Роль цитомегаловирусной инфекции в патологии плода и новорожденного. Поиск новых противовирусных средств. 03. 00. 06. Вирусология

Вид материала

Автореферат диссертации

Содержание Официальные оппоненты Ведущая научная организация Список использованных сокращений ВКЖ – вируссодержащая культуральная жидкость ВПР ИА – индекс авидности ИППП ОАГА – осложненный акушерско-гинекологический анамнез ПСА – УФ - ультрафиолет ФЛЭЧ Общая характеристика работы. Цель исследования. Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи Научная новизна. Практическая значимость. Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения. Основные положения, выносимые на защиту. Апробация работы. Структура и объем диссертации. Материалы и методы исследования. Hcmv; hsv) Клинический материал. Выявление возбудителей ВУИ в материале аутопсии. ... Полное содержание

Подобный материал:

• Акушерство перечень практических занятий на 4 курсе лечебного факультета на II семестр, 29.23kb.
• Тульская областная научная медицинская библиотека акушерство и гинекология. 2011., 190.44kb.
• Он оказался общебиологическим феноменом, 359.5kb.
• Белорусскйи государственный медицинский университет гемолитическая болезнь новорожденных, 220.18kb.
• Влияние скэнар-терапии на течение беременности, родов, состояние новорожденного и ребенка, 146.76kb.
• 1. Модель пациента, 802.59kb.
• «Владивостокский государственный медицинский университет мз рф», 551.74kb.
• Оказания перинатальной помощи в Республике Беларусь, 72.85kb.
• Ю. И. Ишпахтин Научные основы охраны здоровья женщины, матери, плода, новорожденного, 39.31kb.
• И. Л. Элбакидзе, В. Ф. Ордынский,, 76.7kb.

На правах рукописи


АДИЕВА АЙНА АХМЕДОВНА


РОЛЬ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В ПАТОЛОГИИ ПЛОДА И НОВОРОЖДЕННОГО. ПОИСК НОВЫХ ПРОТИВОВИРУСНЫХ СРЕДСТВ.


03.00.06. – Вирусология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2009 г.

Работа выполнена в Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Научные консультанты:

доктор биологических наук, КУЩ

профессор Алла Александровна

доктор медицинских наук, НИСЕВИЧ

профессор Лика Львовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, МИЛЛЕР

профессор Галина Генриховна

доктор биологических наук БРАГИНА

профессор Елизавета Ефимовна

доктор медицинских наук, ЧЕШИК

профессор Святослав Георгиевич


Ведущая научная организация: НИИ переливания крови Научного гематологического центра РАМН


Защита состоится «___» _______________ 2009 г. в ____часов на заседании Диссертационного Совета Д.001.020.01 при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д.16

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Учреждении РАМН НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Автореферат диссертации разослан «___» __________ 2009 г.


Ученый секретарь диссертационного совета, БУРЦЕВА

доктор медицинских наук Елена Ивановна

Список использованных сокращений

АГ – антиген

АПФ – аминокислотные производные фуллерена С₆₀

АТ – антитело

БКМ – быстрый культуральный метод

БОЕ – бляшкообразующая единица

ВКЖ – вируссодержащая культуральная жидкость

ВПР – врожденные пороки развития

ВУИ – внутриутробное инфицирование

ГВИ – герпесвирусные инфекции

ГЦВ - ганцикловир

ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота

ИА – индекс авидности

ИППП – инфекции, передаваемые половым путем

ИФА – иммуноферментный анализ

ИФН – интерферон

МИ – множественность инфицирования

МКА – моноклональные антитела

ОАГА – осложненный акушерско-гинекологический анамнез

ПСА – поликлональные антитела

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЦР – IS - полимеразная цепная реакция in situ

ПЦР – RT - полимеразная цепная реакция с детекцией в реальном времени

РИФ (РНИФ) – реакция прямой (непрямой) иммунофлюоресценции

УФ - ультрафиолет

ФЛЭЧ – фибробласты легкого эмбриона человека

ХТИ – химиотерапевтический индекс

ЦД – цитотоксическая доза

ЦМВ – цитомегаловирус человека

ЦМВИ – цитомегаловирусная инфекция

ЦНС – центральная нервная система

ЦПД – цитопатическое действие

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Внутриутробная инфекция (ВУИ) занимает одно из ведущих мест в структуре перинатальной смертности, являясь основной причиной смерти или осложняя течение основного заболевания у 37,5% умерших новорожденных [Цинзерлинг и др., 2002]. Достоверных данных об истинной распространенности ВУИ нет, однако согласно данным ряда исследователей, инфекционные заболевания выявляют у 50-60% госпитализированных доношенных и 70% недоношенных новорожденных [Володин и др., 2004; Сидорова и др., 2006].

