Казахстан

Алматы, 2010


Работа выполнена в Казахском национальном университете им. аль-Фараби


Научные консультанты: доктор биологических наук,

профессор А.А. Жубанова


доктор биологических наук,

профессор Л.А.Головлева


Официальные оппоненты доктор биологических наук,

профессор Исаева А.У.

доктор биологических наук,

профессор Абжалелов А.Б.


доктор биологических наук,

профессор Дженбаев Б.М.


Ведущая организация: Казахский национальный

аграрный университет


Защита состоится 2 июля 2010 г. в 14-00 часов на заседании объединенного диссертационного совета ОД 53.24.01 при РГП «Центр биологических исследований» ДГП «Институт микробиологии и вирусологии» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан по адресу: 050010, г.Алматы, ул.Богенбай батыра, 103.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ДГП «Институт микробиологии и вирусологии» Комитета науки Министерства образования и науки Республики Казахстан

Автореферат разослан июня 2010 года


Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Бекмаханова Н.Е.


ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы.

Рациональное использование природных ресурсов и охрана окружающей среды от загрязнения – наиболее важные проблемы современности, от решения которых зависит здоровье и благосостояние людей.

В Казахстане особенно сильно загрязнена водная и воздушная среда, причем основными загрязнителями водных объектов в настоящее время явля-ются промышленные предприятия. Для предприятий нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности вопросы охраны окружающей среды становятся все более актуальными. Возросшая экологическая опасность данных предприятий связана с выбросами в окружающую среду вредных веществ, появлением новых, зачастую трудноразлагаемых отходов и несовершенными природоохранными мероприятиями.

Нефть и продукты ее переработки (толуол, ксилолы, стирол, дизельное топливо и др.) оказывают отрицательное воздействие на воздух, воду и почву и потому предприятия по добыче и переработке нефти остаются крупнейшими в промышленности источниками загрязнения окружающей среды. На их долю приходится около 48% выбросов вредных веществ в атмосферу, 27% сброса загрязненных сточных вод, свыше 30% твердых отходов [Пиковский Ю.И.,1993].

Среди всех отраслей производства наиболее активные потребители воды - черная металлургия, химическая, лесохимическая и нефтеперерабатывающая промышленности. Забирая чистую воду, промышленное предприятие превра-щает ее в загрязненную, причем состав сточных вод и концентрация загряз-нителей зависят от профиля производства. Помимо общих показателей загряз-нения, промышленные сточные воды содержат специфические, часто токсич-ные вещества.

Заметное негативное влияние предприятия нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности оказывают и на состояние атмосферного воздуха, что обусловлено их деятельностью и сжиганием продуктов переработки нефти.

В настоящее время в мировой практике для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов широко применяются биотехнологические методы, основанные на использовании высокоактивных микроорганизмов-деструкто-ров. Созданные на их основе биопрепараты, а также технологии позволяют производить очистку воздуха, почвенных и водных экосистем от загрязнений нефтепродуктами. Такая технология получила название «биоремедиация».

К примеру, технология микробиологической очистки сточных вод и воздуха от токсичных летучих углеводородов основана на деструктивной активности специально полученных высокоактивных микроорганизмов, как правило, иммобилизованных на устойчивых к разложению носителях. Длитель-ное сохранение высокой активности используемых микроорганизмов во многом определяется и выбором установок по биологической очистке, обеспечи-вающих наиболее оптимальные условия для процесса биоразложения.

Определяющая роль углеводородокисляющих микроорганизмов в процессе очистки нефтезагрязненных экосистем была описана многими исследователями [Скрябин Г.К., Головлева Л.А.,1984; Миронова Р.И., Носкова Р.П., Кисулова Г.Е., 1996; Позднякова Н.Н., Никитина В.Е., Турковская О.В., 2008]. Тем не менее, несмотря на значительное количество исследований в этом направлении, поиск путей эффективной биодеградации нефти и нефтепродуктов на основе этих микроорганизмов представляется весьма актуальным.

