Ветеринарно санитарная экспертиза экспортного мяса монголии и установление его видовой принадлежности на основе ДНК диагностики 06.

Вид материалаАвтореферат

Содержание


3.5 Изучение вида и происхождение мяса методом анализа ДНК
3.5.1 Данные ПЦР-ПДРФ
3.5.2 Результаты исследовании на установлению последовательности нуклеотидов основанных на гене MC1R
Лошадь КРС Верблюдь Овца
M – Маркер молекула ДНК со 100 парными основами
5. Рекомендации по использованию научных выводов
6.Сведения о практическом использовании научных результатов
7.Список работ, опубликованных по теме
Подобный материал:
1   2   3

3.4 Итоги исследований менежмента ветеринарно - санитарных требований и пищевой безопасности на предприятиях мясной промышленности Монголии


Контрольная система НАССР называется по - английски как “Hazard Analysis and Critical Control Points”, а по-русски как “Анализ рисков и критические контрольные точки”. В данное время традиционные методы производства не отвечают предъявляемым требованиям. С учетом этого для практической ее реализации в условиях Монголии требуется детальное изучение структуры данной системы. Ниже мы приводим некоторые ее историко-информационные данные. По нашим данным, система НАССР, успешно применяемая в развитых странах и имеет шансы для внедрения ее в Монголии, на что и была направлена наша работа.

Необходимо отметить,что система HACCP действует лишь на хорошо организованном производстве при строгом соблюдении предусмотренных технологических операций. С этой целью предприятия должны иметь предварительную программу и обеспечивать подходящие условия (GMP). Такие предприятия должны обеспечивать безопасность продовольствия, иметь помещения, техническое оснащение, водоснабжение, систему отвода отходов, менежмент по очистке мусора, уровень знаний рабочих и другие самые необходимые первичные условия. В предварительную программу должны быть включены такие вопросы как санитария и гигиена, система кодирования и контроля конечного продукта. Исследованные нами 5 предприятий частично отвечают данным требованиям.


Нами проведены совместно с руководством предприятий организационные и специальные мероприятия по овладению навыками санитарии и производства в соответствии требованиями норм GMP, GHP к помещениям, техоборудованию, освещению, вентиляции, водо- и электроснабжению, оборудованию по удалению (утилизации) отходов. Приведено соответствие лабораторий ВСЭ по контролю конечных продуктов и аттестация специалистов по санитарии и технологии производства.

Из 10 исследованных мясокомбинатов вышеуказанные требования были полностью выполнены только на “Мах маркет”, на других предприятиях система HACCP выполняется на 67-89%.

Таким образом, мясокомбинат "Мах маркет" и компания "Жаст-Агро" выполняют разработанные нами технико-экономические рекомендации, систему менежмента и политику безопасности. Они стали учреждениями, которые осуществляют систему НАССР в 2011-2012 гг.. Проведена работа по внедрению и практическому использованию системы контроля риска на критических точках (система НАССР) также на 3 ведущих боенских и мясоперерабатывающих предприятиях Монголии - “Мах импекс”. “Дархан Мах Экспо”, ”Эрдэнэт прогресс” и на мясокомбинате Горно-обогатительного комбината. На них система НАССР внедрена не полностью (до 80% соответствия).


3.5 Изучение вида и происхождение мяса методом анализа ДНК

L 1 2 3 4 5 6 7 8 9


Рис. 6 а
Продукт ПЦР 12S гена из сырого мяса. L, маркер ДНК из 100 нп, 1. лошадь,
2. крс, 3. овцы, 4. козы, 5. верблюд, 6. собака, 7. волк

, 8.ñâèíüÿ, 9. êóðû


Данные полимеразной цепной реакции

При ампликации ДНК от сырого мяса лошадей, крупного рогатого скота, овец, коз, верблюдов, собак, волка, свиней и кур используя праймера МТ 12s в мясе у всех видов животных обнаружен гены 12S рРНК (Рис. 6а). Кроме того в варенном мясе указанных видов животных выделена ДНК и при ампликации ее ПЦР получены аналогичные положительные результаты

1 2 3 4 5 6 7 8 9 L

Рис. 6 б.
Продукт ПЦР 12S гена из варенного мяса.

