Биоремедиация объектов окружающей среды yглеводородокисляющими микроорганизмами рода Pseudomonas 03. 00. 07 микробиология 03. 00. 16 экология
| Вид материала | Автореферат |
- Задачи дисциплины: ознакомить студентов с существующими методами химического и физико-химического, 20.52kb.
- Программа дисциплины Практикум по аналитической химии объектов окружающей среды Новосибирск, 158.39kb.
- Контрольная работа по дисциплине Микробиология По теме Общая и специальная микробиология, 208.97kb.
- Программа дисциплины дпп. Р. 01 Экология и охрана окружающей среды цели и задачи курса, 147.68kb.
- Окружающей среды республики, 1450.06kb.
- Л. Г. Наумова Б. М. Миркин Основы общей экологии Б. М. Миркин, Л. Г. Наумова Основы, 2543.68kb.
- Изучение влияния фитонцидов цветочно-декоративных культур закрытого грунта на микробиологическую, 63.59kb.
- Бактерии рода enterococcus в озере байкал: Распределение, видовой состав, механизм, 275.08kb.
- Взаимосвязь пластического и энергетического обмена веществ, 1100.63kb.
- Рабочая программа дисциплины «химический анализ объектов окружающей среды» Направление, 311.39kb.
3.2.4 Пути деструкции α - метилстирола, толуола и стирола бакте-риальными штаммами Pseudomonas aeruginosa ДС-26 и Pseudomonas putida D-12, выделенных из сточных вод АО «Карбид»
В последние годы большое внимание уделяется изучению путей микроб-ного метаболизма ароматических соединений, наиболее широко встречаю-щихся в промышленных сбросах и выбросах..
Анализ динамики накопления продуктов деградации АМС, толуола и стирола, идентификация их структуры и обнаружение активностей ключевых ферментов окисления позволили провести изучение последовательности пути окисления исследуемых ароматических углеводородов активными штаммами-деструкторами.
В результате проведенных исследований по установлению пути деструкции АМС штаммом Pseudomonas aeruginosa ДС-26 , в культуральной среде физико-химическими методами было обнаружено и охарактеризовано 11 метаболитов.
Было показано, что метаболические реакции носили окислительный характер и имели разветвленную катаболическую последовательность по основному и второстепенному пути (рисунок 5).
Основной путь окисления АМС культурой P.aeruginosa ДС-26 сопровождается образованием продуктов прямого гидроксилирования ароматического кольца (цис) - 2,3-дигидрокси – 1 - изопропенил - 6-циклогексена, (окси) - изопропенилбензола и 3 - изопропилкатехола, который далее метаболизируется по мета - пути с образованием кето-кислот.
1 – АМС; 2 – 1,1– фенилметилгликоль; 3 – α -фенилпропионовая кислота; 4 - метилбензиловый спирт; 5 - ацетофенон; 6 - α -фенилакриловая кислота; 7 – гипотетический продукт; 8 - (цис)-2,3-дигидро-окси-1-изопропенил-6-цикло-гексен; 9 – (окси)- изопропенилбензол; 10 – 3-изопропилкатехол; 11-12 – алифатические кетокислоты
Рисунок 5 - Пути метаболизма АМС культурой P.aeruginosa ДС-26
Второстепенным по значимости является метаболический путь через α - фенилпропионовую кислоту и 4 - метилбензиловый спирт с образованием ацетофенона, который в среде не накапливался и, вероятно, метаболизировался далее. Следует отметить, что в литературе не описано окислительного пути микробного метаболизма фенилпропионовых кислот и α – фенилпропионовая
кислота при деструкции алкенилзамещенных бензолов не была обнаружена в качестве промежуточного метаболита.
Для подтверждения данных, полученных на основании анализа интермедиатов окисления АМС бактериальными штаммами P.aeruginosa ДС-26 и 8, были изучены основные ферменты окисления ароматического кольца.
В бесклеточных экстрактах клеток, взятых в экспоненциальной фазе роста культуры P.aeruginosa ДС-26, выращенной на различных субстратах были обнаружены активности ферментов расщепления ароматического кольца при их выращивании на различных субстратах. Данные энзиматического анализа дают объяснение тому, по какому пути идет окисление АМС.
