Особенности распределения и молекулярная детекция бактерий рода caulobacter озера байкал 03. 00. 16. экология

Вид материала

Автореферат

Содержание Официальные оппоненты Ученый секретарь Caulobacter crescentus Основные задачи исследования Научная новизна и практическая значимость работы. Личный вклад соискателя. Апробация результатов диссертации и публикации. Структура и объем диссертации. Содержание работы Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В различных биотопах озера байкал Распределение бактерий рода Caulobacter в зоне влияния крупных притоков озера Байкал. Распределение бактерий рода Caulobacter в пелагиали озера Байкал и сезонная динамика численности. Анализ метода десятикратных разведений для учета бактерий рода Caulobacter в природных образцах Caulobacter sp. in situ. Ассимиляция и накопление неорганического фосфата бактериями рода Caulobacter Глава 4. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГИБРИДИЗАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕННОГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО ЗОНДА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ CAULOBACTER Список работ, опубликованных по материалам диссертации Ковадло А.С. Ковадло А.С ... Полное содержание

Подобный материал:

• Экология бактерий рода Rhodococcus из глубоководных битумных построек озера Байкал, 306.35kb.
• Нко «За Байкал!» по проекту фцп «Охрана озера Байкал и социально-экономическое развитие, 61.53kb.
• Большая Байкальская Тропа иФонда Форда (сша) объявляет ежегодный конкурс, 48.96kb.
• Межлабораторные семинары отдела экологии и микробиологии иоэб со ран время, 11.06kb.
• Бактерии рода enterococcus в озере байкал: Распределение, видовой состав, механизм, 275.08kb.
• Конспект интегрированного урока «Байкал жемчужина Сибири», 194.24kb.
• Практическое задание по дисциплине «Экология» «Расчет общего загрязнения озера», 27.07kb.
• План I. Введение II. Байкал жемчужина России Байкал зарождающийся океан, 263.71kb.
• Геоэкологические основы организации рекреационного природопользования на восточном, 373.58kb.
• Исследование генетического разнообразия и процессов видообразования эндемичного семейства, 378.03kb.

На правах рукописи

Ковадло Анна Сергеевна

ОСОБЕННОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ БАКТЕРИЙ РОДА CAULOBACTER ОЗЕРА БАЙКАЛ


03.00.16. – экология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


ИРКУТСК – 2006

Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии

Лимнологического института СО РАН (г. Иркутск)

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор В. В. Дрюккер


Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Е. Я. Мучкина


кандидат биологических наук,

доцент О. Ф. Вятчина


Ведущая организация: Институт биологии внутренних

вод РАН (Борок)


Защита диссертации состоится 18 декабря 2006 г. в 14 час. на заседании Диссертационного совета Д. 212.074.07 при ГОУ ВПО «Иркутский государственный университет» по адресу: г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, биолого-почвенный факультет, Байкальский музей им. профессора М. М. Кожова (ауд. 219).

Почтовый адрес: 644003, г. Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5, биолого-почвенный факультет ИГУ, e-mail: dekanat@bio.isu.ru , тел/факс: (3952) 241-855.


С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Иркутского Государственного университета.

Автореферат разослан ___ноября 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.б.н. Е. С. Купчинская


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность проблемы. В связи с большим интересом современного общества к вопросам охраны окружающей среды, в настоящее время активно развивается такое научное направление исследований, как микробная экология. Многочисленные работы показывают огромную роль микроорганизмов биосферы в трансформации широкого спектра веществ. Поэтому, исследование микробного разнообразия и процессов, в которых участвуют те или иные микроорганизмы, является актуальной проблемой.

Исследованию таксономического состава культивируемого гетеротрофного микробиоценоза озера Байкал посвящено множество работ (Максимова, 1989; Дрюккер и соавт., 2000; Парфенова и соавт., 2006). На основе морфологических и молекулярно-генетических признаков гетеротрофные бактерии рода Caulobacter ранее были обнаружены в озере Байкал (Лаптева, 1990; Белькова и соавт., 1996). Согласно данным Н. А. Лаптевой, этот род бактерий является одним из доминирующих в составе группы олигокарбофильных бактерий микробного сообщества озера.

Н. А. Лаптева предположила, что бактерии Caulobacter занимают второе место после Pseudomonas по степени распространения и численности, и именно эти две бактериальные группы ответственны за минерализацию растворенного органического материала в водных местообитаниях, причем, бактерии Caulobacter особенно важны, когда концентрация питательных веществ и температура в среде обитания низки (Лаптева, 1987).

Caulobacter crescentus является модельным организмом в изучении регуляции клеточного цикла прокариот, секвенирован его полный геном (Ely et al., 1990; Jacobs et al., 1999; Nierman et al., 2001; Crosson et al. 2004; Viollier et al., 2004). В то же время экологическим особенностям рода Caulobacter уделяется мало внимания (MacRae et al., 1991; Fenton et al., 1999).

