Новые биомаркеры среднелетучие метаболиты в конденсате выдыхаемого воздуха при бронхиальной астме и хронической обструктивной болезни легких 14. 01. 25 пульмонология

Вид материала

Содержание

Научный руководитель
Белобородова Наталья Владимировна
Общая характеристика работы
Цель исследования
Научная новизна
Практическая значимость
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
Связь работы с научными программами
Внедрение в практику здравоохранения
Апробация работы
Публикации по теме диссертации
Объем и структура диссертации
Материал и методы исследования
Методы исследования.
Оценку клинических симптомов при БА
Оценку клинических симптомов при ХОБЛ
Количественную оценку одышки
Исследование функции внешнего дыхания
Транскутанное измерение насыщения гемоглобина артериальной крови
Неинвазивную оценку гемодинамики
...
Полное содержание

Подобный материал:

1 2 3

На правах рукописи

Анохина Татьяна Николаевна

НОВЫЕ БИОМАРКЕРЫ – СРЕДНЕЛЕТУЧИЕ МЕТАБОЛИТЫ В КОНДЕНСАТЕ ВЫДЫХАЕМОГО ВОЗДУХА ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ И ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНИ ЛЕГКИХ

14.01.25 – пульмонология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно-исследовательский институт пульмонологии» Федерального медико-биологического агентства России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Анаев Эльдар Хусеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Баранова Ирина Александровна

доктор медицинских наук, профессор Белобородова Наталья Владимировна

Ведущая организация: ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздравсоцразвития России

Защита состоится « 07 » марта 2012 г. в 13:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.053.01 при ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д. 32)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (105077, г. Москва, ул. 11-я Парковая, д. 32)

Автореферат разослан « 01 » февраля 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук Анаев Эльдар Хусеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Бронхиальная астма (БА) и хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) относятся к социально значимым заболеваниям, распространенность которых неуклонно растет [Чучалин А.Г., 2007]. Согласно прогнозу ВОЗ, до 2020 года ожидается дальнейший рост числа больных БА и ХОБЛ [Murray C.J., 1996; Чучалин А.Г., 2004], что обусловлено высокой распространенностью табакокурения [GATS, 2009], загрязнением окружающей среды [Боев В.М., 1999; Delfino R.J., 2002] и повторяющимися инфекциями респираторного тракта [Rubin B.K. et al., 2011].

Многие ученые справедливо предполагают, что имеющиеся официальные статистические данные не отражают истинной распространенности БА и ХОБЛ, которая в действительности значительно выше. По всей видимости, это обусловлено недостаточным выявлением БА и ХОБЛ среди населения. Гиподиагностика БА и ХОБЛ является международной проблемой [Черняк Б.А., 2008; Patel S.P., 2008; Hill K. et al., 2010].

Не менее актуальной является проблема дифференциальной диагностики БА и ХОБЛ. В соответствии с международными консенсусами диагноз БА и ХОБЛ основан на наличии характерных симптомов и изменении функции внешнего дыхания [Rabe K.F. et al., 2007; Bateman E.D. et al., 2008]. Однако сходные клинические проявления могут быть отмечены при обоих заболеваниях [Guerra S., 2005; Decramer M. et al., 2005], а обратимая бронхиальная обструкция определяется не только у пациентов с БА, но и у больных ХОБЛ [Fabbri L.M. et al., 2003; Richter D.C. et al., 2008]. Дифференциальная диагностика БА и ХОБЛ чрезвычайно важна из-за различий в показателях заболеваемости и смертности, в клиническом исходе, подходах к терапии. Традиционные методы обследования не всегда позволяют отличить пациентов с БА и ХОБЛ. Особенно диагностика затруднена в период обострения заболевания, когда проведение провокационных тестов противопоказано.

Большие надежды в медицинской диагностике различных заболеваний связывают с анализом уже известных и поиском новых биомаркеров. К биомаркерам относятся биологические молекулы, которые содержатся в различных биологических жидкостях (кровь, моча, цереброспинальная жидкость и др.), в тканях и являются признаком нормального или патологического процесса в организме. Новыми и интенсивно развивающими направлениями современной науки являются постгеномные технологии: геномика, протеомика, транскриптомика, метаболомика [Nicholson J.K., 2006; Вельков В.В., 2007]. Метаболомика имеет преимущества перед другими технологиями в отношении медицинской диагностики, выявлении биомаркеров заболеваний, так как профиль метаболитов является наиболее информативной характеристикой фенотипа и отражает физиологические и патофизиологические процессы, протекающие в организме, инициируемые как внутренними, так и внешними факторами [Beecher C.W.W., 2003; Dettmer K., 2007].

