Geum.ru

Биоремедиация объектов окружающей среды yглеводородокисляющими микроорганизмами рода Pseudomonas 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 16 экология

Вид материалаАвтореферат
3.1 Восстановление окружающей природной среды от углеводород-ного загрязнения на основе использования микробных культур рода Pse
3.1.2 Изучение идентификационных признаков и свойств выделенных углеводородокисляющих бактерий
3.2 Деструкция нефти и нефтепродуктов бактериями рода Pseudomonas
P. putida
P. aeruginosa
P. aeruginosa
3.2.2 Углеводородокисляющая активность бактерий рода Pseudomonas, выделенных из нефтезагрязненных почв и морской воды
3.2.3 Очистка балластного слоя железнодорожного полотна консор-циумом активных штаммов псевдомонад
Подобный материал:
1   2   3   4

3 Результаты исследований и их обсуждение

3.1 Восстановление окружающей природной среды от углеводород-ного загрязнения на основе использования микробных культур рода Pseudomonas

Многими исследователями описана определяющая роль углеводород-окисляющих микроорганизмов в процессах очистки нефтезагрязненных экосистем. Анализ литературы позволяет отметить, что среди большого разнообразия микроорганизмов, способных окислять различные углеводороды, наиболее активными являются бактерии рода Pseudomonas. Представители этого рода настолько широко распространены в природе, что их можно назвать вездесущими. Это связано с их способностью, усваивать самые разнообразные по природе соединения и потому расти в различных экологических условиях.

АМС, толуол, стирол обладают выраженным токсическим действием. Это летучие соединения, обладающие специфическим неприятным запахом, встре-чаются в производственных сточных водах предприятий химической, нефтехи-мической промышленности

Рассматривая вопросы микробной деструкции загрязнителей природного и антропогенного происхождения, следует остановиться на их антимикробной активности, поскольку проявление устойчивости у микроорганизмов может приводить к приобретению ими способности разрушать эти вещества.


3.1.1 Сравнительное изучение токсического действия ароматических углеводородов на музейные культуры микроорганизмов различных таксономических групп и микробоценоз активного ила очистных сооружений

Известно, что многие загрязнители обладают неодинаковой антимик-робной активностью в отношении различных групп микроорганизмов.

Некоторые микроорганизмы проявляют устойчивость к этим веществам, однако не все они способны к их активному разрушению. Это обстоятельство необходимо учитывать при отборе микроорганизмов-деструкторов для биоремедиации всех компонентов окружающей среды. Кроме того, изучение устойчивости бактерий к токсическим загрязнителям окружающей среды, представляет определенный интерес при отборе активных штаммов-деструк-торов из загрязненных природных и неприродных субстратов- почв, воды, сточных вод различных производств и т.д. Поэтому исследования антимик-робных свойств ксенобиотиков и устойчивости к ним микроорганизмов необхо-димы при выборе правильной стратегии в ходе постановки опытных экспери-ментов по изучению деструктивной способности последних.

Проведенные нами исследования показали, что наиболее чувствительна к ароматическим углеводородам грамположительная микрофлора родов Sarcina, Micrococcus, Nocardia, дрожжи и мицелиальные грибы. Высокоустойчивыми к действию ароматических углеводородов оказались культуры Pseudomonas acidovorans 9, Pseudomonas aeruginosa 6 и 8, выделенные из сточных вод, содержащих изучаемые токсиканты.

Таким образом, многие микроорганизмы оказываются чувствительными к синтетическим загрязнителям окружающей среды. Однако отдельные микроор-ганизмы проявляют резистентность к этим веществам и, продолжая разви-ваться, приобретают способность использовать эти соединения как источник питания, разлагая их до простых продуктов.

Закономерности поведения сообществ микроорганизмов в сложных динамических системах, которыми являются почвы, водоемы, очистные сооружения, промышленные сточные воды, представляют определенный интерес. Сообщества микроорганизмов в подобных системах находятся в состоянии динамического равновесия с окружающей средой, и чтобы его нарушить, требуется постоянное и довольно грубое воздействие нового фактора окружающей среды. Одним из таких факторов и являются токсические органические соединения, поступающие в окружающую среду, в частности, с промышленными стоками химических производств. При этом особую важность имеет проблема влияния таких соединений на сложившиеся сообщества микроорганизмов в концентрациях, зачастую превышающих ПДК.