Известно, что бактерии рода Pseudomonas, благодаря разнообразию катабо-лических реакций, высокой скорости роста на различных субстратах, особенностям генетической организации, способны к окислительной дегра-дации целого ряда сложных и простых углеводородов и потому могут быть предложены для создания биопрепаратов для очистки сточных и природных вод, почв, атмосферы от нефти и продуктов ее переработки с высокой био-деструктивной активностью.

Цель исследования. Цель работы - научно-технологическое обоснование практического использования углеводородокисляющих микроорганизмов рода Pseudomonas для биоремедиации объектов окружающей среды от техногенных загрязнений нефтяного происхождения.

Задачи исследования:

- определить токсическое действие ароматических углеводородов на коллекционные бактериальные штаммы различного систематического положе-ния и микрофлору биоценоза очистных сооружений АО «Карбид» г.Темиртау для выявления устойчивой доминирующей углеводородокисляющей группы микроорганизмов;

- выделить из почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами активные штаммы углеводородокисляющих микроорганизмов и провести их идентификацию;

- исследовать влияние физико-химических факторов на рост углеводород-окисляющих микроорганизмов рода Pseudomonas на нефти и нефтепродуктах;

- изучить углеводородокисляющую способность активных бактерий рода Pseudomonas, выделенных из загрязненных нефтью почв и морской воды, и на их основе создать микробный консорциум для очистки балластного слоя железнодорожного полотна от нефтепродуктов;

- выявить пути микробной деструкции ароматических углеводородов – загрязнителей ряда химических производств бактериями рода Pseudomonas, выделенными из сточных вод АО «Карбид»;

- создать консорциум иммобилизованных бактерий - деструкторов нефти и нефтепродуктов на основе отбора носителей и условий прикрепления и изучить его углеводородокисляющую активность;

- изучить биоремедиационную способность микробного консорциума на основе выделенных углеводородокисляющих бактерий рода Pseudomonas для очистки модельных и реальных сточных вод от нефтепродуктов в условиях непрерывного культивирования;

- разработать биотехнологию очистки газовых промышленных выбросов, содержащих a -метилстирол, консорциумом углеводородокисляющих бактерий и выявить ее эффективность в условиях лабораторного эксперимента и производства.

Научная новизна

- впервые было показано, что наибольшую устойчивость к действию α-метилстирола, толуола и стирола проявили бактерии рода Pseudomonas. Уста-новлено отрицательное влияние углеводородного загрязнения на биоразно-образие микробоценоза активного ила очистных сооружений АО «Карбид» и определены устойчивые доминирующие группы углеводородокисляющих микроорганизмов;

- из природных и антропогенных экосистем впервые выделены и идентифицированы 8 новых штаммов бактерий Pseudomonas aeruginosa ДС-26, Pseudomonas putida D-12, Pseudomonas mendocina H3, Pseudomonas pseudoal-сaligenes H7 и Н16, Pseudomonas stutzeri H10, Pseudomonas alсaligenes H15, Pseudomonas mallei 36К, активно использующих нефть и нефтепродукты в качестве единственного источника углерода и энергии. На штамм Pseudomonas aeruginosa ДС-26 получено авторское свидетельство на изобретение № 1375647 «Штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa ДС-26, разлагающий α-метилстирол и толуол».

- показано, что при оптимальных физико-химических параметрах, а именно концентрации нефти и нефтепродуктов в среде от 2 до 10 г/л, рН - 7,0 -7,5 в аэрируемых условиях наблюдается активный рост отобранных бактери-альных штаммов рода Pseudomonas;

- впервые показано, что эффективным способом очистки загрязненного балластного слоя железнодорожного полотна является биоремедиация с по-мощью микробного консорциума на основе бактериальных штаммов Pseudo-monas mendocina H3, Pseudomonas stutzeri H10, Pseudomonas aeruginosa 8;

- впервые показана способность культур Pseudomonas aeruginosa ДС-26 и Pseudomonas putida D-12 к полной деструкции α-метилстирола, толуола и стирола. На основании анализа продуктов их разложения и выявления актив-ностей соответствующих ферментов, определены пути деградации иссле-дуемых нефтепродуктов. Установлено, что данные штаммы разлагают a-метил-стирол, толуол и стирол до нетоксичных продуктов.