Идеальным биологическим образцом для анализа метаболизма в легких может служить конденсат выдыхаемого воздуха (КВВ). Известно, что КВВ отражает состав жидкости, покрывающей нижние дыхательные пути, которая содержит как летучие, так и нелетучие вещества [Анаев Э.Х., Чучалин А.Г., 2002]. Анализ КВВ позволяет получать углубленные представления о состоянии метаболических процессов в нижних отделах респираторного тракта и их роли в патогенезе легочных заболеваний [Хасина М.А. и соавт., 2008]. Сбор КВВ не оказывает влияния на состав получаемого образца и функцию легких, с легкостью воспроизводим у детей и пациентов с тяжелой ДН [Horvath I. et al., 2005; Borrill Z.L. et al., 2008]. Низкие концентрации веществ в КВВ долгое время ограничивали применение этого метода в медицинской практике. Прогресс масс-спектрометрической техники позволил определять сотни тысяч различных химических соединений в КВВ в ультранизких концентрациях [Moser B. et al., 2005].

Разные механизмы воспалительного процесса при БА и ХОБЛ приводят к продукции различных метаболитов, которые могут быть определены в выдыхаемом воздухе и КВВ методами аналитической химии. Это создает предпосылки для использования этих методов в диагностике и поиске новых биомаркеров обструктивных заболеваний. Предполагают, что анализ среднелетучих органических соединений (СлОС), сконцентрированных в КВВ, может лучше отражать состав эндогенных выдыхаемых органических соединений по сравнению с анализом выдыхаемого воздуха [Родионов А.А. и соавт., 2007].

Цель исследования:

Исследовать возможность применения анализа среднелетучих метаболитов в КВВ для диагностики БА и ХОБЛ.

Задачи исследования:

Определить среднелетучие метаболиты, содержащиеся в КВВ, и сравнить их состав и содержание у здоровых добровольцев, больных БА и ХОБЛ.
Изучить взаимосвязи различных среднелетучих метаболитов в КВВ с клиническими и функциональными показателями у больных БА и ХОБЛ.
Выявить среднелетучие метаболиты в КВВ, которые могут быть потенциальными биомаркерами БА и ХОБЛ.
Оценить возможность применения анализа профилей среднелетучих метаболитов в КВВ для диагностики БА и ХОБЛ.

Научная новизна

В представленной работе впервые:

- В КВВ здоровых добровольцев, больных БА и ХОБЛ обнаружены в ультранизкой концентрации 0.1-10 ppb экзогенные и эндогенные среднелетучие метаболиты, относящие к различным классам органических химических соединений: насыщенные жирные кислоты (НЖК), эфиры, спирты, кетоны, фенолы, углеводороды.

- Выявлены изменения содержания среднелетучих метаболитов в КВВ при обструктивной патологии легких: снижение содержания пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты в КВВ при БА и повышение содержания хинолина в КВВ при ХОБЛ по сравнению со здоровыми добровольцами.

- Выявлены различия качественного и количественного состава среднелетучих метаболитов в КВВ при патологии легких: при БА по сравнению с ХОБЛ снижено содержание тексанола, чаще встречается ундециловая кислота, 2-феноксиэтанол и реже - деканол.

- Установлено, что у больных ХОБЛ экспрессия НЖК в КВВ коррелирует с клиническими симптомами (суммарным баллом шкалы симптомов по Paggiaro P.L., 1998; одышкой по шкале MRC), физикальными данными (ЧДД, ЧСС), показателями газообмена (рСО₂, НСО₃^- артериальной крови), СДЛА и имеет обратную взаимосвязь с SpO₂, ФЖЕЛ.

- Выявлено, что у больных БА экспрессия НЖК в КВВ обратно взаимосвязана с показателями ФВД (ОФВ₁, ФЖЕЛ и индексом Тиффно).

- Установлено, что распознавание здоровых, больных БА и ХОБЛ по профилю среднелетучих метаболитов в КВВ возможно с точностью 75-83%.

- Выявлены среднелетучие метаболиты (инданон, деканол, этил цитрат, 2-феноксиэтанол, S2, S3, S5, S7, S9), которые являются потенциальными биомаркерами БА и ХОБЛ.

- Разработан математический метод дифференциальной диагностики БА и ХОБЛ, основанный на анализе профилей среднелетучих метаболитов в КВВ.

