В. М. Бунтукова Е. К. Клеточная селекция
| Вид материала | Лекция |
- Сущность клеточной теории. Клеточная теория, 37.11kb.
- Темы практических и реферативных работ студентов в рамках физиологического кружка кафедры, 27.13kb.
- Селекция баклажана для аридной зоны нижнего поволжья 06. 01. 05 Селекция и семеноводство, 336.5kb.
- Методические рекомендации по преподаванию биологии в 11 классе. Планы уроков «Селекция, 216.83kb.
- Селекция на повышение требований к ростовым веществам, 52.08kb.
- План: Что такое селекция? Из истории развития селекции, 53.14kb.
- Князев Андрей Николаевич, кандидат биол наук, доцент; биотехнология растений Калашникова, 92.43kb.
- Рабочая программа генетика и селекция Код дисциплины по учебному плану опд ф 1 для, 292.62kb.
- Генетика, селекция, гибридизация рыб. Тезисы докладов, 21.08kb.
- Задачи селекции : повышение урожайности сортов культурных растений, увеличение продуктивности, 105.58kb.
2.2. Устойчивость к гербицидам
Современные гербициды обладают селективным действием, т.е. при их применении гибнут только сорняки и остаются незатронутыми культурные растения. В основе такого дифференциального действия гербицидов лежит способность растений выводить или разлагать их до нетоксичных соединений.
Гербициды нарушают различные биологические процессы и поэтому подразделяются на несколько классов.
1. Гербициды, влияющие на хлоропласты, т.е. их действие связано с фотосинтезом. Сейчас это наиболее «подходящая» мишень, поскольку такие гербициды нетоксичны для человека и животных, неспособных к фотосинтезу.
2. Гербициды, мишенью которых являются митохондрии. Например, карбоксин специфически ингибирует только растительные митохондрии.
3. Гербициды, действующие на клеточные мембраны.
4. Гербициды, затрагивающие метаболизм нуклеиновых кислот и белка.
Наиболее важными с коммерческой точки зрения являются гербициды, относящиеся к первому классу, действие которых связано с блокированием фотосинтетических процессов. Их подразделяют на гербициды: 1) способные ингибировать перенос электронов; 2) являющиеся ингибиторами переноса энергии; 3) являющиеся ингибиторами акцепторов электронов. Обычно их действие связано с фотосистемой II. К гербицидам этого класса относятся азидо-S-триазины, бис-карбаматы, урацилы, дифенилэфиры и др. К настоящему времени известно около 20 их разновидностей. Устойчивость к гербицидам, блокирующим фотосинтетические процессы, обычно объясняют мутацией, которая видоизменяет структуру фермента так, что он теряет способность связываться с гербицидом. Например, устойчивость к гербицидам триазинового ряда обусловлена рецессивной мутацией в хлоропластном гене psbA, кодирующем белок 32 кДа тилакоидной мембраны, входящей в состав фотосистемы II. В норме триазин связывается с белком 32 кДа и при этом блокирует фотосинтетический транспорт электронов, изменяет его акцепторные свойства. Простая замена серина на глицин в положении 264 в 32 кДа-полипептиде приводит к уменьшению сродства к гербициду. Только увеличение дозы гербицида в 1000 раз подавляет рост мутантных растений. Как правило, полная гербицидоустойчивость сопровождается уменьшением скорости электронного транспорта и, следовательно, снижением активности фотосинтеза и продуктивности в целом. Однако, как показали исследования на хламидомонаде, устойчивые к триазиновым гербицидам мутанты характеризовались нормальной скоростью фотосинтеза и ростом. Анализ выявил, что у мутантов произошли другие замены в 32 кДа-полипептиде, а именно серин – на аланин. Вероятно, у растений также можно получать мутации, затрагивающие различные участки гена psbA.
Устойчивость к гербицидам, ингибирующим синтез аминокислот, связана со сверхпродукцией ферментов, служащих мишенью для гербицидов. Примером таких гербицидов является глифосат – гербицид широкого спектра действия, подавляющий рост двудольных сорняков в посевах однодольных культурных растений. Этот гербицид ингибирует фермент 5-энол-пирувилшикимат-3-фосфат-синтазу – ключевой фермент шикиматного пути биосинтеза ароматических аминокислот фенилаланина, трептофана. У мутантов имеет место 20-кратная (и даже 43-кратная) амплификация гена, кодирующего этот фермент, что приводит к уменьшению чувствительности к глифосату.