- установлено, что иммобилизация на полипропиленовом волокне не снижает, а для некоторых бактерий рода Pseudomonas (Pseudomonas mallei 36К) даже повышает их углеводородокисляющую активность. Результаты иссле-дования высокой сорбционной активности полипропиленового волокна могут служить теоретической основой при разработке иммобилизованных биодест-рукторов для биоремедиации объектов окружающей среды, загрязненных нефтью и продуктами ее переработки.

- впервые осуществлена биотехнология микробной очистки газовых выбросов от a - метилстирола в биореакторе «биотенк-биофильтр» консор-циумом выделенных углеводородокисляющих микроорганизмов с приори-тетной ролью Pseudomonas aeruginosa 8. Использование данного способа позволяет очищать отработанные газовые выбросы, содержащие до 2 г/л АМС.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее устойчивыми к действию ароматических углеводородов являются аборигенные бактерии рода Pseudomonas.

2. Биоремедиация балластного слоя железнодорожного полотна эффек-тивна на основе консорциума активных штаммов бактерий рода Pseudomonas.

3. Для очистки сточных вод, загрязненных a - метилстиролом, толуолом и стиролом могут быть рекомендованы штаммы Pseudomonas aeruginosa ДС-26 и Pseudomonas putida D-12, способные осуществлять микробную деструкцию изучаемых ароматических углеводородов до нетоксичных продуктов.

4. Сорбция клеток бактерий рода Pseudomonas на полипропиленовом во-локне позволяет получить иммобилизованные биодеструкторы с высокой углеводородокисляющей активностью.

5. Очистка в биореакторе газовых выбросов от a - метилстирола с высокой эффективностью осуществляется консорциумом углеводородокисляющих микроорганизмов с приоритетной ролью бактерий рода Pseudomonas..

Практическая ценность работы.

Создана коллекция углеводородокисляющих микроорганизмов рода Pseudomonas с высокой деструктивной активностью. Для биоремедиации объектов окружающей среды, загрязненных техногенными углеводородами, рекомендуется включить в состав биопрепарата комплексного действия выделенные активные углеводородокисляющие микроорганизмы-деструкторы рода Pseudomonas.

Разработанный способ очистки щебеночного слоя железнодорожного пути от нефтепродуктов с помощью консорциума нефтеокисляющих микроорганиз-мов снижает в нем содержание нефтепродуктов, и улучшает его физико-механические параметры. Новизна предложенного способа подтверждена предварительным патентом № 14818 РК.

Штамм Pseudomonas aeruginosa ДС-26,способный осуществлять полную деградацию a-метилстирола и толуола рекомендован для биохимической очистки сточных вод ряда химических производств, где в качестве загряз-нителей встречаются вышеуказанные соединения, а также их гомологи.

Разработан способ очистки отработанных газовых выбросов от a- метилстирола в биореакторе на основе консорциума активных бактериальных штаммов Bacillus-Pseudomonas с приоритетной ролью Pseudomonas, иммо-билизованных на волокнистой загрузке.

Предлагаемая технология испытана на лабораторной и полупромыш-ленной установке в условиях реального производственного процесса с использованием пилотной установки и рекомендована для очистки воздушного бассейна от a-метилстирола с высокой эффективностью. На данный способ имеется авторское свидетельство на изобретение № 1597345 «Способ биоло-гической очистки газовой среды от a -метилстирола», а также имеется акт полупромышленного испытания предлагаемой биотехнологии на АО «Карбид». Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования данной биотехнологии для очистки загрязненного воздуха от целого ряда летучих ароматических соединений, образующихся в процессе работы предприятий нефтепереработки и нефтехимии.