Исследование количественного соотношения показало, что в активном иле преобладали бактерии (39 штаммов), дрожжи и грибы составляли один и два штамма соответственно. В соответствии с морфологическими и физиолого-биохимическими свойствами 39 штаммов бактерий были отнесены к родам Pseudomonas, Zoogloea, Alcaligenes, Xantomonas, Proteus, Escherichia, Sphaeroltilus Azotobacter, из грамположительных – Bacillus, Micrococcus, Staphylococcus, Lactobacillus, Corynebacterium. Доминирующее положение среди бактерий занимали роды Pseudomonas, Alcaligenes, Zoogloea, Bacillus, Micrococcus. Два штамма грибов были отнесены к роду Geotrichum, а один штамм дрожжей – к роду Cryptococcus.

Известно, что микроорганизмы активного ила обладают специфической чувствительностью к токсичным компонентам промышленных стоков. Действие ядов на живые организмы снижается коллоидами зооглейных скоплений. Однако при залповых сбросах, когда концентрация токсичных компонентов стока намного превышает ПДК, влияние токсикантов на видовое разнообразие микроорганизмов проявляется особенно отчетливо.

Данные по влиянию АМС на качественный состав микроорганизмов активного ила показали, что для АМС в концентрации 2 г/л наиболее слабым звеном в структуре биоценоза являются грамотрицательные – Xantomonas, Escherichia, Proteus, Azotobacter, Sphaerotilus, а из грамположительных – Staphylococcus, Listeria, Lactobacillus, Corynebacterium. Выживают Pseudomo-nas, Alcaligenes, Bacillus, Zoogloea , Micrococcus, грибы и дрожжи – Geotrichum и Cryptococcus.

Изучение микрофлоры активного ила после воздействия вышеуказанного соединения, превышающего ПДК, показало, что после 6 – 12 часов контакта с АМС снижается частота встречаемости многих видов микроорганизмов: из 16 родов бактерий, грибов и дрожжей остаются лишь представители 5 родов бактерий, одного рода грибов и одного рода дрожжей.

Наиболее чувствительные к токсическому соединению микроорганизмы выпадают из микробиоценоза, т.е. происходит сужение качественного состава микроорганизмов активного ила. Доминирующее положение среди бактерий занимали бактерии родов Pseudomonas (44%), Bacillus (10%), Alcaligenes, Zoogloea, Micrococcus (по 8% соответственно). Таким образом, главным следствием взаимодействия биоценоза активного ила с концентрированными промышленными стоками, содержащими токсический загрязнитель АМС, является перестройка микробного сообщества, т.е. изменение родовой структуры микрофлоры активного ила.

Полученные данные еще раз подтверждают тезис о том, что наиболее устойчивыми к действию неблагоприятных антропогенных факторов являются углеводородокисляющие бактерии, к которым принадлежат псевдомонады.


3.1.2 Изучение идентификационных признаков и свойств выделенных углеводородокисляющих бактерий

Участие микроорганизмов в деградации и трансформации различных ксенобиотиков общепризнано. Углеводороды, в зависимости от степени слож-ности их молекул, разлагаются микроорганизмами различным образом. Ассимиляция ароматических углеводородов характерна лишь для отдельных штаммов некоторых видов микроорганизмов и является штаммовым свойством, возникающим в результате длительной адаптации.

Поэтому главной задачей при разработке биотехнологий для очистки окружающей среды от органических поллютантов является выделение и отбор высокоактивных культур микроорганизмов – деструкторов токсичных органи-ческих соединений.

В настоящее время поиск таких микроорганизмов-деструкторов может вестись вполне целенаправленно, если использовать адаптированную к опреде-ленным субстратам микрофлору. Условия для подобной адаптации склады-ваются, например, в нефтезагрязненных водах и почвах, активных илах очист-ных сооружений и сточных водах различных химических производств.