Устойчивость к гербицидам может быть связана и с их детоксикацией, которая зависит от химических свойств гербицида и видовых особенностей растений. Так, атразин может разрушаться N-деалкилированием или связываться с глутатионом. Устойчивость может зависеть, кроме того, от проникновения и перемещения гербицида в растении, что определяется морфологией и мембранной проницаемостью растений. Это имеет большое значение, т.к. мутанты с измененной мембранной проницаемостью для гербицидов являются единственной возможностью получения растений, толерантных к гербицидам с комплексным действием и сложной системой детоксикации.
Устойчивость к гербицидам может контролироваться отдельными доминантными, полудоминантными или рецессивными аллелями ядерных генов, а также генами хлоропластов. Это связано с разными механизмами действия гербицидов. Частота мутаций при этом низкая, около 1.10-12.
Традиционно из популяции растений выявляют устойчивые формы и вовлекают их в скрещивание. Однако, как правило, устойчивость характерна для дикорастущих видов и при скрещивании их с культурными формами может наблюдаться гибридологическая несовместимость. Иногда для получения гербицидоустойчивых растений применяют мутагенез, но это требует анализа большого количества материала, т.к. частота мутаций низкая.
Новые возможности открыли методы in vitro, среди которых выделяют: 1) селекцию in vitro, 2) селекцию in situ, 3) генетическую трансформацию, 4) слияние протопластов.
Селекция in vitro. Отбор ведется на селективных средах, содержащих токсичные дозы гербицида. Так как метод позволяет анализировать миллионы клеток, это дает возможность выявить устойчивость к гербицидам. Для повышения эффективности отбора необходимо, чтобы признак устойчивости проявлялся не только на уровне растения, но и на уровне клеток. Например, методом прямой селекции на селективных средах отобраны клеточные линии и растения-регенеранты, устойчивые к 2,4-Д, параквату и др. В качестве объектов использовались табак, клевер, соя.
Следует, однако, отметить, что не всегда удается получить растения из устойчивых клонов, а среди полученных растений многие не обладают устойчивостью, свойственной клеточным линиям. Высокие концентрации гербицидов часто вызывают вторичный эффект за счет гибели клеток и накопления токсичных фенольных соединений, которые, в свою очередь, приводят к гибели устойчивых единичных клеток. Поэтому используют ступенчатую субселекцию с последующей пересадкой и постепенным повышением концентрации гербицида.
Например, суспензию диплоидных клеток табака (Nicotiana tabacum) высевали на среду с 500 мкМ пиклорана. Были получены растения-регенеранты, которые дали толерантное потомство. Выявлено пять независимых мутантов из разных клонов, из которых три мутации наследовались как доминантные, а две – как полудоминантные. Два гена оказались сцепленными, а два – отнесенными к другим группам сцепления. Степень устойчивости у клеточных линий и самих растений-регенерантов была различной. У клеток устойчивость возрастала в 100 раз, а у растений – в 5-10 раз по сравнению с контролем. Однако при использовании вторичной каллусной культуры из растений-регенерантов опять наблюдалась устойчивость, полученная на клеточном уровне.
Селекция in situ, или «метод зеленых островков». В таких исследованиях используют гербициды, ингибирующие фотосинтез (например, бентазан); эти гербициды не влияют на рост культивируемых клеток, но у самих растений вызывают потерю окраски листа. Устойчивые островки, состоящие из зеленых клеток, вырезают, помещают на среды для культивирования и впоследствии из них индуцируют растения-регенеранты. Такой же способ применяют для гербицидов, которые ингибируют синтез каротиноидов (флуразон). Метод селекции in situ подразумевает использование в качестве исходного материала части листа или другого органа, что приводит к выигрышу времени, т.к. исключается стадия получения каллуса.
Устойчивость к карбаматам. Изопропил-N-фенилкарбамат (IPC) является гербицидом, который нарушает митоз у растительных клеток. Как предполагает Сидоров В.А. (1990) этот гербицид в отличие от колхицина не связывается с тубулином, но нарушает центры организации микротрубочек, приводя к формированию многополюсных аппаратов веретена деления. Для выделения мутантов устойчивости к данному гербициду используют в качестве исходного материала протопласты Nicotiana tabacum, которые после мутагенеза (0,2 % ЭМС) и прекультивирования в жидкой среде (несколько дней) высевали в агаризованную среду с 5 мкг/мл IРС. Большинство растений, полученных при регенерации растений в присутствии IPC, оказались стерильными.