Практическая значимость

Исследование профиля среднелетучих метаболитов в КВВ - неинвазивный метод оценки состояния метаболических процессов в дыхательных путях в норме и при патологии легких.

Использование среднелетучих метаболитов в КВВ в качестве вспомогательных диагностических критериев БА и ХОБЛ позволит более точно проводить диагностику этих заболеваний и своевременно назначить патогенетическую терапию.

Полученные данные о взаимосвязи содержания среднелетучих метаболитов в КВВ с показателями ФВД можно использовать для оценки нарушений вентиляционной функции легких у пациентов, которые не могут выполнить форсированные дыхательные маневры.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

Патологический процесс в дыхательных путях при БА и ХОБЛ сопровождается изменением в КВВ состава и содержания среднелетучих метаболитов, которые можно отнести к новым биомаркерам этих заболеваний.
Экспрессия среднелетучих метаболитов в КВВ связана с клиническими симптомами и функциональными показателями у больных БА и ХОБЛ.
Анализ профилей среднелетучих метаболитов в КВВ и использование линейных методов теории распознавания образов позволяют проводить дифференциальную диагностику БА и ХОБЛ.

Связь работы с научными программами

Исследование выполнено в соответствии с планом научно-исследовательской работы ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России (номер государственной регистрации темы 01201168288).

Внедрение в практику здравоохранения

Исследование профилей среднелетучих метаболитов в КВВ внедрено в качестве дополнительного метода диагностики БА и ХОБЛ в пульмонологическом и аллергологическом отделениях ГБУЗ «ГКБ № 57 ДЗМ» г. Москвы. Материалы исследования включены в лекционный курс кафедры пульмонологии ФУВ ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития (бывший РГМУ).

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы, материалы исследования были представлены и всесторонне обсуждены на:

- XVII, XIX Национальных конгрессах по болезням органов дыхания (Казань, 2007; Москва, 2009), работа была удостоена первого места на конкурсе «Молодых ученых» (Москва, 2009);

- XVIII, XIX, XX, XXI ежегодных конгрессах Европейского респираторного общества (Берлин, 2008; Вена, 2009; Барселона, 2010; Амстердам, 2011);

- 51-м конгрессе Германского общества пульмонологов (Ганновер, 2010);

- I, II, III Научно-практической конференции «Актуальные вопросы респираторной медицины» (Москва, 2009-2011);

- совместной научной конференции ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России и МГУ имени М.В. Ломоносова (Москва, 2010);

- совместном заседании Ученого совета ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России и кафедры госпитальной терапии педиатрического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития (Москва, январь 2012).

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста. Состоит из введения, глав обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Иллюстрирована 10 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель включает 27 отечественных и 158 зарубежных источников. Диссертация изложена на русском языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования.

В одномоментном поперечном исследовании приняли участие 70 человек в возрасте 19-75 лет, в том числе 20 больных с БА, 20 – с ХОБЛ и 30 здоровых добровольцев.

Критерии включения:

больные обоего пола в возрасте от 18 до 75 лет;
подтвержденный диагноз БА [в соответствии с критериями GINA, 2007];
подтвержденный диагноз ХОБЛ II и III стадии [критерии GOLD, 2008];
длительность заболевания более 5 лет;
наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании.

Критерии исключения:

туберкулез и другие заболевания легких, кроме БА и ХОБЛ;
хронические инфекционные заболевания верхних дыхательных путей (гаймориты и другие);
сочетание БА и ХОБЛ;
тяжелые сопутствующие заболевания сердечно-сосудистой системы, органов пищеварения, мочеполовой и нервной системы;
постоянный прием системных глюкокортикостероидов;
злоупотребление алкоголем, прием наркотиков;
беременность и кормление грудью;
отказ от участия в исследовании.

Больные БА и ХОБЛ находились на стационарном лечении в аллергологическом и пульмонологическом отделениях городской клинической больницы №57 г. Москвы в связи с обострением заболевания, а также наблюдались амбулаторно в ФГУ «НИИ пульмонологии» ФМБА России.

Все пациенты с БА имели анамнестически сенсибилизацию к бытовым, эпидермальным и пыльцевым аллергенам. Больные БА амбулаторно получали базисную терапию (ингаляционные ГКС, бета2-симпатомиметики длительного действия) и бронхолитики короткого действия в режиме по потребности.