Создание таких селективных возможностей позволило нам выделить из сточных вод АО «Карбид», нефтезагрязненной почвы Тенгизского месторож-дения и воды Каспийского бассейна 8 штаммов бактерий, идентифицирован-ных на основании изучения морфолого-культуральных и физиолого-биохими-ческих признаков как P. aeruginosa ДС-26, P. putida D12, Р. mendocina H3, P. pseudoalсaligenes H7 и Н16, P. stutzeri H10, P. alсaligenes H15, P. mallei 36К.. Все штаммы обладали способностью к росту на нефти и нефтепродуктах в качестве единственного источника углерода и энергии.


3.2 Деструкция нефти и нефтепродуктов бактериями рода Pseudomonas

Огромную роль в решении проблемы охраны окружающей среды играют микроорганизмы - деструкторы различных соединений естественного и антро-погенного характера и созданные на их основе биотехнологии. В результате способности микроорганизмов воздействовать на разнообразные субстраты, расти в разных условиях, осуществлять трансформацию или деструкцию неприродных соединений, они играют важную роль в превращении многих токсичных веществ в нетоксичные, предотвращая тем самым дальнейшее загрязнение природных экосистем.


3.2.1 Влияние физико-химических факторов на рост активных углево-дородокисляющих бактерий рода Pseudomonas на различных ароматичес-ких углеводородах, нефти и нефтепродуктах

Наряду с изучением физиологии и биохимии микроорганизмов -деструкторов углеводородов, большое значение для формирования научных подходов к решению проблемы очистки загрязненных территорий, имеет определение оптимальных параметров, необходимых для проявления деструк-тивной активности выделенных микроорганизмов. Правильный подбор различ-ных факторов, таких как концентрация вносимого источника углерода, аэрация, кислотность среды имеет существенное значение для повышения активности процессов бактериальной деструкции нефти и продуктов ее переработки, причем для роста и метаболической активности различных групп микроор-ганизмов границы значений этих факторов часто неодинаковы.

В опытах по динамике окисления нефтепродуктов – ароматических углеводородов – АМС, стирола и толуола, использовали бактериальные штам-мы P.aeruginosa ДС-26 и P. putida D12. Эти активные штаммы были отобраны для дальнейшего исследования путей окисления АМС, толуола и стирола, поэтому, в первую очередь, была изучена корреляционная зависимость прироста микробной биомассы изучаемых культур и убыль углеводородных субстратов.

Динамику роста на стироле в концентрации 0,5, 1,0 и 2,0 г/л. изучали с ис-пользованием культуры P. putida D12, показавшей наиболее интенсивный рост на этом источнике углерода. Изучение динамики роста на АМС и толуоле проводилось на примере штамма P.aeruginosa ДС-26. Поскольку штамм P.aeruginosa ДС-26 показал обильный рост на агаризованной синтетической среде с добавлением АМС и толуола в качестве источников углерода были поставлены опыты по изучению роста и убыли субстратов в динамике.

Из рисунка 1 следует, что при концентрации АМС 2 г/л культура достигает стационарной фазы роста к 24 часам, при концентрации АМС 4 г/л - к 48 часам, при этом токсикант в культивируемой среде не обнаруживался.

Штамм характеризовался активным ростом на АМС при его концентрации 6 г/л, хотя при 6 г/л наблюдается торможение роста, удлиняется лаг-фаза, но активной остается экспоненциальная фаза роста. Лабораторные исследования показали, что оптимальной ростовой концентрацией АМС для изучаемого штамма была 2-4 г/л, при которых изучалась динамика роста и накопления промежуточных продуктов окисления субстрата.




Рисунок 1 - Динамика роста (А) и окисления (В) АМС бактериальным штаммом P. aeruginosa ДС-26


Для проверки способности штамма использовать толуол в качестве рос-тового субстрата инкубацию проводили с добавлением токсиканта в концент-рации 2 и 4 г/л. В ходе постановки экспериментов было отмечено, что штамм использовал толуол при всех исследуемых концентрациях, причем кривая роста характеризовалась фактическим отсутствием лаг-фазы (рисунок 2).