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе при чтении дисциплин «Прикладная экология», «Экологическая биотехнология», «Технологии очистки природных и производственных сточ-ных вод» для подготовки бакалавров и магистров по специальности «Экология» в Казахском национальном педагогическом университете им. Абая.

Связь диссертации с планами НИР.

Диссертационная работа выполнялась в рамках НИР Министерства экологии и биоресурсов РК по теме: «Изучение возможности использования микробов-деструкторов для очистки почв от сырой нефти» (№ регистрации 569-3) за 1996 год, в рамках НИР кафедры микробиологии КазНУ им.аль-Фараби по программе РНТП «Научно-техническое обеспечение и организация производства биотехнологической продукции в Республике Казахстан на 2001-2005 годы» по теме «Создание Национальной коллекции микроорганизмов-продуцентов биотехнической продукции» (№ регистрации 4.4.1/334-5).

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на:

VII съезде Всесоюзного микробиологического общества, Алма-Ата, 1985; IV Всесоюзной конференции «Управляемое культивирование микроорга-низмов», Пущино, 1986; Всесоюзной конференции по программе ЮНЕСКО «Человек и биосфера», Алма-Ата, 1988; Международной школе ЮНЕП «Microbial degradation of xenobiotics», Пущино, 1988; III Всесоюзной конфе-ренции «Микробиологические методы защиты окружающей среды», Пущино, 1988; V Симпозиуме «Технический прогресс в канализации и очистке бытовых и промышленных сточных вод», Варна, 1988; 44-ой годичной научной конференции профессорско-преподавательского состава АГУ им.Абая, Алма-ты, 1993; конференции «Промышленная экология и охрана водных экосистем», Алматы, 1997; III Ассамблеи ассоциации университетов Прикаспийских государств, 1998; Международной научно-практической конференции «Проблемы гидрометеорологии и экологии», Алматы, 2001; Международном симпозиуме «Стратегия и методы экологического риска аридных и горных территорий», Алматы, 2001; Международной научно-практической конфе-ренции «Развитие географической и экологической науки в Казахстане», Алматы, 2002; II Международной научно-практической конференции «Акту-альные проблемы экологии», Караганда, 2003; Международной научно-практической конференции «Железнодорожный транспорт Казахстана: история и перспективы экономического роста», Алматы, 2004; Международной научно-практической конференции «Перспективы устойчивого развития экосистем Прикаспийского региона», Алматы, 2004; Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Саратов,2005; Международной конференции «Рациональное природополь-зование», Москва, 2005; IV Московском международном конгрессе «Биотех-нология: состояние и перспективы развития», Москва, 2007; Международной научно-практической конференции «Валихановские чтения -12», Павлодар, 2007; Республиканской научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии», Алматы, 2007; Международной научно-практической интернет конференции «Актуальные проблемы науки в период кризиса: современное состояние и перспективы развития», 2009; Международной научно-практической конференции «Биологическое разно-образие и устойчивое развитие природы и общества», Алматы, 2009;

Личный вклад диссертанта в разработку научных результатов, выносимых на защиту.

Личный вклад автора состоит в теоретическом и экспериментальном решении поставленных задач, в анализе и обобщении полученных результатов. Все основные разделы работы выполнены при личном участии автора.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 56 научных работ, в том числе 2 авторских свидетельства на изобретение СССР, 1 патент на изобретение РК, 9 учебных и учебно-методических пособий по экологии для ВУЗов.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы, описывающей материалы, объекты и методы исследований, главы, содержащей результаты собственных исследований, изложенных в пяти подглавах, заключения, выводов, списка цитируемой литературы из 660 источников иностранных и отечественных авторов. Диссертационная работа изложена на 237 страницах, проиллюст-рирована 66 рисунками и 36 таблицами.