Пациенты с ХОБЛ на амбулаторном этапе получали базисную терапию (М-холинолитики и бета2-симпатомиметики длительного действия), бронхолитики короткого действия в режиме по потребности. 11 больных ХОБЛ (55%) получали ингаляционные ГКС (в составе комбинированного препарата) в средних и высоких дозах.

Группу сравнения составили 30 здоровых некурящих добровольца (13 мужчин и 17 женщин) в возрасте от 19 до 63 лет (средний возраст 25,49,6 лет) с нормальными показателями функции легких, у которых в анамнезе отсутствовали указания на атопию, хронические заболевания легких и острые респираторные симптомы в течение последних 2-х месяцев.

Методы исследования.

Общеклиническое обследование включало в себя изучение жалоб, анамнеза жизни и заболевания, оценку физикальных данных, методы лабораторного и инструментального
обследования (общий и биохимический анализы крови, общий анализ мочи, общий анализ мокроты, ЭКГ, рентгенографию органов грудной клетки).

Оценку клинических симптомов при БА (кашель, мокрота, одышка, хрипы) проводили однократно по 4-х балльной шкале (0 – отсутствие симптома, 3 – максимальное проявление симптома). Также оценивали число приступов удушья и потребность в симпатомиметиках короткого действия.

Оценку контроля БА проводили с использованием «АСТ-теста» (Asthma Control Test), включающего 5 вопросов, ответы на которые представлены в виде пятибалльной оценочной шкалы. Результатом теста является сумма ответов в баллах, значение теста менее 20 баллов соответствует неконтролируемому течению БА.

Оценку клинических симптомов при ХОБЛ проводили с помощью модифицированной шкалы симптомов больных ХОБЛ (Paggiaro P.L., 1998), основанной на взвешенной балльной оценке одышки, кашля, продукции мокроты и цвета мокроты.

Количественную оценку одышки у больных БА и ХОБЛ проводили по шкале Medical Research Council Dyspnea Scale (MRС), в которой 0 баллов – одышка не беспокоит, за исключением очень интенсивной нагрузки; 4 балла – одышка при минимальной физической активности [Mahler et al., 1985].

Исследование функции внешнего дыхания (ФВД) проводили с помощью прибора Master Screen Spiro фирмы «Erich JAEGER» (Германия) в соответствии с рекомендациями Европейского респираторного общества (ERS). Определяли общепринятые показатели легочной вентиляции, статические и динамические объемы. Оценивали объем форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ₁), форсированную жизненную емкость легких (ФЖЕЛ), ОФВ₁/ФЖЕЛ (модифицированный индекс Тиффно), прирост ОФВ₁ на ингаляцию 400 мкг сальбутамола. Полученные результаты сопоставляли с должными величинами, вычисленными по формулам, предложенным консенсусом ERS и ATS [Miller M.R. et al., 2005], а их интерпретацию осуществляли с использованием методических рекомендаций [Чучалин А.Г., 2009]. Пиковую скорость выдоха (ПСВ) оценивали пикфлоуметром Personal Best (Respironics, США).

Транскутанное измерение насыщения гемоглобина артериальной крови проводили при помощи портативного пульсоксиметра Onyx 9500 (Nonin Medical Inc., США).

Газовый анализ артериальной крови проводили экспресс-методом на автоматическом анализаторе Bayer Rapid (Bayer, Германия). Забор крови осуществлялся путем пункции лучевой артерии гепаринизированным шприцем. Определялись следующие показатели: pH, pO₂, pCO₂, HCO₃^-.

Неинвазивную оценку гемодинамики проводили методом допплер-эхокардиографии на ультразвуковом анализаторе Logic-S6 (General Electric, США). Оценивалось систолическое давление (СДЛА) в a. pulmonalis в мм рт.ст.

Сбор КВВ.

КВВ всем обследуемым собирали однократно, пациентам с БА и ХОБЛ - в первый-второй день поступления в стационар. Для сбора КВВ использовали аппарат EcoScreen (Erich JAEGER, Германия), снабженный клапанной системой, которая позволяет осуществлять вдох из окружающей атмосферы, а выдох – в устройство с конденсатором паров выдыхаемого воздуха, то есть клапан не позволяет смешиваться вдыхаемому и выдыхаемому воздуху. Метод основывается на так называемом принципе противотока. Вещества охлаждаются приблизительно до -10 °С.