Таким образом, результаты исследования ферментного аппарата у изучаемой культуры могут служить подтверждением предложенной схемы основного пути метаболизма АМС штаммом P.aeruginosa ДС-26.
Анализ культуральной жидкости на наличие продуктов окисления толуола показал, что в экспоненциальной фазе роста обнаруживались в следовых количествах бензальдегид и бензойная кислота. В стационарной фазе роста культуры эти соединения не идентифицированы. По-видимому, культура метаболизировала толуол путем прямого гидроксилирования ароматического кольца, так и путем окисления метильного фрагмента с последующим образованием бензойной кислоты в качестве промежуточного продукта (рисунок 6).
1
4
5
6
мета-расщепление
ароматического кольца
1- толуол; 2 – бензиловый спирт; 3 – бензальдегид; 4 – бензойная кислота; 5 – гитотетический пирокатехин; 6 – 3 метилкатехол;
Рисунок 6 - Пути окисления толуола культурой P.aeruginosa ДС-26
Анализ активностей ферментов окисления ароматического кольца при росте культуры P.aeruginosa ДС-26 на толуоле показал наличие следующих ферментов: метапирокатехазы, пирокатехазы - ключевых ферментов расщепления ароматического кольца катехола, толуолдиоксигеназы - фермента прямого гидроксилирования толуола и фермента последовательного окисления метильной группы толуола - бензилалкогольдегидрогеназы.
Полученные данные по ферментному анализу культуры P.aeruginosa ДС-26 подтверждают предположения о том, что особенностью окисления толуола является функционирование 2-х альтернативных путей окисления: первый путь - прямое гидроксилирование ароматического кольца с образованием 3-метилкатехола, второй путь – последовательное окисление метильного фрагмента с образованием бензойной кислоты в качестве интермедиата.
Метаболическое окисление стирола изучалось с использованием штамма P.putida D12, который характеризовался устойчивым ростом со значительным приростом биомассы в культуральной среде при концентрации субстрата 1 и 2 г/л. Разрушение стирола растущими клетками P.putida D12 происходило без накопления каких-либо промежуточных продуктов. УФ-спектр культуральной жидкости в экспоненциальной фазе роста характеризовался специфическими пиками поглощения при 295 нм и 280 нм. При проявлении пластин ТСХ в системе растворителей бензол:диоксан:уксусная кислота были обнаружены пятна с Rf= 0,5 и Rf=0,7. При дальнейшем культивировании через 48 часов анализ культуральной жидкости методом УФ-спектроскопии показал наличие пика при 375 нм, что указывало на возможное присутствие муконового полуальдегида. Отмечалось желтое окрашивание, свидетельствующее о накоп-лении полуальдегида оксимуконата - продукта мета-расщепления ароматичес-кого кольца катехола.
Полученные экспериментальные данные предполагают следующую последовательность окисления стирола:
Стирол → продукт 1→ продукт 2 → катехол → мета-расщепление катехола → муконовый полуальдегид. Конечным продуктом окисления оксимуконового полуальдегида является пировиноградная кислота и ацетальдегид, который окисляется в уксусную кислоту, вступающую в основной обмен с образованием углекислого газа и воды.
Наличие фермента мета-расщепления ароматического кольца метапирока-техазы у бактериального штамма P.putida D12, наиболее активно растущего на стироле, подтверждает существование метаболического пути окисления стиро-ла по мета-пути расщепления катехола.
Таким образом, анализ накопления продуктов деградации изучаемых аро-матических углеводородов в динамике, идентификация их структуры и обнару-жение активностей ключевых ферментов окисления позволили выявить после-довательность пути окисления АМС, толуола и стирола активными штаммами-деструкторами.
Исходя из вышеприведенных результатов исследований, установление путей микробного метаболизма АМС, толуола и стирола штаммами P.aeruginosa ДС-26 и P.putida D12 представляется вполне обоснованным и может дополнить новыми сведениями общую картину путей разрушения ароматических соединений в природе.