Устойчивость к амитролу. Амитрол (3-амино-1,2,4-триазол) – гербицид широкого спектра действия, который в природе быстро разлагается почвенными бактериями. Биохимические исследования свидетельствуют о множественном характере действия амитрола. Имеются доказательства, что данный гербицид является специфическим ингибитором имидазолглицеролфосфат-дегидрогеназы, ключевого фермента биосинтеза
гистидина, а также ингибитором синтеза каротиноидов. Исследования, направленные на получение через культуру клеток мутантов устойчивости к амитролу, начаты в 1977 г. Селекцию проводили в присутствии 2,5-7,5.10-5 М амитрола, который в этих концентрациях приводил к обесцвечиванию как организованно растущих, так и дедифференцированных каллусных тканей. К этим концентрациям гербицида выделены выносливые клеточные линии, а также регенерированы растения.
Устойчивость к феноксисоединениям. 2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) является потенциальным гербицидом по отношению к двудольным растениям. Материалом для селекции клеток, устойчивых к данному гербициду, служила суспензионная культура Nicotiana sylvestris (n=12). Постепенное увеличение концентрации 2,4-Д в среде для культивирования клеток позволило через 1,5 года постоянного пассирования отобрать линии, устойчивые к 10-3М концентрации 2,4-Д. Устойчивость к 2,4-Д обнаруживали клеточные линии суспензионной культуры белого клевера без предварительного мутагенеза. Клеточные линии клевера были адаптированы также к 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоте и 4-(2,4-дихлорфенокси) масляной кислоте. Устойчивость к 2,4-Д, которая является синтетическим ауксином, связана с модификацией синтеза ДНК и дыхания клетки, что редуцирует чувствительность клетки к фитотоксическим концентрациям гербицида.
Возможные области использования гербицидов и мутантов. Были проделаны опыты по слиянию протопластов с целью переноса пластид от устойчивых к атразину растений. В качестве донора мутантных пластид использовался атразин устойчивый биотип Brassica campestris, у которого признак устойчивости наследовался по материнской линии. В качестве реципиента был другой вид Brassica – B. napus. Удалось регенерировать цибриды, содержащие пластиды B. campestris и геном B. napus. Перенос пластид был подтвержден рестрикционным анализом хлДНК и двумерным электрофорезом тилакоидных протеинов. Хлоропластный признак устойчивости к гербицидам является подходящим маркером для успешной селекции соматических гибридов и цибридов наподобие цитоплазматических мутантов устойчивости к антибиотикам.
Выделенные путем клеточной селекции линии, устойчивые к гербицидам, находят все большее применение в качестве исходного материала для исследований по генной инженерии растений. Наряду с сообщением о получении путем трансформации растений табака выносливых к глифосату, у которых экспрессировался бактериальный ген ЕПШФ-синтазы, получены трансформанты на основе на основе использования химерного гена ЕПШФ-синтазы из глифосатустойчивых клеточных линий растений. Клон комплементарной ДНК (кДНК), кодирующий ЕПШФ-синтазу, был выделен из кДНК библиотеки глифосатустойчивой клеточной линии Petunia hybrida (МР4-G), которая характеризуется 20-кратной амплификацией гена ЕПШФ-синтазы и соответственно сверхпродукцией этого фермента. Сконструированный при использовании промотора 35S вируса мозаики цветной капусты ген ЕПШФ-синтазы экспрессировался как в клеточных тканях, так и в целых растениях, что обеспечивало их толерантность к глифосату.
Возможны также другие области применения самих гербицидов в различных клеточных технологиях. Отдельные «обесцвечивающие» гербициды (например, метфлюразон), полностью подавляя фотосинтез, являются не токсичными для растений, тканей и протопластов, растущих в гетеротрофных условиях. Из полностью обесцвеченных растений выделенные протопласты картофеля делились и давали начало клеточным колониям. Такие гербициды могут найти применение как обесцвечивающие агенты мезофильных протопластов, используемые в слиянии.
Появляются новые гербициды, механизм действия которых основан на ингибировании митохондрий. Такие специфические гербициды позволят маркировать митохондрии растений, получая к ним мутанты устойчивости. Наличие митохондриальных мутантов даст возможность направленного манипулирования у растений не только пластидами, но и митохондриями и связанными с ними признаками.