Автор выражает искреннюю благодарность за ценные советы и рекомендации научным консультантам доктору биологических наук, профессору Жубановой Ажар Ахметовне и доктору биологических наук, профессору, заслуженному деятелю наук РФ Головлевой Людмиле Алексеевне.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ


1 Обоснование выбора направлений исследования. Дается анализ современных представлений об экологических проблемах влияния углеводородных загрязнений (нефти и нефтепродуктов) на окружающую природную среду. Приводятся сведения о распространении углеводород-окисляющей микрофлоры рода Pseudomonas в природных экосистемах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами и их роль в процессах деструкции углеводородов. Рассматриваются вопросы биоремедиации нефтезаг-рязненных экосистем и пути деструкции нефтяных углеводородов углеводород-окисляющими микроорганизмами рода Pseudomonas. Обсуждаются экологичес-

кие аспекты использования бактерий - деструкторов нефти и нефтепродуктов, иммобилизованных на различных носителях, а также возможность очистки сточных вод и промышленных выбросов от углеводородных загрязнений на основе гетеротрофных микроорганизмов рода Pseudomonas.

2 Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования

2.1.1 Углеводородокисляющие микроорганизмы, выделенные из природных и техногенных субстратов

Микробными объектами исследования явились 2 бактериальные культуры, выделенные из сточных вод и активного ила очистных сооружений каучукового производства АО «Карбид» г.Темиртау, штамм P. aeruginosa 8 - активный деструктор ароматических углеводородов, выделенный также из сточных вод АО «Карбид» и описанный ранее, 6 штаммов бактерий, выделен-ных из нефтезагрязненных почв Тенгизского месторождения и проб морской воды Каспийского моря.

Пробы сточной воды для выделения активных микроорганизмов деструк-торов ароматических углеводородов были отобраны с цехов отмывки каучука АО «Карбид» г.Темиртау. Пробы морской воды Каспия были отобраны в сентябре 2004 года у наливных причалов Актауского морского порта, подвер-гающихся хроническому углеводородному загрязнению при перекачке нефти в танкеры из нефтехранилищ по трубопроводам. В качестве контроля использо-вали пробы воды, взятые на участке морского бассейна, расположенного на расстоянии 7 км от морского порта.

Для выделения активных штаммов углеводородокисляющих микроорганиз-мов использовалась также нефтезагрязненная почва Атырауской области Тен-гизского месторождения, относящаяся к бурым пустынным почвам с содер-жанием органического вещества 1,3 %. Отбор проб проводили по общеприня-той методике [Звягинцев Д.Г., 1991]. Пробы почвенных образцов отбирали на пяти действующих скважинах (Т-16, Т-17, Т-116, Т-7040, Т-7252) Тенгизского месторождения. В качестве контроля исследовали почву поселка «Вахта», расположенного в 15 км от разрабатываемых участков.

В опытах по микробиологической очистке промышленных газовых выбро-сов использовали газовые выбросы цеха сушки латекса АО «Карбид», содержа-щие АМС, а также искусственную газовую смесь, содержащую исследуемые углеводороды.

2.2 Материалы исследования.

В качестве материалов исследований использовали нефть Тенгизского месторождения и нефтепродукты – мазут, дизельное топливо и ароматические углеводороды стирол, толуол, α – метилстирол (АМС), которые относятся к производным бензола и являются продуктами переработки нефти.

Для изучения углеводородокисляющей способности бактериальных кле-ток, иммобилизованных на инертных носителях, использовали следующие материалы: силикагель марки КСМ-7 со средним размером гранул 0,5 см, стеклянные шарики диаметром 1 мм, полимерную упаковочную сетку (ПУС), нити капроновых вий, пенопласт, пенополиуретан (ППУ) эластичный на основе полиэфира П-2200 с размером ячеек 0,92 мм, зауглероженные виноградные косточки (ЗВК), опилки, а также полиэтиленовые и полипропиленовые волокна (ПЭВ, ППВ).