3.3 Очистка различных объектов окружающей среды с использованием микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов, иммобилизован-ных на инертных носителях
При очистке нефтезагрязненных земель и водных систем микроорганизмы сталкиваются с проблемами вытеснения и вымывания клеток. Для их решения используются методы, основанные на закреплении клеток на поверхности нерастворимых носителей, что позволяет предотвратить вымывание интроду-цированных микробных штаммов и вытеснение их местной микрофлорой и в результате получить высокоэффективные биодеструкторы на основе иммобили-зованных клеток микроорганизмов, окисляющих нефть.
3.3.1 Подбор оптимальных условий для иммобилизации углеводо-родокисляющих бактерий рода Pseudomonas на различных носителях
Среди адсорбентов для клеток P. mendocina Н3, P. aeruginosa 8, P. stutzeri Н10, P. mallei 36К нами в качестве эффективного носителя для иммобилизации углеводородокисляющих микроорганизмов выбрано полипропиленовое волок-но, характеризующееся высокой сорбционной емкостью и малой десорбцией клеток микроорганизмов (2-5%). Так, 1 г этого носителя сорбировал 44 % клеток культуры P. mendocina Н3; 50 % - P. aeruginosa 8; 27% - P. stutzeri Н10; 45 % - P. mallei 36К (рисунок 7).
а) P. mendocina Н3 б) P. aeruginosa 8
в) P. stutzeri Н10 г) P. mallei 36К
Рисунок 7 – Процентное соотношение сорбции к десорбции клеток
бактерий рода Pseudomonas на разных носителях
3.3.2 Изучение окисления нефти и нефтепродуктов иммобилизо-ванными на ППВ активными штаммами рода Рseudomonas
Изучение углеводородокисляющей активности иммобилизованных биодеструкторов с помощью ИК-спектроскопии показало, что при исполь-зовании нефти иммобилизованными клетками P. mallei 36К происходит уменьшение интенсивности полос поглощения в области 2500-3100 см -1, а также увеличение полос поглощения в области 3600-3800 см-1, что свиде-тельствует о том, что иммобилизация повысила окислительную активность изучаемого штамма в отношении нефти.
Аналогичным образом происходило потребление дизельного топлива клетками P. mendocina Н3, P. aeruginosa 8, P. stutzeri Н10, P. mallei 36К. Сорбция клеток микроорганизмов на полипропиленовом волокне способство-вала полной деструкции толуола вышеуказанными культурами, причем иммобилизация оказала заметное положительное действие на углеводород-окисляющую активность культуры P. stutzeri Н10 в отношении толуола (от 20 до 75%). Таким образом, прикрепление клеток на полипропиленовое волокно повышало деструктивную активность изученных штаммов.
На основании полученных результатов было установлено, что бактерии рода Pseudomonas являются активными деструкторами нефти и нефтепро-дуктов. Высокая активность, способность расщеплять различные классы углеводородов позволяет рекомендовать выделенные нами активные штаммы для ликвидации нефтяных загрязнений воды и почвы, как в свободном, так и иммобилизованном виде.
Данные по изучению физиологических и биохимических свойств выделенных культур, условий, способствующих проявлению их деструктивных способностей, углеводородокисляющей активности свободных и иммобилизо-ванных клеток этих микроорганизмов позволили рекомендовать штаммы P. mendocina Н3, P. aeruginosa 8, P. stutzeri Н10, P. mallei 36К для создания консорциума с целью получения биодеструкторов нефти и нефтепродуктов для биоремедиации загрязненных объектов окружающей среды. Производственной основой этого предложения являются результаты испытания консорциума на основе выделенных нами микроорганизмов при очистке балластного слоя железнодорожного пути. Новизна полученных результатов подтверждена положительным решением на изобретение (предварительный патент РК на изобретение № 14818).
3.4 Очистка загрязненных сточных вод препаратами иммобили-зованных углеводородокисляющих бактерий рода Pseudomonas в модель-ных системах
Предприятия нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышлен-ности оказывают негативное влияние на окружающую среду в результате выбросов огромного количества углеводородов, в том числе и ароматических. В результате техногенной деятельности человека, сопровождающейся исполь-зованием нефти, в окружающую среду ежегодно поступают миллионы тонн бензола, толуола, этилбензола, ксилолов. Эти соединения применяются также в качестве растворителей, реактивов, мономеров в органическом синтезе, поступая в окружающую среду со сточными водами, газовыми выбросами, загрязняя почву, воду и атмосферу.