Ядерные мутанты устойчивости к гербицидам так же, как и к другим антиметаболитам, должны найти широкое применение в качестве удобного маркированного материала для решения практических задач и теоретических вопросов генетики соматических клеток.
2.3. Устойчивость к болезням растений
Устойчивость высших растений к фитостеринзависимым патогенам и вредителям сельскохозяйственных культур. Универсальность строения эукариотической клетки отмечается на всех уровнях ее организации и является результатом сходства составляющих ее органических молекул и способов их компоновки. Одним из примеров такого рода соединений служат стерины – полициклические спирты фенантренового ряда. У высших грибов доминирующим является эргостерин, а у высших растений – ситостерин, в несколько меньших количествах ему сопутствуют стигмастерин и кампестерин.
В эукариотических клетках свободные формы стеринов являются прежде всего структурными компонентами мембран, как плазмалеммы, так и клеточных органелл. Равное количественное соотношение стеринов и фосфолипидов обеспечивает механическую прочность и упругость липидного бислоя, т.к. плоские жесткие полициклические ядра ограничивают подвижность остатков жирных кислот в молекулах фосфолипидов. Недостаток стеринов в клетках приводит к повышенной проницаемости мембран, увеличивает вероятность их слипания и самопроизвольного лизиса клеток. Выделяют также «регуляторные» стерины, которые присутствуют в мембранах в незначительных количествах и, по-видимому, регулируют их функционирование. Имеются данные о том, что состояние мембраны (текучесть) влияет на работу интегрированных в нее ферментативных комплексов. Связанные (этерифицированные) формы стеринов, наоборот, локализованы в цитоплазматических липидных каплях и, возможно, играют роль в регуляции метаболизма стеринов.
При переходе от клеточного уровня к организменному становится очевидной гормональная функция стеринов. Производные холестерина представлены различными классами стероидных гормонов позвоночных, контролирующих функционирование репродуктивной системы особей, поддержание гомеостаза организма. У беспозвоночных, в частности у насекомых, стероидные гормоны («мозговой гормон» и экдизон) отвечают за процессы линьки и метаморфоза личинок и формирование репродуктивной системы. Имеются данные о наличии стероидных половых гормонов (антеридиол, архегониол) у высших грибов. Высшие растения не являются исключением в этом отношении. Помимо 5 классов известных фитогормонов у них выделяется еще класс стероидных гормонов брассикастероидов, отвечающих за элонгацию растительных клеток, а также участвующих в регуляции светоиндуцированных процессов.
Таким образом, стерины и их производные жизненно необходимы для всех эукариот. Однако не все эукариоты способны синтезировать их самостоятельно.
Биогенез стеринов является частью общего биосинтеза изопреноидов, в ходе которого, например, у высших растений синтезируются пигменты, основная масса гормонов (абсцизовая кислота (АБК), гиббереллины, цитокинины), убихиноны, фитоалексины и многие другие соединения.
Из перечня продуцентов стеринов достоверно выпадают практически целые классы беспозвоночных (в том числе насекомые, нематоды), некоторые виды грибов-оомицет (например, сем. Pythiaceae). Это связано с тем, что в ходе эволюции ими независимо были утрачены те или иные ферменты, участвующие в синтезе стеринов de novo. Потребности в стеринах у этих организмов удовлетворяются либо за счет симбионтов, либо за счет корма. Среди представителей стеринзависимых организмов имеется значительное количество вредителей и возбудителей болезней высших растений.
В природе существует четкая взаимосвязь между растениями-хозяевами и обитающими на них насекомыми и другими организмами. Определенное соотношение стеринов в растении контролируется его генотипом. Поэтому зависимость многих организмов от состава стеринов в растении можно рассматривать как конкретный генетический признак при изучении процессов становления и реализации взаимоотношений типа «растение – потребитель стеринов».
Кроме того, стериновая зависимость – это интересное явление с практической точки зрения, поскольку, изменив состав стеринов в растении, можно ожидать негативного действия этих изменений на организм – потребитель стеринов. Было установлено, например, что недостаток стеринов в пище самок и личинок саранчи приводит к увеличению гибели эмбрионов и смертности среди личинок.