А Б




Рисунок 2 - Динамика роста (А) и окисления (Б) толуола бактериальным штаммом P. aeruginosa ДС-26


В результате проведенных исследований нами установлено, что все бактерии хорошо растут при перемешивании в жидкой синтетической среде с концентрацией нефтепродуктов и нефти от 2 до 10 г/л. Показано, что в жидкой синтетической среде, содержащей нефть в концентрации 2 г/л, наиболее активно развиваются культуры P. mendocina Н3, P. aeruginosa 8, P. stutzeri Н10, P. mallei 36К, рост которых заканчивался к 48 часам культивирования. На жидких средах с дизельным топливом, толуолом и мазутом культуры показали рост, аналогичный таковому на среде с нефтью. На примере штамма P. mendo-cina Н3, изучался рост при различных концентрациях нефти. Выявлено, что штамм хорошо растет от 2 до 10 г/л нефти, причем увеличение концентрации углеводорода способствует увеличению длительности всех фаз роста, что свидетельствует о том, что микробным клеткам требуется адаптация к возраста-ющим концентрациям нефти (рисунок 3).




Рисунок 3 - Динамика роста культуры P. mendocina Н3 на среде при различных концентрациях нефти

Изучение влияния начальных значений рН среды на рост микроорганизмов показало, что оптимальным значением рН является интервал 7,0 - 7,5.

3.2.2 Углеводородокисляющая активность бактерий рода Pseudomonas, выделенных из нефтезагрязненных почв и морской воды

Предшествующим и обязательным этапом в изучении процессов биодеградации нефти и нефтепродуктов является определение углеводород-окисляющей активности микроорганизмов.

Для решения этой задачи нами было проведено определение углево-дородокисляющей активности клеток P. mendocina Н3, P. aeruginosa 8, P. stutzeri Н10, P. mallei 36К с помощью ИК-спектроскогпии. В качестве един-ственного источника углерода в среду добавляли нефть, толуол или дизельное топливо в концентрации 2 г/л.

Установлено, что в полученных ИК-спектрах при росте культур P. mendo-cina Н3, P. aeruginosa 8, P. stutzeri Н10 на среде с нефтью, регистрируется значительное понижение интенсивности СН2-групп и рост интенсивности полосы поглощения вблизи 1745 см-1, что можно отнести к появлению валентных колебаний (связи С=О) в веществах, образующихся в результате деструктивной активности микроорганизмов.

При росте культуры P. mendocina Н3 было также зафиксировано относительное увеличение интенсивности пиков в области 3600 – 3800 см-1, что свидетельствовало о появлении частот валентных колебаний - ОН несвязанной гидроксильной группы, и, следовательно, об образовании продуктов полного окисления углеводорода (рисунок 4).

ИК-спектры культуральной среды,содержащей дизельное топливо и толуол после роста на ней исследуемых бактерий показали использование углеводородов всеми культурами, но в разной степени. Наибольшей активностью обладали культуры P. mendocina Н3 и P. aeruginosa 8, степень деструкции которых составляла 87,5 % и 72,5 % в отношении нефти, 90 % и 86 % дизельного топлива, 86 % и 85 % толуола, соответственно.Эти культуры можно рекомендовать для включения в состав биопрепаратов для биоремеди-ации почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Таким образом, полученные нами данные по углеводородокисляющей активности изученных штаммов, позволяют их рекомендовать для практичес-кого использования в качестве биодеструкторов для очистки загрязненых экосистем от нефти и нефтепродуктов. Сложность биодеструкции микро-организмами углеводородов нефти заключается в их многокомпонентности и разнородности, поэтому создание консорциумов, состоящих из микроор-ганизмов с разными способностями к деградации различных компонентов нефти, безусловно, является перспективным направлением при биоремедиации загрязненных экосистем. Этот фактор учитывается многими исследователями при создании биопрепаратов, которые в последнее время находят широкое практическое использование для очистки нефтезагрязненных почв и вод.