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) является одной из наиболее распространенных внутриутробных инфекций, вызывающих тяжелые патологии, вплоть до гибели ребенка [Gibson et.al., 2008; Kenneson et.al., 2007; Kriebs et.al., 2008].

Прогресс в изучении ЦМВИ связан с разработкой и широким внедрением в практику здравоохранения принципиально новых диагностических технологий – высокочувствительных и специфичных методов иммунохимии, молекулярной и клеточной биологии. В связи с этим оценка эффективности современной специфической диагностики ЦМВИ приобретает особую актуальность.

Трудности анте - и постнатальной диагностики ЦМВИ связаны с неоднозначностью возможной реализации инфекционного процесса из-за особенностей иммунной системы новорожденных и неспецифичностью клинических проявлений. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этой проблеме, устоявшихся канонов пренатальной диагностики ЦМВИ в мире не существует. Разработка четких и общепринятых рекомендаций по лабораторному обследованию недоношенных новорожденных с сочетанной перинатальной патологией с подозрением на ЦМВИ и в России остается нерешенной задачей. Высокая инфицированность недоношенных новорожденных детей ЦМВ ставит вопрос о своевременной диагностике ЦМВИ у беременных женщин и о вертикальной передаче вируса. В связи с этим тактика ведения беременных женщин с высоким риском инфицирования плода должна включать эффективную диагностику и своевременное начало лечения ЦМВИ.

На клеточном уровне цитопатический эффект ЦМВ проявляется в изменении морфологии клетки и ядра (увеличение размера, изменение формы), в образовании многоядерных клеток и в появлении внутриядерных включений [Mocarski et.al., 2001]. В связи с этим, исследования, направленные на анализ действия ЦМВ на клеточную пролиферацию, вызывают особый интерес. Так, группой авторов было показано, что ЦМВ стимулирует репликацию клеточной ДНК в зараженных клетках [Hume et.al., 2008; Kalejta et.al., 2003; McElroy et.al, 2000; Prichard et.al., 2008], описывалось существенное возрастание митотического индекса в инфицированной культуре [Sanchez et.al., 2003; Tran et.al., 2008; Wiebusch et.al., 2005]. Позже появились работы, опровергающие эти данные. Было показано, что вирус может блокировать прохождение клеточного цикла клетками в нескольких точках, включая переход из G₁ – периода в фазу синтеза ДНК [Lu and Shenk, 1999; Murphy et.al., 2000; Sinclar et.al., 2000] и переход из стадии G₂ в М, в точке, обозначаемой как G₂/М [Castillo et.al., 2005; Lu and Shenk, 1999; Sanchez et.al., 2006]. Таким образом, данные о влиянии ЦМВ на клеточную пролиферацию оказались противоречивыми и требовали дальнейшего исследования.

Фундаментальные данные о влиянии ЦМВ на клеточные структуры и жизненный цикл клетки необходимы для понимания процессов, приводящих к патологии при внутриутробном развитии детей и их гибели, а также для выбора адекватной терапевтической тактики новорожденных с ЦМВИ. Существующие на сегодняшний день единичные патентованные препараты, обладающие противовирусной активностью в отношении ЦМВ, не применяются у новорожденных и детей раннего возраста вследствие их высокой токсичности. Кроме того, эффективность лечения существующими препаратами снижена из-за развития лекарственной устойчивости, часто возникающей при длительном применении [Biron et.al., 2006; Chou et.al., 1999]. Поэтому поиск эффективных и нетоксичных анти-ЦМВ агентов, перспективных в качестве химиотерапевтических средств при ЦМВИ, остается важной проблемой. Все вышеизложенное в совокупности явилось обоснованием для проведения данного исследования.

Цель исследования.

Цель настоящей работы состояла в изучении маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей с сочетанной перинатальной патологией в течение первого года жизни и в материалах аутопсии; мониторинга метаболической и иммунной терапии; в изучении антивирусной активности аминокислотных производных фуллерена С₆₀; в исследовании действия ЦМВ жизненный цикл инфицированных клеток.