Эксперименты в модельной системе «дрожжи – дрозофила», проведенные Лутовой Л.А. (2003) в С.-Петербургском госуниверситете, наглядно продемонстрировали зависимость репродуктивной системы самок мух от состава стеринов в корме. Измеряемый показатель плодовитости самок отражал эффективность протекания различных стероидзависимых процессов – кладки яиц, их жизнеспособности, развития личинок и их метаморфоза, формирования репродуктивной системы вылупившихся самок. Аналогичные результаты были получены и на модельной системе «табак – дрозофила». Полученные данные укладываются в следующие закономерности: 1) при использовании клеточных линий Nicotiana tabacum с измененным метаболизмом стеринов плодовитость самок Drosophila melanogaster изменяется, при этом выделяются линии, достоверно снижающие учитываемый показатель; 2) достоверное снижение плодовитости самок сохраняется при использовании как клеточных культур (каллуса) отобранных линий, так и регенерированных из них растений; 3) снижение показателя происходит в результате повышенной гибели личинок на ранних стадиях развития и сопровождается задержками в развитии, а в некоторых случаях и редукцией яичников у вылупившихся самок.
Предполагается, что изменения в метаболизме стеринов с сельско-хозяйственных культурах могут стать основой для получения растений с повышенной устойчивостью к облигатным фитостеринзависимым патогенам или вредителям. Примером являются культурный картофель Solanum tuberosum и его облигатный патоген Phytophthora infestans, возбудитель поздней гнили картофеля. Фитофтора принадлежит к небольшому числу грибов-оомицет, неспособных к самостоятельному синтезу стеринов. У различных видов этого рода в мицелии обнаруживается сквален, однако дальнейшие этапы его циклизации и конверсии в эргостерин отсутствуют. Именно эта особенность объясняет тот удивительный факт, что огромное количество фунгицидов широкого действия, основанных на ингибировании биосинтеза стеринов, оказались неэффективными против ряда фитопатогенных грибов родов Phytophthora и Pythium. Способность к вегетативному росту мицелия у этих грибов на искусственных средах без стеринов связывают с наличием в их мембранах гидрофобных молекул – фитофторолов, выполняющих аналогичные функции ограничения текучести мембран. Однако даже незначительное добавление экзогенных растительных стеринов повышает скорость роста гриба и спороношение. Процесс полового размножения происходит только при наличии стеринов. Кроме того, отмечается определенная корреляция между соотношением ситостерина и его предшественника циклоартенола и уровнем устойчивости различных сортов картофеля к фитофторозу.
При получении растений картофеля, устойчивых к фитофторозу, стеблевые и листовые экспланты были подвергнуты в условиях in vitro отбору на устойчивость к селективным агентам – филипину и байтану. Оба соединения характеризуются токсическим действием на растительные клетки, так как индуцируют нарушения в метаболизме стеринов. Полиеновый антибиотик филипин связывает свободные 5-стерины плазмалеммы, деформирует ее, что приводит к гибели клеток дикого типа. Байтан является фунгицидом, основной компонент которого (триадимефон) ингибирует фермент – цитохром П 450-обтузифолиол-14-деметилазу. Образующиеся промежуточные стерины не способны функционально комплементировать 5-стерины, и клетки с нормальным биосинтезом стеринов также гибнут. Источниками устойчивости к подобным соединениям служат либо увеличение эффективности биогенеза нормальных стеринов и повышение их количества в клетке, либо запуск альтернативных стероидогенных путей.
Селекционные программы, направленные на получение фитофторо-устойчивых сортов картофеля, работают в основном с R-генами, обеспечивающими расоспецифическую устойчивость. Однако быстрое увеличение доли простых и сложных рас с разными генами вирулентности сводит преимущества таких сортов практически к нулю. Современная концепция поиска и внедрения источников горизонтальной (неспецифической) устойчивости в культурные сорта осложняется отсутствием данных о каких-либо механизмах ее действия. Изменение метаболизма стеринов и их содержания может быть одним из таких механизмов. Показано, что при поражении растений картофеля несовместимой расой фитофторы происходит быстрое переключение в пути биосинтеза изопреноидов и их общего пула фарнезилдифосфата начинается синтез фитоалексинов, тогда как синтез стеринов в тканях уменьшается в несколько раз. Кроме того, предлагаемый способ защиты снижает численность популяции патогенна, а не приводит к его полному исчезновению. Это позволит значительно уменьшить количество инфекции на полях, что повысит эффективность R-генов, снизит темпы расообразования за счет мутаций и приведет к подавлению полового процесса у гриба, тем более что ооспоры становятся одним из существенных источников инфекции.