Опыты по деструкции АМС штаммами P. aeruginosa ДС-26 и 8 в образцах модельной сточной воды показали, что использование консорциума штаммов P. aeruginosa ДС-26 и 8 приводило к интенсификации процесса очистки. Из данных, полученных на лабораторной модели установки по очистке синте-тического стока от АМС следует, что использование ассоциации выделенных микроорганизмов в данной модели обеспечивает полную очистку воды, содер-жащей до 4 г/л АМС.
Для очистки реальных сточных вод АО «Карбид» штаммами P.aeruginosa ДС-26 и 8 использовалась эта же установка.
Очищенная реальная сточная вода была прозрачной при исходной мут-ности и без запаха, что свидетельствовало о высокой эффективности очистки. Эффект очистки от АМС составил 99,8%.
Исследования по дальнейшей очистке модельных стоков, содержащих в качестве основных загрязнителей толуол и стирол ,проводили на лабораторной модели этой же установки по очистке промышленных сточных вод с исполь-зованием двух активных штаммов - P. aeruginosa ДС-26 и P. putida D-12. Перед подачей стока клетки микроорганизмов деструкторов толуола и стирола адсорбировали на стеклоткань и помещали в аэрофильтр. Для получения стабильных результатов опыт продолжался в течение 2-х месяцев для каждого токсиканта.
Данные, полученные на лабораторной модели установки по очистке синтетического стока от толуола и стирола свидетельствуют о том, что исполь-зование индивидуальных культур выделенных микроорганизмов в данной модели обеспечивает полную очистку воды, содержащей до 2 г/л толуола и стирола (таблица 2).
Полностью толуол разрушался культурой P. aeruginosa ДС-26 в условиях непрерывного культивирования за 24 часа при максимальной концентрации вещества 2 г/л, а штамм P. putida D-12 окислял стирол за 48 часов при этой же концентрации. При этом количество бактерий деструкторов толуола и стирола на установке при высеве на МПА составляло 85 и 70% соответственно от всех микроорганизмов жидкости аэротенка.
Таким образом, модельные опыты на лабораторной установке показали возможность ее использования для очистки синтетического стока от толуола и стирола в условиях непрерывного культивирования. Проведенные исследова-ния в лабораторных условиях на примере очистки модельных стоков, содер-жащих высокотоксичные загрязнители, позволили показать преимущества микробиологических методов очистки сточных вод с целью их дальнейшего внедрения в производственных условиях.
3.5 Биотехнология очистки газовых производственных выбросов от летучих ароматических соединений консорциумом углеводородокис-ляющих бактерий в условиях лабораторного и производственного экспери-ментов
АМС, являясь высокотоксичным компонентом сточных вод производства синтетического каучука, загрязняет не только водоемы, но и воздушный бассейн, попадая в атмосферу в процессе ряда производственных технологи-ческих процессов. Концентрация АМС при этом значительно превосходит предельно допустимую концентрацию, которая установлена для воздушной среды рабочей зоны на уровне 5,0 мг/м 3 .
В исследованиях для очистки газовоздушных выбросов от АМС был использован консорциум активных штаммов-деструкторов, P. aeruginosa 8 и Bacillus cereus 3, который дал хорошие результаты при ассимиляции 2 г/л АМС в качестве единственного источника углерода и энергии.
В предыдущих исследованиях была показана способность, чистых культур Pseudomonas aeruginosa 8 и Bacillus cereus 3 окислять АМС до нетоксичных продуктов. Данные штаммы были рекомендованы для очистки производ-ственных сточных вод, но не производственных газовых выбросов. Выбор штаммов родов Pseudomonas и Bacillus для постановки экспериментов по очистке производственных газовых выбросов был неслучаен, поскольку предыдущие исследования по изучению устойчивости микробной популяции активного ила очистных сооружений АО «Карбид» при воздействии на них АМС показали их доминирование в структуре биоценоза активного ила.
В исследованиях для очистки газовых выбросов от АМС был использован консорциум вышеуказанных активных штаммов-деструкторов, так как интродукция монокультуры полностью не решала проблему очистки. Исполь-зование же нескольких штаммов сопровождалось более полной деструкцией углеводородов, и давало лучшие результаты.