Для достижения поставленной цели ставились следующие задачи:

1. Выявить прямые (ДНК и инфекционная активность) и непрямые маркеры (специфические IgM, IgG и индекс авидности IgG антител) ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей и изучить динамику их выявления в течение первого года жизни.
   
2. Установить возможность выявления инфекционно - активного ЦМВ с помощью быстрого культурального метода (БКМ) в материалах аутопсии плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни.
   
3. Разработать метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках различных органов. Оценить эффективность использования четырех методов лабораторной диагностики при детекции ЦМВ в материалах аутопсии.
   
4. Установить частоту выявления ЦМВ у беременных из группы высокого риска по перинатальному инфицированию плода и новорожденного. Оценить эффективность использования метаболических препаратов в предгравидарной подготовке и во время беременности.
   
5. Оценить эффективность использования Виферона у беременных с ОАГА со второго триместра беременности и у недоношенных детей с клиническими проявлениями ВУИ.
   
6. Изучить цитотоксичность и антивирусную активность аминокислотных производных фуллерена С₆₀ (АПФ) на модели экспериментальной ЦМВИ in vitro. Сравнить эффективность указанных соединений при использовании лечебной, профилактической и вирулицидной схем воздействия. Оценить сочетанный эффект АПФ и Виферона и продукцию вируса под действием АПФ.
   
7. Изучить изменение пролиферативной активности в асинхронно - делящейся и синхронизированной культуре фибробластов легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ) под влиянием ЦМВ. Определить способность клеток ФЛЭЧ, инфицированных в разные периоды клеточного цикла, вступать в митоз.
   
8. Оценить развитие патологии митоза при инфицировании ЦМВ в присутствии ингибитора репликации вирусной ДНК и при инфицировании ЦМВ инактивированным УФ.
   

Научная новизна.

1. Впервые разработан и использован алгоритм комплексного обследования недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ вирусологическими методами (БКМ) и с помощью генодиагностики (ПЦР, ПЦР - real time) для выявления возбудителей герпесвирусных инфекций.
   
2. Впервые разработан метод ПЦР in situ для выявления ДНК ЦМВ на отпечатках и парафиновых срезах органов мертворожденных и детей, умерших на первом году жизни, который сочетает морфологический и молекулярный подходы и позволяет не только выявлять внутриклеточную вирусную ДНК в инфицированных клетках, но и оценить её сравнительное количество.
   
3. Впервые установлено, что в материалах аутопсии плодов (мертворожденных) и умерших новорожденных чаще определяется инфекционно активный ВПГ, а у детей, умерших на первом году жизни – инфекционно активный ЦМВ.
   
4. Впервые показана низкая цитотоксичность и высокая антивирусная активность аминокислотных производных фуллерена С₆₀ – натриевой соли аминокапроновой кислоты (С₆₀-Na-АКК) и натриевой соли аминомасляной кислоты (С₆₀-Na-АМК); химиотерапевтический индекс в различных схемах воздействия для С₆₀-Na-АКК равен 260-2600; для С₆₀-Na-АМК – 2500-5450.
   
5. Впервые установлено, что в клетках, инфицированных в S-фазе клеточного цикла, удлиняется период синтеза ДНК, при этом клетки сохраняют способность вступать в митотическое деление. Остановка деления происходит в метафазе митоза.
   
6. Впервые показано, что патология митоза развивается в одинаковой степени в клетках, инфицированных интактным вирусом, при подавлении репликации ДНК ЦМВ, а также при заражении ЦМВ, инактивированным УФ облучением.
   

Практическая значимость.

На основании полученных данных о распространенности цитомегаловирусного инфицирования среди недоношенных детей с сочетанной перинатальной патологией представлено обоснование для организации лабораторного скрининга в отделениях реанимации и интенсивной терапии.

Установлено, что для достоверной диагностики ЦМВИ у недоношенных новорожденных и детей раннего возраста необходимо использование БКМ и ПЦР для исследования различных биологических жидкостей (кровь и моча). Серологические методы диагностики у недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, рекомендованы для уточнения фазы течения инфекции. Показана эффективность определения авидности анти-ЦМВ.

Впервые при изучении динамики маркеров ЦМВИ у недоношенных новорожденных детей в течение первого года жизни доказана необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования недоношенных новорожденных с низкой и экстремально низкой массой тела до года.

У недоношенных детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, с клиническими признаками врожденной инфекции обосновано использование Виферона с первых дней жизни.