Сбор КВВ проводили в утренние часы после двукратного ополаскивания ротовой полости водой. КВВ собирали в течение 10 минут в сидячем положении при спокойном дыхании обследуемого. Для исключения носового дыхания использовали специальные зажимы для носа. С целью стандартизации сбора КВВ применяли прибор EсоVent (Erich JAЕGER, Германия), который позволяет контролировать такие показатели, как время, объем выдыхаемого воздуха, частоту дыхания, пиковую скорость выдоха, минутную вентиляцию, жизненную емкость легких во время процедуры. Измеряли объем собранного конденсата и немедленно помещали его в герметичные сухие термоустойчивые ДНК- и РНК-очищенные стерильные полипропиленовые одноразовые пробирки типа Эппендорф (Scientific Specialties Inc., США) объемом 1,7 мл. Пробирки с материалом немедленно замораживались в морозильнике при температуре -70 ºС. Собранные образцы хранились при данной температуре до проведения анализов сроком не более 1 месяца.

Измерение pH КВВ.

Уровень рН КВВ измеряли немедленно после получения образца с помощью ф32 рН-метра (Beckman, США) со стеклянным микроэлектродом. Для анализа требовалось 0,3 мл КВВ. Предварительно калибровали прибор стандартными растворами с рН 4,00; 7,00 и 10,00. Измерение рН каждого образца КВВ проводили четырехкратно. Из полученных значений вычисляли среднюю величину рН образца КВВ.

Определение среднелетучих органических соединений (метаболитов) в КВВ.

Определение профилей СлОС в КВВ у обследуемых проводили в лаборатории концентрирования кафедры аналитической химии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (руководитель группы хромато-масс-спектрометрии – д.х.н., профессор И.А. Ревельский).

С этой целью был разработан способ определения СлОС различной полярности на ультраследовом уровне в КВВ. Данный метод основан на жидкостной экстракции определяемых веществ, их сорбционном концентрировании вне аналитической системы из экстракта объёмом 100 мкл, термодесорбции и анализе концентрата методом газовой хроматографии – масс-спектрометрии (ГХ-МС). Схема определения СлОС в КВВ представлена на (рис. 1).

Образцы КВВ насыщали хлоридом натрия, затем проводили экстракцию с использованием органического растворителя (метилтретбутиловый эфир). Концентрирование части экстракта объемом 100 мкл проводили на сорбенте Tenax GC (2 мг) и сверхтонком кварцевом волокне (около 1 мг). Сорбент располагался в кварцевом лайнере, через который пропускали поток азота со скоростью 100 мл/мин и подавали экстракт со скоростью 25 мкл/мин. Перенос концентрата аналитов с сорбента в инжектор хроматографа проводили путем термодесорбции при 300 °С в течение 3 мин в потоке гелия. Разделение проводили на хроматографе Trace GC ultra (Thermo Electron corp.), детектирование – на масс-спектрометре Trace DSQ (Thermo Electron corp.). Для разделения использовали среднеполярную капиллярную колонку RTX-200MS (Restek corp.) длиной 30 м, диаметром 0.32 мм, с неподвижной фазой толщиной 0.25 мкм на основе трифторпропилметилполисилоксана. Температура инжектора хроматографа составляла 250 °С. Выдерживали температуру колонки на уровне 35 °С в течение 5 мин, затем термостат хроматографа нагревали от 35 °С до 250 °С со скоростью 5°/мин. Газ носитель – гелий. Сканирование проводили в диапазоне масс от 35 до 350 а.е.м. в режиме электронной ионизации. Идентификацию СлОС в КВВ проводили путем сравнения с масс-спектрами веществ из библиотеки NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library 2005.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 for Windows (StatSoft, Inc., США). Признаки, имеющие нормальное распределение, представлены как М±SD, где М – среднее арифметическое, SD  стандартное отклонение. При установлении непараметрического распределения признаков, данные представлены как Me (25%-75%), где Ме – медиана, 25%-75% - интерквартильный размах (значения 25-го и 75-го процентилей, соответственно). Достоверность различий одноименных показателей между двумя независимыми группами определяли при помощи t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Манна-Уитни и Колмогорова-Смирнова. Различия считались статистически достоверными при p<0,05. Анализ связи признаков проводили с помощью ранговой корреляции по Спирмену.

Математическую обработку массива полученных данных по СлОС в КВВ проводили на кафедре математической теории интеллектуальных систем механико-математического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (руководитель – зав. кафедрой, академик РАЕН, д.ф.-м.н., профессор В.Б. Кудрявцев) с использованием специально разработанного алгоритма, основанного на линейных методах теории распознавания образов.

Blog

Содержание