3. Методы исследований
   

Антимикробные свойства АМС, стирола и толуола изучали методом серий-ных разведений вещества в жидких питательных средах, общепринятым в микробиологии для изучения антимикробных препаратов [Егоров Н.С., 1965].

Использованный нами спектр микроорганизмов для постановки экспери-ментов включал коллекционные штаммы грамположительных и грамотри-цательных бактерий, проактиномицеты, дрожжи, а также мицелиальные грибы из коллекции Института коллоидной химии и химии воды АН Украины, ИМиВ НАН РК.

Качественный и количественный состав микроорганизмов, выделенных из нефтезагрязненных почвенных и водных субстратов, изучали по общепринятым микробиологическим методам [Егоров Н.С.,1976: Звягинцев Д.Г., 1991].

Выделение активных культур микроорганизмов проводили с использо-ванием методов прямого высева проб почвенной и водной суспензии в чашки Петри с синтетической агаризованной средой Е-8 [Ерошин и др., 1965], накопи-тельной культуры с добавлением изучаемых углеводородов.

Для идентификации бактерий использовали определитель Берги 8-го издания [Buchanan, Gibbons, 1974] и оригинальные работы [Stanier, 1966, Коцо-фляк, 2004].

Проверка способности к росту активных культур на средах, содержащих ароматические углеводороды и их окисленные производные, проводилась ауксанографически на агаризованной синтетической среде Е-8.

Электронно-микроскопические исследования проводили на электронном микроскопе JEM-100B [Уикли Б.,1975].

Изучение роста культур и динамики окисления углеводородов проводили в колбах Эрленмейера объемом 500 мл со 100 мл жидкой среды Е-8. Процесс аэрации осуществляли на качалке (220 об /мин) при 29⁰С. Изучаемые углеводороды как единственный источник углерода вносили непосредственно в ростовую среду в концентрации 0,5,1,0,2,0-4,0 г/л.

В опытах по очистке балластного слоя железнодорожного полотна использовали консорциум выделенных активных углеводородокисляющих бактерий, взятых в равном соотношении, количеством клеток 10 ⁸ -10 ¹⁰ кл /мл. Определение общего содержания углеводородов в щебеночном слое железнодорожного полотна до и после воздействия на него микробного консорциума осуществляли на спектрофотометре «Specord» 75 IR, для анализа углеводородного состава использовали газовый хроматограф «Кристалл Люкс 4000» с пламенно-ионизационным детектором.

Изучение физико-механических параметров балластного слоя железно-дорожного полотна проводилось в лаборатории Казахской академии транспорта и коммуникации им. М. Тынышбаева.

Для определения продуктов окисления АМС, толуола и стирола бактериальные клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугиро-ванием, культуральную жидкость подкисляли 0,1М HCI до рН 2,0 и экстрагировали трижды диэтиловым эфиром, эфир упаривали на роторном испарителе при 20⁰С и остаток растворяли в этаноле.

Качественный анализ ароматических углеводородов и их метаболитов осуществляли методом тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем (Silufor ИУ-254) в системе растворителей: бензол: диоксан: уксусная кислота 90:10:2 (система1) и бензол : этилацетат 4:1 (система 2).

Обнаружение продуктов окисления осуществляли в УФ-лучах, а проявление - диазотированным бензидином для фенольных соединений, для кетосоединений – 2,4-динитрофенилгидразин и этанольный раствор бромкре-золзеленого – для кислот.

Идентификацию интермедиатов окисления АМС, толуола и определение ключевых ферментов окисления ароматического кольца проводили в ИБФМ РАН (Пущино) под руководством д.б.н Головлевой Л.А.