Применение Виферона у беременных со второго триместра беременности показало возможность более ранней антенатальной коррекции иммунопатологических состояний плода и отсутствие и/или снижение количества рецидивов ГВИ у беременных с ОАГА.

Предложен новый современный метод диагностики аутопсийного материала и плацент – ПЦР in situ, позволяющий оценить количество внутриклеточной ДНК и тканевую тропность, что особенно важно в изучении патогенеза ЦМВИ. Сравнительная оценка различных методов лабораторной диагностики при анализе структуры перинатальной патологии и смерти способствует совершенствованию организации лабораторно-клинического обеспечения мониторинга перинатальных потерь, этиологически связанных с герпесвирусами, а также повышению достоверности оценки их роли в перинатальной патологии и разработке на их основе адекватных лечебных и профилактических мер по снижению удельного веса ВУИ.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения.

Результаты работы стали основой ряда документов, применяющихся в практическом здравоохранении: Методические рекомендации «Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций», Роспотребнадзор. - №02.030-08. – Москва, 2008.

Методические рекомендации по использованию Виферона у недоношенных новорожденных с клиническими признаками ВУИ с первых дней жизни (2009, в печати).

Практические рекомендации используются в работе отделения реанимации и интенсивной терапии новорожденных ГБ №8 КЗ г. Москвы и ДКБ №13 им. Филатова г. Москвы.

Материалы диссертационной работы включены в курс лекций и практических занятий для студентов, клинических ординаторов и интернов кафедры клинической лабораторной диагностики РГМУ, кафедры неонатологии РГМУ, аспирантов и ординаторов НИИ педиатрии НЦЗД РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Маркеры ЦМВИ у недоношенных маловесных новорожденных с сочетанной врожденной патологией выявляются существенно чаще, чем у доношенных новорожденных. Недоношенные маловесные новорожденные являются группой риска по развитию ЦМВИ на первом году жизни, что диктует необходимость проведения неоднократного вирусологического обследования этих детей.
   
2. ПЦР in situ - информативный, точный и быстрый метод, открывающий новые возможности в диагностике герпесвирусных инфекций, позволяющий оценить относительное количество внутриклеточной ДНК и тропность вируса к определенным тканям при изучении отпечатков органов. Метод эффективен для диагностики и изучения патогенеза инфекций, вызываемых ЦМВ и ВПГ при фетоинфантильных потерях и летальных врожденных дефектах развития. Верификация инфекционных агентов при мертворождении, при выявлении врожденных пороков развития, несовместимых с жизнью, способствует адекватной терапии женщин с мертворождениями в анамнезе и прогнозированию исходов будущих беременностей.
   
3. Аминокислотные производные фуллерена С₆₀ эффективно подавляют экспрессию поздних структурных белков ЦМВ в зараженных клетках. Синергизм Виферона с АПФ дает основание для разработки принципиально новых схем комбинированной терапии ЦМВИ, позволяющих снизить терапевтические концентрации лекарственных соединений.
   
4. ЦМВ увеличивает длительность S – периода в инфицированных диплоидных фибробластах легкого эмбриона человека. Клетки, находящиеся в момент заражения в S – периоде клеточного цикла способны вступить в митоз, но необратимо блокируются в метафазе.
   
5. Для развития патологии митоза достаточно взаимодействия вирусной частицы с клеточной мембраной и/или проникновения вирусных белков в клетку. Синтез вирусной ДНК не является обязательным условием формирования патологических митозов.
   

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены в мат. 5 международной конференции «Русский журнал «ВИЧ/СПИД и родственные проблемы» (С.-Петербург, 2000), на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии (Glasgow, Шотландия, 2000); на Ежегодном конгрессе клинической вирусологии (Saariselka, Финляндия, 2008); на 11, 12, 13 Национальном конгрессе по болезням органов дыхания (Москва, 2001, 2002, 2003); на 3 Российском научном форуме “Актуальные проблемы акушерства, гинекологии и перинатологии” (Москва, 2001), на 3 Международной конференции “Разработка и производство диагностических сухих питательных сред и микротест-систем” (Махачкала, 2001), на 5 Международной конференции “Фуллерены и атомные кластеры” (С.-Петербург, 2002), на 8 Съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), на Международной конференции “Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины” (Москва, 2002), на Российском конгрессе “Генитальные инфекции и патология шейки матки” (Москва, 2004), на 3, 4 Конгрессе педиатров-инфекционистов “Актуальные вопросы инфекционной патологии у детей” (Москва, 2004, 2005), на 8 Российском Форуме “Мать и дитя” (Москва, 2005), на 10, 11, 13 Конгрессе педиатров России “Актуальные проблемы педиатрии” (Москва, 2006, 2007, 2009), на Международном конгрессе «Новые технологии в медицине и экспериментальной биологии» (Pattaya-Bangkok, Тайланд, 2007), на VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в ХХI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), на VI Конгрессе детских инфекционистов России “Актуальные вопросы инфекционной патологии и вакцинопрофилактики” (Москва, 2007), на III Ежегодном конгрессе и VI Cъезде Российской ассоциации специалистов перинатальной медицины «Современная перинаталогия: организация, технология и качество» (Москва, 2008).

