В. М. Бунтукова Е. К. Клеточная селекция
| Вид материала | Лекция |
- Сущность клеточной теории. Клеточная теория, 37.11kb.
- Темы практических и реферативных работ студентов в рамках физиологического кружка кафедры, 27.13kb.
- Селекция баклажана для аридной зоны нижнего поволжья 06. 01. 05 Селекция и семеноводство, 336.5kb.
- Методические рекомендации по преподаванию биологии в 11 классе. Планы уроков «Селекция, 216.83kb.
- Селекция на повышение требований к ростовым веществам, 52.08kb.
- План: Что такое селекция? Из истории развития селекции, 53.14kb.
- Князев Андрей Николаевич, кандидат биол наук, доцент; биотехнология растений Калашникова, 92.43kb.
- Рабочая программа генетика и селекция Код дисциплины по учебному плану опд ф 1 для, 292.62kb.
- Генетика, селекция, гибридизация рыб. Тезисы докладов, 21.08kb.
- Задачи селекции : повышение урожайности сортов культурных растений, увеличение продуктивности, 105.58kb.
2.4. Устойчивость высших растений к засолению
В настоящее время известно, что культивируемые in vitro клеточные линии гликофитных растений могут быть «адаптированы» для роста при солевом стрессе. Пассируя гаплоидные каллусные ткани N. sylvestris на среде с постоянно увеличивающейся концентрацией соли, получены клеточные линии, способные к росту в присутствии 0,17 М (1 %) NaCl. После
предварительной обработки суспензионной культуры N. tabacum мутагеном (0,15 % ЭМС, 60 мин.), путем одноступенчатой селекции выделены клеточные линии, устойчивые к 0,03 М NaCl. Устойчивость к соли сохраняли суспензионные культуры при культивировании их в течение нескольких пассажей на селективных средах.
Выделены через культуру тканей растения льна-долгунца, устойчивых к высоким концентрациям солей (2,5-3 %). Каллусные ткани получали из сегментов гипокотилей, высаживали на селективную среду, а через 32 дня среди массы погибших клеток отбирали зеленые колонии, из которых генерировали растения, выносливые к засолению.
В большинстве случаев отобранные клеточные культуры в присутствии соли росли хуже, чем на обычной среде. Некоторые солевыносливые линии, например люцерны и риса, обладали свойствами галофитов, и оптимум роста у них отмечался при наличии в среде хлорида натрия. Солевыносливость стабильна и при отсутствии постоянного селективного давления и может проявляться на уровне растений-регенерантов.
Селекция к высоким концентрациям (0,43 М) позволяет получать клеточные линии, характеризующиеся как нестабильной, так и стабильной толерантностью. Причиной обратимой нестабильной адаптации клеток к NaCl является физиологическая адаптация, обусловленная изменением экспрессии генов. Изменения экспрессии генов, в частности синтез протеина 24 кД, могут быть индуцированы абсцизовой кислотой, которая аккумулируется в солеадаптированных клетках.
Несмотря на то, что хлорид натрия является одним из основных стрессовых факторов засоленных почв, другие соли также обладают токсическим эффектом на растения. Поэтому, моделируя in vitro условия, более близкие к встречаемым в природе, используют для селекции смеси солей или морскую соль. Была получена стабильно устойчивая каллусная культура Brassica napus к 10 мМ Na2SO4. Данная культура содержала в 5-6 раз больше пролина по сравнению с контрольной.
Солевыносливость растений удается также повысить в результате селекции к одному фактору засоления – осмотическому стрессу. Например, клетки томата, адаптированные к водному стрессу, индуцированному полиэтиленгликолем, обладали повышенной устойчивостью к NaCl.. Повышенная толерантность к соли обнаружена у клеточных линий моркови, отобранных на среде, содержащей в качестве неутилизируемого осмотика в высокой концентрации (99-870 мМ) маннитол. Получение солевыносливых форм растений возможно через сомаклональную изменчивость и химический мутагенез.