Использование патогенов в селекции на устойчивость к болезням. Наиболее простой подход в селекции in vitro на устойчивость к болезням связан с культивированием клеток непосредственно в присутствии патогенна. Этот подход может быть особенно полезным, когда мало известно о токсических веществах, ответственных за патогенез, или если патоген не продуцирует токсины. Для выбора правильной схемы селекции прежде всего необходимо знание жизненного цикла патогенна. Многие патогенны, например, грибы имеют различные стадии жизненного цикла, несколько стадий спороношения, в зависимости от которых могут изменяться выживаемость, рост и эпидемиология; разные стадии отличаются хозяино- и тканеспецифичностью. Поэтому необходимо учитывать стадию спороношения, существенным для инфицирования могут быть световой и температурный режимы, относительная влажность, рН, наличие или отсутствие питательных веществ, что сказывается на прорастании спор. В некоторых случаях необходимым является наличие кутикулы или определенного типа ткани, вектора или раневой поверхности. Часто стратегия селекции может зависеть от биологии патогена. Например, для инфицирования некротрофами необходим высокий уровень инокулюма, тогда как заражение биотрофами может вызываться отдельными спорами или клетками. Также некротрофы хорошо растут в культуре, а биотрофы плохо, т.к. большинство из них облигатные паразиты.
Исследования по культивированию растительных клеток в присутствии патогена были начаты с 1965 года и направлены на изучение корреляции устойчивости / чувствительности к патогену in vivo и in vitro. Данный этап в работе, непосредственно не связанный с селекцией, позволял оценить экспрессию признака устойчивости на клеточном уровне и в целом определить правомерность предлагаемых схем отбора in vitro устойчивых вариантов. Например, для совместного культивирования с разными расами Phytophthora infestans использовались суспензионные культуры сортов картофеля, различающиеся по чувствительности к патогену. В строго контролируемых условиях культивирования найдена полная корреляция устойчивости при взаимодействии Phytophthora parasitica c клетками табака. Удалось увеличить выход устойчивых вариантов сельдерея при высаживании регенерирующих побегов на среду, заселенную Fusarium oxysporum. Успешно использовались в качестве эксплантов незрелые соцветия проса, зараженные Sclerospora graminicola, для выделения устойчивых к склероспорозу растений.
Методы селекции in vitro растений, устойчивых к заболеваниям, когда селективным агентом служат сами патогенны, могут давать положительные результаты, что зависит от правильного выбора стадии жизненного цикла патогена, подбора соответствующих условий совместного культивирования.
Селекция к патотоксинам. Один из перспективных методов селекции устойчивых к болезням растений основан на использовании в качестве селективного агента патотоксинов, которые обычно синтезируются патогенами. По действию патотоксины делят на три категории.
К первой относятся токсины, которые не являются определяющими в заболевании, обладают неспецифическим токсическим действием по отношению к хозяину и токсичны для широкого круга растений. Примером может служить табтоксин, продуцируемый Pseudomonas cyringae pv. tabaci, являющийся возбудителем бактериальной рябухи табака. Очищенный токсин не вызывает типичных симптомов болезни и в отличие от грубо очищенного токсина не ингибирует глутаминсинтетазу. Активной формой токсина является табтоксинин β-лактам, представляющий собой продукт гидролиза табтоксина.
Другая категория патотоксинов обладает такой же специфичностью по отношению к растениям, как и патоген, но они также не ответственны за развитие болезни. Сюда относится Т-токсин (Helminthosporium maydis) расы Т, патоген, вызывающий гельминтоспориоз кукурузы. Раса О D. maydis не продуцирует Т-токсин, но все же обладает патогенным эффектом. Раса Т-патогена образует Т-токсин, который специфичен для растений кукурузы, несущих цитоплазматический ген Tms, ответственный за цитоплазматическую мужскую стерильность (ЦМС). Растения с нормальной цитоплазмой не поражаются токсином.
Третья категория включает патотоксины, которые хозяиноспецифичны и вызывают типичные признаки болезни. Хорошим примером является викторин – токсин Helminthosporium victoriae – возбудитель гельминтоспороза овса, вызывающий корневую гниль и пятнистость листьев. Специфичность токсина зависит от присутствия у хозяина гена Victoria, отвечающего за устойчивость к Puccinia coronata.
Большинство токсинов имеют единственную мишень в клетках хозяина, и признак устойчивости находится под простым генетическим контролем. Это подтверждает целесообразность схем селекции in vitro, используемых при отборе вариантов, устойчивых к другим антиметаболитам, в частности антибиотикам, применительно и к патотоксинам.