В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании Отдела прикладной вирусологии и иммунологии, Отдела молекулярной вирусологии и лаборатории биохимии института экспериментальной ветеринарии и Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ Учреждения РАМН НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН от 24 сентября 2009 года.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 65 научных работ, в том числе 23 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, статей за рубежом – 1, в сборниках международных конгрессов за рубежом – 3, в сборниках материалов международных конгрессов и форумов – 38.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 6-ти глав с изложением результатов собственных исследований, их обсуждения и выводов. Работа изложена на 273 страницах текста, иллюстрирована 29 таблицами и сколько 38 рисунками. Список цитированной литературы включает 124 отечественных и 325 иностранных источников.

Степень личного участия автора: разработка дизайна исследования беременных женщин, недоношенных новорожденных и материала аутопсии, изучение влияния ЦМВ на пролиферативную активность клеток и антивирусной активности АПФ, организация работы на всех этапах от определения возбудителей ВУИ различными методами до систематизации и анализа, а также статистическая обработка результатов проведены лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Культура клеток. В работе использовали диплоидные фибробласты легкого эмбриона человека (ФЛЭЧ), полученные из лаборатории клеточных культур НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН и из Медико-генетического научного центра РАМН (Москва). Культуру клеток выращивали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2мМ L-глутамина, 50мкг/мл гентамицина.

Вирус. Использовали референс штамм ЦМВ человека AD 169, любезно предоставленный доктором D. Emanuel (США). Вирус поддерживали путем пассирования на культуре клеток ФЛЭЧ. Определение инфекционной активности вируса проводили модифицированным методом «черных» бляшек. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса. Очаги инфицированных клеток (бляшек) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием смеси моноклональных антител (МКА) к белкам IEp72 и рр65. Окрашенные бляшки идентифицировали и подсчитывали с помощью светового микроскопа. Титр вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл).

Пациенты. Объектами исследования были женщины репродуктивного возраста, беременные и новорожденные дети, а также материалы аутопсии различных органов плодов, умерших новорожденных и детей, умерших на первом году жизни. Объем исследований характеризуют данные таблицы 1. Для обследования пациентов использовали комплекс лабораторных методов: ПЦР (HCMV, HSV, Chlam.trach., Myc. gen.,Ureapl., HPV 16/18, Neis.gon., Trich.vag.); ПЦР real time (HCMV); ПЦР in situ (HCMV; HSV); БКМ (HCMV); РИФ (HCMV, HSV, enterovirus - Коксаки А, Коксаки В 6, 68-71 серотипов, краснуха, вирусы гриппа, парагриппозные вирусы 1-3 серотипов, аденовирусы, Myc. pneum., RSV, Chlam. Pneum.); ИФА; микробиологический посев флоры, патологоанатомические исследования органов и плацент и анализ анамнестических данных матерей умерших детей.

Таблица 1.

Группы	Количество обследованных	Количество анализов
Скрининговое обследование беременных и небеременных женщин в РИФ с поиском широкого спектра вирусных антигенов	n=3796	n=18675
Исследование материала аутопсии плодов и умерших новорожденных в РИФ с поиском широкого спектра вирусных антигенов	n=650	n=9750
Исследование плацент	n=181	n=665
Мониторинг включения метаболической терапии (n=260) и Виферона (n=74) в комплексное лечение беременных и небеременных женщин с ОАГА	n=260 n=74	n=5980 n=1314
Комплексное обследование доношенных и недоношенных новорожденных детей (n=204), в динамике до года (n=174)	n=204	n=2850
Исследование материала аутопсии плодов и детей, умерших на первом году жизни на ГВИ	n=135	n=1764