1. лошадь, 2. КРС, 3. овцы, 4. коз, 5. верблюд, 6. собака, 7. волк, 8. свинья, 9. куры L, маркер ДНК из

100 нп


(Рис. 6 б).

При ампликации ДНК варенного мяса лошадей, крупного рогатого скота, овец, коз, верблюдов, собак, волка, свиней и кур используя праймера МС1R и TYR P1 в мясе у всех видов животных обнаружен ген МС1R (Рис. 12 A и D). При ампликации ген TYR P1 в мясе крупного рогатого скота и свиней получены положительные результаты, а в мясе волка, собак и лошадей - отрицательные (Рис. 7 С). При ампликации гены TYR P1(395 bp) и MC1R (700 bp) путьем мультиплекс ПЦР в мясе крупного рогатого скота и свиней получены положительные результаты, а в мясе собак и лошадей былы положительные к MC1R и отрицательные к TYR P1 (Рис.7 В).

A B C D

M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 12 M 13 14 15 16 17 M 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Рис. 7. (A) результаты ампликации MC1R гена (700bp). M-Маркер 200 bp ДНК; 1-4. - КРС, свинья, собака, конины позитив MC1R гена. (B) Multiplex ПЦР ампликации TYR P1 (395 bp) и MC1R гена (700 bp). 5,6.-говядина и свинина позитив TYR P1 ба MC1R; 7,8.-позитив варенние мясо собака и конина MC1R, 9.-Негатив мясо волки,10-12-MC1R позитив варенние говядина, мясо коза,баранина; (C) ампликация TYR P1 гена; 13,14- TYR P1 позитив варенного говядина и свинина; 15-17- негатив TYR P1 гена мясо собака, волка и конина; (D) ампликации MC1R гена; 18-27- MC1R позитив говядина, свинина, конина, мясо собака, мясо волки, баранина, мясо коза

Рис. 7. A, B, C и D. ПЦР продукты генов MC1R и TYR P

3.5.1 Данные ПЦР-ПДРФ

Из конины получены по AluI фрагменты с парными основами 399, 352, 132, 96, 97, 17 по HinfI фрагменты с парными основами 754, 157, 126, 56, по DdeI фрагменты с парными основами 1077, 16 По анализу RFLP конины после разрыва AluI получены фрагменты с парными основами 399, 352, 132, 97, по HinfI фрагменты с парными основами 754, 157, 126 по DdeI фрагменты с пятнами парными основами 1077 (Pис. 8, столб 1; Pис.9, столб 1; Pис. 10, столб 1)

L1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 L2

L1. L, маркер ДНК из 100 нп, 1. лошадь, 2. крс, 3. овцы, 4. козы, 5. верблюд, 6. собака, 7. волк,  8.свинья,  9. куры L2., маркер ДНК из 50 нп.


Рис 9.Данные ПЦР-ПДРФ приеняемый HinfI рестриктазы в мясе 9 видов жывотных


L1. L, маркер ДНК из 100 нп, 1. лошадь2. крс, 3. овцы, 4. козы, 5. верблюд, 6. собака, 7. волк, 8.свинья, 9. куры L2., маркер ДНК из 50 нп.


L1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 L2

Рис.8. Данные ПЦР-ПДРФ приеняемый Alul рестриктазы в мясе 9 видов жывотных


Из говядины были получены фрагменты с парными основами, в частности по AluI 560, 346, 122, 31,39,17 по Hinfl фрагметы 726, 196, 125, 35, по Ddel фрагменты 622, 303, 103, 40, 16.

По анализу RFLP говядины после разрева энзимой AluI получены фрагменты с парнимы оснавами основами 346, 196, по HinfI фрагменты с размерами парных основ 951, 126, по DdeI пятна фрагментов с размерами парных основ 522, 303, 103 (Pис. 8, столб 2; Pис. 9, столб 2, Pис.10 10, столб 2).