2.5. Устойчивость высших растений к ионному стрессу
Во всех экспериментах по клеточной селекции растений на устойчивость к ионным стрессам был использован метод прямой селекции, при котором в качестве селективного агента применяли токсические концентрации солей. Однако создание стрессовых селективных условий in vitro, идентичных таковым в природе, крайне затруднительно. В природных условиях помимо токсического действия ионов накладываются другие факторы, в частности наличие различных веществ, кислые значения рН среды. Для селекции на клеточном уровне были предложены среды, которые хотя не полностью соответствовали естественным стрессовым условиям, все же обеспечивали экспрессию признака устойчивости и давали возможность отбирать нужные варианты. Создание таких специальных сред было необходимо, например, для селекции на устойчивость к алюминию. Ионы алюминия при высоких значениях рН преципитируют в виде Аl(ОН)3, а при низких рН (<5) агаризованная среда не застывает. Использовались агаризованные питательные среды со стандартным значением рН (5,8), содержащие алюминий в виде Аl-ЭДТА, а также жидкие среды с низким рН (4,0). Так, уже в 1978 г. были выделены клеточные линии томата, которые росли в присутствии 200 мкМ Аl3+ в виде Аl-ЭДТА. В последующих экспериментах с культурой клеток применялись среды с 600 мкМ Аl3+, при низкой концентрации фосфата (10 мкМ), кальция (0,1 мкМ) и рН 4,0.
Для выделения устойчивых вариантов была предпринята прямая селекция, при которой необработанные мутагеном суспензионные клетки переносили на Аl-токсичную среду и через 123 дня производили отбор, или после 10-дневного культивирования клеток на селективной среде их высаживали на неселективные с последующей идентификацией устойчивых клонов. Устойчивые к алюминию клеточные линии, а также растения-регенеранты получены у сорго, сои и моркови.
Путем прямой селекции in vitro отобраны клеточные линии петунии, устойчивые к ртути; клеточные линии моркови, одновременно устойчивые к алюминию и марганцу; суспензионные клеточные культуры дурмана и томата, устойчивые к кадмию, которые отбирали на среде с CdCl2. Постоянно повышая в среде концентрацию СdSO4, были выделены линии, устойчивые к 500-2000 мкМ кадмия. После 3 мес. культивирования на обычных средах устойчивость к кадмию сохранялась, причем обнаруживалась перекрестная устойчивость к цинку и меди.
2.6. Устойчивость высших растений к засухе
С целью имитации in vitro стрессового эффекта засухи применяют питательные среды, которые дополнены осмотически активными веществами, понижающими внешний водный потенциал. В качестве такого селективного агента для селекции на устойчивость к засухе используют ПЭГ, представляющее собой непроникающее в клетку осмотически активное вещество. Первое сообщение о выделении клеточных линий табака, устойчивых к стрессу, индуцированному ПЭГ, появилось в 1979 г. Позже для селекции на засухоустойчивость использовали клеточные линии томата, которые подвергались водному стрессу при культивировании в присутствии ПЭГ. Селективная питательная среда для культивирования каллуса содержала 15 % ПЭГ 6000. В результате опытов были отобраны устойчивые каллусные линии, однако устойчивость быстро терялась при культивировании каллуса на среде без осмотика, что указывает на физиологическую природу адаптации.
Тестирование каллусных линий на рост в присутствии ПЭГ предложено для идентификации выносливых к засухе генотипов сои. Анализ роста каллусных тканей десяти сортов сои на средах с 0; 15; 20 % ПЭГ 8000 свидетельствовал о корреляции засухоустойчивости у растений и толерантности к ПЭГ культивируемых клеток. Эти данные подтверждают возможность поиска в культуре in vitro устойчивых генотипов среди существующего в природе генетического разнообразия.
2.7. Устойчивость высших растений к экстремальным температурам
Причиной стрессового фактора у растений могут быть относительно высокие или низкие температуры.
Холодовой стресс у растений может быть вызван температурами большого диапазона: от 10-15 до 00С. Такому стрессу наиболее подвержены растения тропических и субтропических зон. Современные теории объясняют все типы повреждений, вызванных охлаждением, температурозависимым превращением липидов мембран из жидкого кристаллического состояния в твердое и температурозависимым изменением гидрофобной природы мембранных белков, что ведет к нарушениям различных физиологических процессов. Стойкость растений к охлаждению обусловлена способностью липидов мембран оставаться в жидком состоянии благодаря наличию большой пропорции ненасыщенных жирных кислот и/или повышенного содержания стеролов. Повреждения, вызванные промораживанием растений (температура ниже 00С), связаны, прежде всего с формированием внеклеточного льда. При этом отток воды во внеклеточное пространство приводит к вторичному эффекту, вызванному вожным стрессом. Адаптация растений к отрицательным температурам у большинства морозоустойчивых растений происходит при постепенном закаливании пониженными температурами в осенний период. Нарушения, вызываемые отрицательными температурами, могут быть предотвращены аккумуляцией антифризных веществ, уменьшением количества несвязанной воды при обезвоживании и увеличением способности переохлаждаться (Генкель, 1967).