В ходе проведенных экспериментов было показано, что консорциум штаммов Pseudomonas aeruginosa 8 и Bacillus cereus 3 наиболее активно потребляет 0,5 и 2 г/л углеводорода при их соотношении 3:1. Заданные концентрации АМС соответствовали истинному содержанию токсиканта в производственных газовых выбросах при нормальном режиме технологи-ческого процесса и при его нарушении. Использование консорциума клеток P. aeruginosa 8 - Bacillus cereus 3 в соотношениях 1:1 и 2:1 для окисления 2 г/л АМС дало сниженные результаты, равно как и использование чистых культур исследуемых штаммов.
Одним из ключевых моментов при создании биотехнологии по очистке отработанных газовых выбросов является подбор эффективной комбинации микроорганизмов и носителя для их иммобилизации. В ходе постановки экспериментов был опробован ряд носителей и сделан выбор в пользу волокнистых носителей (ерши из стеклоткани), обладающих развитой кон-тактной поверхностью и обеспечивающих прочное закрепление клеток путем простой физической адсорбции. Кроме того, волокнистый материал из стеклоткани может оказаться наиболее предпочтительным адсорбентом в жестких условиях технологического режима, позволяющий равномерно распределяться по объему биофильтра сильным потокам жидкости и воздуха.
В наших исследованиях, эксперименты по очистке загрязненного АМС воздуха, отрабатывали на вертикальной закрытой колоночной установке биотенк-биофильтр с закрепленными ершами из стеклоткани в биофильтре, орошаемом питательным раствором с необходимым количеством минеральных добавок. Для проведения лабораторных экспериментов была использована модель установки биотенк-биофильтр с сорбированной на ершах из стекло-ткани ассоциацией бактериальных штаммов P.aeruginosa 8 и Bacillus cereus 3 , взятыми в отношении 3:1.
По данным эксперимента (таблица 2) эффективность очистки достигала 98-99%, что позволило перейти от лабораторных испытаний к полупромышлен-ным, т.е. к условиям максимально приближенным к производственным.
С этой целью была использована пилотная установка, размещенная в производственном помещении АО «Карбид», на которую поступал технически
отработанный газ, содержащий АМС. На основе полученных данных составлен акт полупромышленного испытания пилотной установки по очистке газовых выбросов от АМС на АО «Карбид».
Таблица 2 - Очистка загрязненного воздуха от АМС в лабораторной модели установки
| Тест-культура | Соотношение бактерий на загрузке | Концентрация АМС, мг/м3 | Эффективность очистки от АМС, % | | |
| в подавае-мом газе | в выходя- щем газе | ||||
| Консорциум P. аeruginosa 8 и Bac. сere-us 3 | 1:1 | 200 300 400 | 22,5±1,8 42,7±2,4 55,6±2,7 | 88 86 86 | |
| 1:2 | 200 300 400 | 9,1±0,6 16,5±0,8 21,4±1,5 | 95 94 94 | ||
| 1:3 | 200 300 400 | 1,9±0,1 3,5±0,18 4,9±0,3 | 99 98 98 | ||
| 1:4 | 200 300 400 | 5,7±0,4 9,9±0,8 13,8±1,1 | 97 97 96 | ||
Создание пилотной установки было продиктовано необходимостью моделирования реальных условий, существующих в промышленных газоочистительных установках. Данные по очистке технически отработанного газа на пилотной установке показали хорошие результаты по эффективности очистки от 91 до 98% и были рекомендованы к производственным испытаниям. На данный способ по очистке промышленных газовых выбросов от АМС ассоциацией бактерий Pseudomonas aeruginosa 8-Bacillus cereus 3 было получено авторское свидетельство на изобретение.
Полученные результаты экспериментов на лабораторной и пилотной установках свидетельствуют о перспективности использования данной биотех-нологии для очистки промышленных выбросов от целого ряда летучих арома-тических соединений, образуемых в процессе работы предприятий нефтепе-реработки и нефтехимии. Было доказано, что пилотные испытания представ-ляют собой важнейший элемент отработки технологических режимов и обеспе-чивают сбор необходимых данных по газовым выбросам для последующего масштабирования установки.