L1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 L2

Рис. 10. Данные ПЦР-ПДРФ приеняемый DdeI рестриктазы в мясе 9 видов жывотных

L1. L, маркер ДНК из 100 нп, 1. лошадь, 2. крс, 3. овцы, 4. козы, 5. верблюд, 6. собака, 7. волк 8.свинья, 9. куры L2. , маркер ДНК из 50 нп

Из баранины нами получены фрагменты с парными основами по AluI 757, 161, 31, 18, 17 по HinfI фрагменты 690, 506, 455, 126; по DdeI фрагменты 747, 323, 16 (Tаблица 21). По анализу RFLP после разрыва ферментами получены: по AluI фрагменты с парными основами 530, 347, 161; 690, 506, 126; по DdeI фрагменты с пятнами парных основ 747, 323 (Pис. 8, столб 3; Pис. 9, столб 3; Pис. 10, столб 3)

Из козьего мяса - по AluI фрагменты с парными основами 530, 347, 96, 65, 31, 17; по HinfI фрагменты 967, 125 с парными основами по DdeI фрагменты 1086 с парными основами (Tаблица 21.1). По данным анализа RFLP после разрыва энзимой AluI получены фрагменты с парными основами 530, 347, 161, по HinfI фрагменты 951, 126 с парными основаными, по DdeI пятна фрагментов с парными основами Ү1086 (Pис. 8, столб 3; Pис. 9, столб 3; Pис. 10, столб 3).

Из верблюжьего мяса получены следующие фрагменты с парными основами: по AluI 397, 347, 130, 95 по по HinfI 1080 по DdeI 655, 269, 140, 16 (Tаблица 21). По анализу RFLP после разрыва энзимами получены следующие фрагменты с парными основами по AluI 530, 347, 161, по HinfI 1080 по DdeI с пятнами парных основ 655, 262, 140 (Pис. 8, столб 4; Pис. 9, столб 5; Pис. 10, столб 5).

Из мяса собаки и волка после разрыв энзимой AluI получены фрагменты с парными основами 398, 293, 132, 97, 95, 14 после HinfI 845, 125, 122 вр по DdeI 655, 958 101, 16 вр. По данными анализа мяса собаки и волка по RFLP получены следующие фрагменты: по AluI фермента 398, 293, 132, 97 с парными основами по HinfI 845, 125 с размерами пархных основ, по DdeI пятна фрагментов с парными основами 958, 101 (Pис. 8, столб 6, 7; Pис. 9, столб 6, 7; Pис. 10, столб 6, 7)

Из свинины по AluI получены фрагменты с парными основами 524, 351, 191, 17 по HinfI фрагмент 1083 вр, по Ddel 1067, 16 с парными основами (таблица 21). По анализу RFLP после разрыва энзимой по AluI получены фрагменты 524, 351, 191 с парными основами по HinfI 1067 с парной основой по Ddel выявлены пятна фрагментов парных основ 1083 (Pис. 8, столб 8; Pис. 9, столб 8; Pис. 10, столб 8).

Из куриного мяса получены следующие фрагменты с парными основами: в частности по AluI 423, 292, 160, 111, 99, 11 по HinfI 803, 224, 40, 33, по Ddel 840, 267, 37, 16. По данным анализа RFLP куриного мяса после разрыва энзимами получены следующие показатели: После AluI 423, 292, 160, 95 с парными основами, после HinfI 803, 224 с парными основами по Ddel пятна фрагментов с парными основами 840, 207 (Pис. 8, столб 9; Pис. 9, столб 9; Pис. 10, столб 9).


3.5.2 Результаты исследовании на установлению последовательности нуклеотидов основанных на гене MC1R


После ампликации по полимеразной цепной реакцией (ПЦР) MC1R гена лошадей крупного рогатого скота, верблюдов овец, производили отделение на 1,5%-ном агарозе, окрашивами этидом бромида и выявлены пятна фрагментов ДНК около с 1025 парными основами (рис.11)

M 1 2 3 4

первый ряд ДНК конины,2ой ряд ДНК говядины, 3ый ряд ДНК верблюжьего мяса, 4ый ряд ДНК баранины, М-Маркер молекула ДНК со 100 парными основами


Рис. 11. Данные ампликации MC1R гена мяса лошадей, крупного рогатого скота, верблюдов овец полимеразной цепной реакцией.