Идентификацию продуктов окисления АМС, толуола и стирола проводили методами УФ- и ИК-спектроскопии, ПМР и хромато-масс-спектрометрии. УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре ”Specord UV- VIS” в 96 % этиловом спирте в области 200-350 нм. ИК-спектры записывали на инфракрасном спектрофотометре UR-20 в растворе CCI₄ и таблетках KBr, ПМР-спектры анализировали на приборе WM-400 при частоте 400 мгц с тетраметилсиланом в качестве внутреннего стандарта в растворах СД₃ОД и СД₃СОСД₃. Хромато-масс-спектрометрический анализ осуществляли на при-боре LКВ-2091 (Швеция). Идентификацию продуктов проводили на основании сравнения времени удерживания и характера масс-спектров со стандартами.

Количественное определение АМС, стирола и толуола осуществляли спектрофотометрически на спектрофотометре “Specord UV-VIS” при длине волны от 240 нм до 300 нм [Савиных, Животкевич, 1971] по калибровочной кривой и газохроматографически на хроматографе GGD фирмы Pye Unicam с пламенно-ионизационным детектором.

Определение продуктов окисления (деструкции) нефти и нефтепродуктов осуществляли методом ИК-спектроскопии на приборе IR – 200, Thermo electron corporation, USA.

Для определения активности ферментов окисления ароматического кольца использовались бесклеточные экстракты культур в экспоненциальной фазе роста. Для получения бесклеточных экстрактов клетки выращивали на жидкой среде Е-8 в присутствии исследуемых углеводородов. Затем клетки осаждали центрифугированием, трижды отмывали фосфатным буфером и разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE. Неразрушенные клетки и крупные фрагменты осаждали центрифугированием при 15000 гц в течение 15 мин. Супернатант использовали для определения активностей ферментов. Спектрофотометрически определяли активности следующих ферментов: п-оксибензоатгидроксилазы по методике, описанной Howell et al,1972, пирокатехазы- Hayaishi et al, 1974, метапирокатехазы - Kojima et al,1967, протокатехоат – 3,4-диоксигеназы - Fujisawa, Hayashi,1968, гентизат – 1,2-диоксигеназы - Crawford et al, 1975, гомогентизат-оксигеназы – Adachi et al, 1966, толуол-диоксигеназы - Jenkins, Dalton, 1985.

Сорбционную иммобилизацию клеток для получения биодеструктора проводили по общепринятой методике [Zhubanova, Digel, 1992]. Расчет количества прикрепившихся клеток проводился на основании разницы начальных и конечных значений оптической плотности культуральной среды до и после иммобилизации клеток на фотоколориметре КФК-2МП в стандартных кюветах с длиной оптической пути 1 см при длине волны 540 нм. Сорбционную способность носителей и клеток рассчитывали по общепри-нятому методу Никовской Г.Н.(1986).

Изучение бактериальной деструкции AMC, стирола и толуола выделенными культурами в условиях непрерывного культивирования, проводи-ли на лабораторной модели установки по биохимической очистке промыш-ленных сточных вод аэротенк - аэрофильтр [Гвоздяк и др., 1972].

Постановка экспериментов по биотехнологии очистки отработанных газовых выбросов от АМС осуществлялась на установке «биотенк-биофильтр» с использованием иммобилизованного на волокнистой загрузке консорциума активных углеводородокисляющих бактерий.

Концентрацию α -метилстирола в загрязненном воздухе на входе в установ-ку и на выходе из нее определяли хроматографическим методом на газово- жидкостном хроматографе «Цвет – 102».

Пилотная установка для полупромышленных испытаний по очистке технически отработанного воздуха имела более крупные параметры. Эффек-тивность работы лабораторной и пилотной установок по очистке загрязненного воздуха оценивали в результате использования искусственно загрязненного воздуха и технически отработанного газа, поступавшего с сушилок каучука в течение 30 дней.

Математическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета прикладных программ Excel, на персональном компьютере «Pentium IV».