4000 3000 2500 2000 1500

Ось абсцисс – υ см-¹, ось ординат – пропускание, а – контроль (без культуры), б – P. mendocina Н3, в – P. aeruginosa 8, г – P. stutzeri Н10, д – P. mallei 36К

Рисунок 4 - ИК-спектры культуральной среды, содержащей нефть в концентрации 2 г/л, до и после роста на ней микроорганизмов в течение 2х суток

3.2.3 Очистка балластного слоя железнодорожного полотна консор-циумом активных штаммов псевдомонад

Известно, что в условиях повышения объемов грузоперевозок наблюдается увеличение загрязненности железнодорожного пути, в частности, балластного слоя нефтью и нефтепродуктами, что приводит к росту аварийности и нарушению ритмичности движения составов. Кроме этого происходит загрязнение почвенного покрова на всем протяжении железнодорожного пути, что составляет десятки тысяч квадратных километров земной поверхности.

Перспективным направлением очистки балластного слоя от нефтяных загрязнений, на наш взгляд, являются биологические методы, основанные на использовании микроорганизмов – деструкторов нефти и нефтепродуктов. В этой связи, нами проведено экспериментальное изучение возможности биоло-гической очистки балластного слоя железнодорожных путей в условиях лабораторного эксперимента и производственных испытаний на основе исполь-зования консорциума культур P. mendocina H3, P. aeruginosa 8, P. stutzeri H10, взятых в равных соотношених и обладающих высокой деструктивной актив-ностью в отношении нефти и нефтепродуктов.

Результаты проведенного эксперимента оценивались методами ГЖХ и ИК-спектроскопии проб культуральной среды, содержащей балластный щебень до и после культивирования микроорганизмов в течение 7, 14, 30 суток. Показано, что уже через 7 суток контакта балластного щебня с микробным консорциумом содержание углеводородов в среде уменьшилось на 32 %, через 14 суток на 47 %, а через 30 суток, т.е. к концу эксперимента – на 64 %.

Проведение производственных испытаний для очистки железнодорожного полотна от нефтепродуктов на участке Алматы - Чимкент внесением в балластный щебень консорциума углеводородокисляющих микроорганизмов, позволило выявить, что через 7 суток после обработки наблюдается снижение концентрации практически всех углеводородов, кроме н-ундекана (таблица 1).


Таблица 1 – Содержание углеводородов в балластном слое после действия

консорциума углеводородокисляющих бактерий рода Pseudomonas


Углеводород


№

пика
Концентрация, мг/кг

До очистки
После очистки

1
2
3
4

Линейные углеводороды









н-гексан
17
100±9,8
62±4,4

н-гептан

24
150±7,9
88±7,6

н-октан

29
215±12,6
105±8,5

н-нонан

34
185±10,7
46±3,8

н-декан

38
38±2,6
85±6,7

н-ундекан

45
79±6,4
79±5,9

тетрадекан

51
51±4,8
12±0,9

н-додекан
49
74±6,3
29±1,2

Продолжение таблицы 1

1
2
3
4

Разветвленные углеводороды









2,2-диметилпентан
18
75±6,4
39±1,8

2,3,3-триметилпентан
26
186±10,9
124±8,6

3-метилпентан
28
115±8,7
78±4,8

Ароматические углеводороды









м-ксилол
31
208±9,6
148±9,7

о-ксилол
33
102±6,9
82±6,9

1,2,4-триметилбензол
37
193±12,8
115±9,8

Циклические углеводороды









2-метилнафталин
50
64±5,7
18±1,2


Изучение исходных физико-механических свойств щебеночного балласт-ного слоя и спустя 7 суток после очистки показало положительное влияние деятельности углеводородокисляющих микроорганизмов на эти параметры. Наблюдается уменьшение влажности щебня, увеличение коэффициента фильтрации балластного слоя и водопроницаемости, уменьшение плотности балластного слоя.

Таким образом, интродукция микроорганизмов-нефтедeструкторов в техногенные объекты привела к значительному снижению концентрации загрязнителя за короткий промежуток времени.