После размещения MC1R гена монгольской конины в векторе рGEM-T easy (Promega) с помощью Т7 и s6 праймера расшифрована частичная последовательность нуклейновых кислот MC1R гена с 9999 парными основами как в продольном так и вобратном направлениях (Рис.9).


Таким образом установленная нами последовательность нуклейновых кислот MC1R гена монгольских лошадей регистрирована под номером АВ495000 в информационном фонде генбанка (DDBJ/EMBL/GenBank).


* * * * * *


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Лошадь КРС Верблюдь Овца

М P N P N P N N P P N N P P P P P P P М

Рис.12. После размещения MC1R гена монгольской конины, говядины, верблюжье мяса и баранины в векторе рGEM-T easy (Promega) расшифрована частичная последовательность нуклейновых кислот MC1R гена  с помошью NotI рестриктазой


M – Маркер молекула ДНК со 100 парными основами

P-положительная колонка при размещении MC1R гена в векторе

N – отрицательная колонка при отсутствии размещения MC1R гена в векторе

1ый и 2ой ряд ДНК конины, 3ый и 4ый ряд ДНК говядины от 5ого по 9ый ряд ДНК верблюжьего мяса, от 10ого по 18ый ряд ДНК баранины.

*

*

*

*

*

*


Изучение последовательности нуклеотидов с помощью ВLAST программ (i.nim.mih.gov/Bblast.cgi) (Altschul и другие., 1997) на 98% установлено совпадение с аналогичной последовательностью MC1R гена регистрированного в генном банке под кодами AF288357, NM001114534, X 98612.

После размещения MC1R гена монгольской говядины в векторе рGEM-T easy (Promega) с помощью специфического векторного праймера Т7 и праймера S6 рашифрована последовательсноть нуклейновых кислот с 954 парными основами в продольном и в обратном направлениях в открыточитаемой части [Open reading frame (ORF)]. Установленная нами указанная последовательность нуклеотидов при поиске с помощью BLAST на 100% была аналогичной с нуклеотидной последовательсностью MC1R гена крупного рогатого регистрированного под кодовыми номерами AF445642 и AM174108.

После размещения MC1R гена монгольских верблюдов в векторе рSEM-T easy спомощью специфического векторного праймера Т7 и праймера s6 расмифрована последоватьельность нуклейновых кислот в открытой зоне (ORF) в продольном и обратном направлениях и установлениы 954 нуклейновые кислоты с парными основами. При контрольном поиске с помощью BLAST, установленная нами последовательность нуклеотидов монгольских берблюдов (Сamelus bactrianus) дали аналогичные результаты на 98% с нуклеотидной последовательностью безгорбого верблюда лам (Lama Pacos) регистрированного в генном банке под кодовым номером FJ502230, с последовательностью овец с номером V13965 на 88%, с последовательностью яков (Bos grunniens) с номером FJ624480 на 87%, с последовательностью крупного рогатого скота с номером (V19103) на 87%

Установленная нами последовательность нуклейновых кислот MC1R гена монгольских верблюдов была зарегистрирована под кодом АВ495001 в информационном фонде генного банка (DDBJ/MBL/GenBank). Наши исследования по установлению нуклеотидной последовательности MC1R гена монгольских верблюдов проведены в первые.

После размещения MC1R гена монгольских овец в векторе рSEM-T easy с помощью специфического векторного праймера Т7 и праймера s6 установлена последовательность нуклейновых кислот в продольном и обратном направлениях с охватом 1000 парных основании установлена их частичная последовательность.

При контрольном поиске BLAST в генбанке установленная у монгольских овец последовательность на 99% аналогична с данными овец под номером V13965, с данными овец Далля или диких овец Северной Америки аргал (Ovis dalli) под номером АМ884255 на 98%, с последовательностью коз на 87% с последовательностью крупного рогатого скота под номером V13958 на 96% аналогична. Последовательность нуклейновых кислот монгольских овец зарегистрирована в информационном фонд генбанка DDBJ/EMB1/GenBank под номером АВ495002.