Правомерность схем клеточной селекции на устойчивость может непосредственно зависеть от механизмов действия токсинов. Отдельные виды патогенов поражают клетки, а затем выделяют токсин. Другие – сначала выделяют токсины, которые убивают клетки, затем используют продукты их распада для питания. Естественно, в первом случае не будет корреляции между устойчивостью in vitro и in vivo, проведение селекции на клеточном уровне целесообразно лишь во втором случае.
Возможность отбора in vitro растений, устойчивых к болезням, была продемонстрирована при проведении селекции на устойчивость к метионин-сульфоксимину (аналог табтоксина), были получены клеточные линии, а затем растения с повышенной устойчивостью к патогену.
Культивирование клеток в присутствии Т-токсина как селективного фактора было использовано для получения растений кукурузы, устойчивых к гельминтоспорозу. Эмбриогенные каллусные ткани из восприимчивых линий кукурузы пассировали в течение нескольких пассажей в присутствии сублетальных доз Т-токсина. Изолированные клоны сохраняли устойчивость в течение нескольких месяцев при культивировании на неселективных средах.
Два устойчивых к Helminthosporium oryzae растения риса получены при селекции каллусной ткани к Н-токсину данного патогена, одно растение обнаружено в контроле. Как показал анализ потомства R1 выделенных растений, устойчивость к болезни, вызываемой Н. oryzae, наследуется как доминантный признак.
Девять растений, нечувствительных к викторину – токсину Helminthosporium victoriae идентифицировано в результате селекции каллусных культур из линий овса, гетерозиготных по доминантной чувствительной аллели Vb. Данная аллель одновременно ответственна за восприимчивость к H. victoriae и устойчивость к нескольким расам, вызывающих корончатую ржавчину. Нечувствительность к НV-токсину у регенерантов наследственна, поскольку все потомство этих растений также было нечувствительно к этому токсину и характеризовалось утратой устойчивости к корончатой ржавчине. Эти данные подтверждают перспективность использования викторина как инструмента для селекции на устойчивость к заболеванию, вызываемому Н. victoriae.
Наибольший урон сельскохозяйственным культурам наносит фитофтороз, поэтому неудивителен интерес ученых к применению в качестве селективного фактора не только культуральных фильтратов, но и очищенных токсинов Phytophthora. При тестировании каллусных клеток из дигаплоидов картофеля с разным уровнем полевой устойчивости к фитофторе на способность к росту на среде с токсинами показано следующее. Каллус из исходно устойчивых линий на среде с высокой концентрацией токсинов нарастал вполне нормально, но становился черным, тогда как каллус восприимчивого генотипа давал незначительный прирост массы или погибал. Используя для селекции медленно растущую на среде с токсинами каллусную ткань восприимчивых линий, отбирались отдельные участки каллуса, обладающие нормальной скоростью роста. Регенерирующие из них растения были устойчивыми к начальной стадии инфекции.
Из Fusarium выделяли грубо очищенные экзотоксины. Активность токсинов определяли путем измерения ингибирования активности дыхания клеток суспензионной культуры картофеля. Концентрация токсинов, которая была выше в 100-500 раз по сравнению с используемой для селекции, полностью ингибировала дыхание в течение 30 минут. Селекция проводилась на культуре протопластов с применением стандартных концентраций токсинов, при которых выживали и делились 1-5% протопластов. Из двух дигаплоидных линий картофеля было выделено и регенерировано по 1500 протоклонов, среди которых были ди- и тетраплоиды. В результате повторного тестирования листьев или вторичного каллуса из выделенных растений показано значительное увеличение устойчивости к токсинам. Действие токсинов определялось по приросту каллуса на среде с токсином или по размеру пятен после инокуляции листовых пластинок. Отобранные клоны были размножены и высажены для оценки в полевых испытаниях.
Применение для селекции культуральных фильтратов. В отношении многих патогенов, для которых патотоксины в чистом виде не выделены или не изучены, для селекции на устойчивость используются культуральные фильтраты. Необходимой предпосылкой их применения являются определение их роли в заболевании, изучение корреляции устойчивости к патогену у растений и культивируемых in vitro клеток.