Важную роль в защите растений играет накопление свободного пролина. Как показали результаты клеточной селекции к гидроксипролину, полученные каллусные линии и растения картофеля, устойчивые к данному аналогу пролина, аккумулировали пролин и обладали повышенной морозоустойчивостью и толерантностью к NaCl.
Первые эксперименты, в которых описана возможность использования культивируемых растительных клеток для отбора выносливых к низким температурам клеточных линий, опубликованы в 1976 году. В качестве материала для селекции применялись суспензионные культуры табака и перца, которые после высева в агаризованную среду подвергались в течение 21 дня температурам – 3 и 40С. Выжившие колонии культивировали при 240С и затем повторно тестировались. Среди отобранных клонов были обнаружены линии, стабильно сохраняющие повышенную холодоустойчивость.
Эксперименты по селекции на устойчивость к замораживанию проведены И.И. Тумановым с сотр. (1977), в них каллусную ткань Picea exoelsia предварительно закаливали охлаждением, а затем подвергали отрицательным температурам. В результвте были выделены устойчивые клеточные клоны.
У хризантем были выделены мутанты, выносливые к низким температурам. Черенки асептически выращиваемых растений и суспензионную культуру подвергали облучению рентгеновскими лучами (5-25 Гр). Из них было получено большое количество регенерантов, которые высаживали в почву.
Индукция in vitro генетического разнообразия несомненно найдет применение для отбора более выносливых вариантов.
2.8. Устойчивость высших растений к радиационному стрессу
В естественных или экспериментально созданных условиях стрессовое состояние у растений может быть индуцировано повышенным уровнем УФ или ионизирующего излучения. Первостепенное значение облучения связано с его влиянием на генетический аппарат клетки. Различные типы излучений могут также непосредственно нарушать многие физиологические процессы: дыхание, фотосинтез, рост, активный транспорт, а также ионный баланс и синтез белка. Разные виды растений или отдельные образцы обладают различной чувствительностью к УФ и проникающей радиации. Основную роль в защите растений от облучения играют репарационные процессы, среди которых выделяют репарацию генетических управляющих систем клетки и репарацию отдельных клеточных структур (Гродзинский Д.М., 1983).
Облучение в работе с клеточными культурами использовалось в качестве мутагена. Направленная селекция in vitro на устойчивость к высоким дозам ионизирующего излучения дала положительные результаты в экспериментах с бактериальными клетками.
Устойчивость к УФ излучению, которое обладает слабой проникающей способностью, может быть обусловлена абсорбцией падающей радиации эпидермальными клетками, морфологическим строением растений, которое предохраняет чувствительные клетки, механизмами фоторепарации. Значительную роль в защите растений от УФ играет аккумуляция в вакуоле клетки флавоноидов, абсорбирующих значительную часть УФ радиации. Образование и накопление флавоноидов наблюдалось при обработке УФ растений и неорганизованно растущих тканей. Облучение УФ протопластов петрушки стимулировало весь фенилпропаноидный биохимический путь синтеза флавоноидов. Для выделения устойчивых к УФ линий использовалась суспензионная культура Rosa domascena, которую подвергали облучению дозой 250 Дж/м2. Колония, обнаруженная при высеве облученных клеток, сохраняла устойчивость; клетки были в 2,2-2,8 раза больше в размере и имели вдвое увеличенное содержание ДНК. На поздних стадиях культивирования устойчивые клетки накапливали большие количества флавоноидов.
Список литературы
Биотехнология растений. Клеточная селекция / Сидоров В.А.; Отв. ред. Глеба Ю.Ю. – Киев: Наук. думка, 1990. – 280 с.
Генкель П.А. Физиология устойчивости растительных организмов // Физиология сельскохозяйственных растений.- М.: Изд-во Моск. ун-та, 1967. – Т. 3. – С. 87-325.
Гродзинский Д.М. Надежность растительных систем. – Киев: Наук. думка, 1983. – 366 с.
Лутова Л.А. Биотехнология высших растений: Учебник. – СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2003. – 228 с.
Туманов И.И., Бутенко Р.Г., Оголевец И.В., Сметюк В.В. Повышение морозостойкости культуры каллусной ткани ели путем вымораживания менее устойчивых клеток // Физиология растений. – 1977. – 24, вып. 5. – С. 895-899.