4.ВЫВОДЫ


1.Потребность населения Монголии в мясе и мясных продуктах в 2007 г. составила 188,2 тыс.тонн, в 2008 г.- 223,1 тыс.тонн, в 2009 г. -264,4 тыс. тонн. Доля говядины составляет 21,2%, баранины - 32,8%, конины - 15,1%, козлятины - 28,5%, верблюжатины - 2,1% . Промышленная переработка (колбасы, консервы и др.) производимого мяса составляет около 10% от общего производства.

В 2010 г. экспорт говядины и конины в Россию составил 3800 тонн и 8900 тонн соответственно.В Иран было экспортировано 1560 тонн баранины, в Китай - 1 тыс. тонн конины, во Вьетнам - 4тыс.тонн козлятины. Всего на экспорт отправлено 19300 тонн мяса, что на 7,8% больше, чем в 2009 г. Экспортные возможности Монголии имеют значительный резерв т.к валовое производство мяса к 2015 г. составит 312600 тонн, а к 2020 г. – 286300 тонн.

2. В Монголии работают 35 промышленных предприятий по убою скота и первичной обработке мяса. Их общая мощность в 2010 г. составила: убой крупного рогатого скота и лошадей - 5752 гол., мелкого рогатого скота - 20030 гол. в сутки. Холодильные емкости этих предприятий одновременно вмещают 1072,4 тонн (заморозка).

Производственный потенциал мясоперерабатывающих предприятий Монголии может составлять 334 тыс. тонн говядины, 38 тыс. тонн конины, 98 тыс. тонн баранины и 132 тыс. тонн козьего мяса в год.

3.Говядина в среднем содержит 72,6% воды,4,3% жира,21,5% белка и 1,2% золы. Баранина в среднем содержит 76,4% воды,6,1% жира,19,7% белка и 1,9% золы. Пищевая ценность 100 г говядины составляет 222,3 ккал,баранины-243,2 ккал.

4.Органолептические показатели свежей говядины и свежей баранины, произведённой в Монголии не имели существенных отклонений от таковых, принятых в Российской Федерации и других развитых странах. По физико-химическим показателем (pH, реакция на пероксидазу, формольная проба, реакция с сернокислой медью в бульоне) и микробиологическим данным мясо крупного и мелкого рогатого скота соответствует категории «свежее» и подлежит выпуску без ограничений.

5.Разработана нормативная база по внедрению и практическому использованию системы контроля риска на критических точках (система НАССР) на 5 ведущих боенских и мясоперерабатывающих предприятиях Монголии: “Мах маркет" “Мах импекс”. “Дархан Мах Экспо”, ”Эрдэнэт прогресс” и мясокомбинат Горно-обогательного комбината..

6. Тестирование на 12S РНК, MC1R и TYR генов из ДНК сырого и варёного мяса 9 видов животных с помощью ПЦР получены в мясе всех животных положительные результаты к 12S РНК, MC1R генам, в то время как мясо собаки, лошади и волка дали отрицательный результат по TYR гену.

7.Метод полимеразной цепной реакции - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ) для обнаружения гена 12S РНХ в мясе животных 9 видов является наиболее подходящим при определении видовой принадлежности продукции, подвергнутой термической обработке и консервированию (мясных баночных консервов).

8.Впервые была определена последовательность нуклеиновых кислот, кодирующая ген МС1R-меланоцит рецептор крупного рогатого скота, лошадей, верблюдов и овец монгольской породы и официально зарегистрирована в банке генов DDB/EMBL/GenBank под регистром AB495000, AB495001, AB495002.

9. Впервые установлена последовательность нуклеиновых кислот, кодирующие ген МС1R-меланоцит рецептор лошадей, верблюдов и овец монгольской породы и имеют частичные (87-99%) совпадения с данными банка генов DDB/EMBL/GenBank.


5. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ


1.Опыт внедрения системы НАССР на мясокомбинате “Мах маркет” может быть внедрён на других мясокомбинатах Монголии.

2. ДНК-диагностика для установления видовой принадлежности мяса может быть применена в научно-исследовательских институтах, в судебной ветеринарии, в ветеринарных лабораториях и в учебном процессе кафедры ветеринарно-санитарной гигиены Монгольского государственного сельскохозяйственного университета.

3.При издании учебников и учебных пособий по ветеринорно-санитарной гигиене необходимо учитывать выводы и рекомендации данной работы.