Так, была обнаружена прямая корреляция между устойчивостью in vivo к Fusarium у гвоздики и устойчивостью на уровне клеток к культуральной жидкости этого патогена. Устойчивые к патогену сорта гвоздики соответственно характеризовались аккумуляцией фитоалексинов в каллусных тканях при их обработке препаратами клеточной стенки мицелия, играющих роль элиситоров.
Пассируя каллусную ткань дигаплоидных линий картофеля, обладающих высокой регенерационной способностью, на среде с токсической концентрацией культурального фильтрата Phytophthora infestans были выделены устойчивые клеточные клоны, давшие начало растениям. При механической инокуляции листьев спорами Phytophthora у 3 из 34 выделенных растений обнаруживались очаги поражения, значительно меньше по сравнению с контролем. Данная техника селекции пригодна для получения растений с общей устойчивостью к P. infestans.
Использование других приемов и технологий для получения in vitro устойчивых к болезням растений. В первую очередь следует вспомнить примеры использования сомаклональной изменчивости. Сомаклональная изменчивость как источник генетического разнообразия растений представляет особый интерес при отсутствии соответствующего селективного агента или когда устойчивость не экспрессируется на клеточном уровне. Значительный прогресс достигнут в изучении молекулярных механизмов устойчивости растений к болезням, биохимических путей синтеза многих веществ, таких как фитоалексины, которые могут служить биохимическими маркерами устойчивости. Хотя фитоалексины во многих случаях не играют первостепенную роль в защите растительных организмов от болезней, идентификация их специфических элиситоров позволит подойти к более глубокому пониманию устойчивости, наметить пути повышения защиты растений от заболеваний. Фитоалексины или другие биохимические индикаторы устойчивости, биосинтез которых можно индуцировать биотическими или абиотическими элиситорами у культивируемых клеток и даже протопластов, найдут применение в идентификации клеточных линий, растений, дающих положительный ответ.
Перспективным в селекции на устойчивость является использование иммунологических и молекулярно-биологических технологий для определения первичных продуктов генов или специфических нуклеиновых кислот, связанных с устойчивостью культивируемой клетки.
Основополагающими в совершенствовании культурных форм растений остаются межвидовая и межродовая гибридизации с дикими видами, носителями признаков устойчивости. Успешный перенос генов устойчивости путем традиционного скрещивания, достигнутый во многих комбинациях видов, получил новое развитие с привлечением метода культуры in vitro незрелых зародышей. Часто спасение зародышей в культуре является необходимым элементом технологии получения гибридных растений. В частности, таким образом были созданы сесквидиплоиды томата. Удвоение числа хромосом и повторяющееся беккроссирование иногда позволяют получать стабильные линии с парой хромосом дикого вида, а рекомбинация при облучении может вести к стабильному включению донорного фрагмента ДНК в геном культурального растения.
Соматическая гибридизация культурных растений с близко-родственными дикими видами, устойчивыми к заболеваниям, является альтернативой половой гибридизации. Путем соматической гибридизации был перенесен признак устойчивости к фитофторе и вирусу скручивания листьев из Solanum brevidens в картофель. Устойчивость к некоторым вредителям проявлялась у слматических гибридов, полученных в результате слияния протопластов баклажана и устойчивого вида Solanum sisymbriifolium. Перенос генов путем слияния протопластов, как и при половой гибридизации, ведет к переносу многих генов, большая часть которых кодирует нежелательные признаки. Для получения из гибридов форм растений с нужной комбинацией родительских признаков применяют беккроссирование или другие схемы, в которых используется половое скрещивание. При использовании метода «гамма» слияние протопласты одного партнера перед слиянием облучают высокими дозами γ-радиации. Это позволяет осуществлять перенос отдельных ядерных признаков устойчивости в филогенетически отдаленных комбинациях видов, а также цитоплазмы и признаков, кодируемых ее генетическими детерминантами.
В конце ХХ века огромный размах получили работы по переносу генов, основанные на использовании техники рекомбинантной ДНК. Гены могут быть заимствованы из таких источников, как животные, бактерии, вирусы, а также растения, и введены в культурные виды растений. Данная техника переноса ДНК позволяет использовать существующий природный генофонд и вновь синтезированные молекулы ДНК, осуществлять контролирование тканеспецифичности и уровня экспрессии перенесенных генов. Методами генной инженерии сконструированы растения, в которых показана экспрессия чужеродных генов устойчивости к болезням и вредителям. Значительный прогресс достигнут в разработке мер защиты растений от вирусных инфекций.