6.СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. На мясокомбинате “Мах маркет” полностью внедрёна система НАССР.

2. Разработан Национальный стандарт Монголии MNS 5998:2009 ‘’Убойное предприятие. Анализ опасности и системная модель контроля риска”, Улан-Батор, 2009 г.

3. Разработан Национальный стандарт Монголии MNS 6035-2009 “Набор теста для инспекции мяса и мясных продуктов”, Улан-Батор, 2009 г.

4. Разработаны технические условия ”Модель технологических и гигиенических условий в мясной промышленности”(утв. Учёным советом Института вет. медицины, протокол №09/07/02 от 16 июня 2009 г.).


7.СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ


1. Цэрэндорж Амарсайхан. Риск микробиологической контаминации говядины и баранины и ДНК диагностика для определения видовой принадлежности мяса. / Амарсайхан Ц., Бямбаа Б., Лхагвасүрэн С.// Сборник докладов Международной конференции “Становление и развитие аграрной науки в Сибирском регионе.” - Новосибирск, 2008.- С.15-18.

2. Цэрэндорж Амарсайхан. Изучение микробиологического риска в стадии переработки холодом и хранения баранины и говядины / Цэрэндорж Амарсайхан., Лхагвасүрэн С.// Ж. Сельсхозяйственные науки. – Улан-Батор, 2008.- ¹ 2,С.54-61.

3. Цэрэндорж Амарсайхан. Идентификация видовой принадлежности мяса методом полимеразной цепной реакции и установление полиморфизма по длине фрагментов (PCR-RFLP). / Цэрэндорж Амарсайхан., Лхагвасүрэн С.// Материалы научной конференции “Отбор лучших докладов магистрантов и докторантов МГСХУ”. - Улан-Батор ,2008.-С.15-18.

4. Цэрэндорж Амарсайхан. Идентификация видовой принадлежности мяса методом полимеразной цепной реакции и установление полиморфизма по длине фрагментов(PCR-RFLP). / Цэрэндорж Амарсайхан., Лхагвасүрэн С.// Материалы Международной конференции “Проект обучения по развитию сельского хозяйства” -Улан-Батор, 2008. С. 15-24.

5. Цэрэндорж Амарсайхан. Производство и экспорт мяса - ветеринарный контроль / Цэрэндорж Амарсайхан., Лхагвасүрэн С.// Сборник научной конференции "Продовольственная наука - 2009"- Улан-батор, 2009.- С.111-116.

6. Цэрэндорж Амарсайхан. Результаты исследования по изоляции и установлению последовательности гена рецептора меланокортину-1 монгольского скота / Цэрэндорж Амарсайхан., Бямбаа Б., Лхагвасүрэн С.// Материалы Международной конференции "Роль научных исследовании и инновации для устойчивого развития"- Улан-Батор, - 2009. С. 4-7

7. Цэрэндорж Амарсайхан . Установление видовой принадлежности мяса монгольских животных с помошью ПЦР-ПДРФ. / Цэрэндорж Амарсайхан., Болдбаатар Д., Лхагвасүрэн С.// Сборник Международной конференции “Диверсификации сельской экономики на основе исследований и разработка новых продуктов”- Улан-Батор, 2008.- С.15-24

8. Цэрэндорж Амарсайхан. Определение последовательности гена меланокортину-1 рецептора скота монгольской породы. /Цэрэндорж Амарсайхан.,Болдбаатар Д., Лхагвасүрэн С.// Сборник докладов Международной конференции “Устойчивое развитие на основе научных исследований и расширения”, Улан-Батор – 2009. С. 4-7

9.Цэрэндорж Амарсайхан. Производство мяса в Монголии и перспективы его экспорта. /Цэрэндорж Амарсайхан.,Лхагвасүрэн С.//Ветеринарная медицина. – 2011- №2 – С.23-25.

10.Цэрэндорж Амарсайхан. Анализ происхождения сырого и обрабатанного мяса с помощью ПЦР. / Цэрэндорж Амарсайхан., Болдбаатар Д.,Лхагвасүрэн С.,//Ветеринарная медицина – 2011- №2 - С.26-29.