Цель исследований состояла в изучении особенностей распространения бактерий рода Caulobacter в различных биотопах экосистемы озера Байкал и в разработке олигонуклеотидного зонда для детекции этого рода бактерий.

Основные задачи исследования:

1. Сравнить методы выделения и учета численности клеток бактерий рода Caulobacter в озере Байкал.
   
2. Исследовать вертикальное и сезонное распределение численности популяции бактерий Caulobacter в различных биотопах озера Байкал.
   
3. Выделить и идентифицировать штаммы представителей рода Caulobacter из проб воды и осадков озера Байкал с использованием эпифлуоресцентной, сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии.
   
4. Разработать структуру олигонуклеотидного зонда и применить метод гибридизации для детекции бактерий, принадлежащих к роду Caulobacter.
   

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые было проведено исследование численности бактерий Caulobacter в воде и грунте литоральной части озера Байкал, в зонах влияния притоков озера и выявлена сезонная динамика их численности в пелагиали Байкала. Критически проанализирован метод десятикратных разведений учета численности бактерий рода Caulobacter. Впервые разработан олигонуклеотидный зонд для детекции данных прокариот методом FISH (флуоресцентной гибридизацией in situ). Методика детекции Caulobacter методом FISH может быть использована при проведении микробиологического мониторинга различных пресноводных экосистем и включена в лекционный и практический курс по экологическим специальностям высших учебных заведений.


Основные защищаемые положения:


1. Выделение бактерий рода Caulobacter из различных биотопов озера Байкал, имеющих свои специфические особенности, наиболее эффективно на среде PYE (пептон – 0.2 %, дрожжевой экстракт – 0.1 %, MgSO₄ x 7H₂O - 0.02 %, агар – 1.5 %, водопроводная вода) и воде озера Байкал с добавлением пептона в концентрации 0.01 %.

2. Для молекулярно-биологической детекции бактерий рода Caulobacter впервые разработан олигонуклеотидный зонд, имеющий структуру Cy-3-5´-CGGAAGAGGTATGTGGAAC-3´.

3. Наибольшее количество бактерий Caulobacter во все сезоны исследований установлено в придонном слое воды, в верхнем слое осадка мелководной литорали озера Байкал и в зоне смешения вод реки Селенги и озера Байкал, а также реки Баргузин – с водами Баргузинского залива.

Личный вклад соискателя. В основу диссертации положены исследования, выполненные лично автором в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН. Разработка структуры олигонуклеотидного зонда проведена совместно с м.н.с. Т. И. Трибой, измерение концентрации неорганического фосфата выполнила м.н.с. М. В. Сакирко.

Апробация результатов диссертации и публикации. Результаты исследований были представлены на Международном Байкальском микробиологическом симпозиуме IBSM-2003 «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ» (Иркутск, 2003), Межрегиональной научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004), 69–ом Лимнологическом симпозиуме в Японии (Ниигата, 2004), Четвертой Верещагинской байкальской конференции (Иркутск, 2005), Всероссийской научно-практической конференции «Научное творчество молодежи» (Анжеро-Судженск, 2006), Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006), Международной научной конференции «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем» (Ростов-на-Дону, 2006). По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах и состоит из введения, литературного обзора, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, приложения, списка литературы, включающего 146 источников, в том числе 35 отечественных и 111 на иностранных языках. В работе приводится 12 таблиц, 23 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает подробное описание объекта исследования – бактерий рода Caulobacter, а именно: морфологические, культуральные характеристики и современную таксономию представителей данного рода. В данной главе рассматривается вопрос стратегий выживания бактерий Caulobacter в олиготрофных средах обитания. В обзор литературы входит также описание особенностей озера Байкал как среды обитания для микроорганизмов и дается информация о таксономическом составе гетеротрофного микробного сообщества озера.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовано 199 проб воды и донных осадков озера Байкал, отобранных из различных биотопов озера в различные сезоны 2003-2006 гг. Пробоотбор производили стандартными методами (Кузнецов и соавт., 1989). Природные образцы воды с разных глубин отбирали, используя батометры, а у дна – стерильными шприцами (аквалангисты). Осадки отбирали дночерпателем Петерсена и стерильными шприцами (с поверхности). Пробы помещали в стерильные стеклянные флаконы (объем 200 мл) и немедленно подвергали соответствующей обработке или хранили при температуре +4˚ С не более суток до начала исследований.

Выделение штаммов бактерий рода Caulobacter осуществляли на различных, разработанных ранее агаризованных питательных средах: PYE, PYE с рибофлавином, PСa, ПДС, R₂A (Poindexter, 1981).

Исследования морфологии клеток бактерий рода Caulobacter, выделенных из озера Байкал, осуществляли с помощью светового микроскопа CARL ZEISS JENA (Германия), эпифлуоресцентного микроскопа Olympus Т041(Япония), сканирующего электронного микроскопа PHYLIPS SEM 525M и трансмиссионного электронного микроскопа LEO 906E (Германия). Препараты бактериальных клеток для микроскопии готовили по общепринятым методикам (du). Для световой микроскопии препараты бактериальных клеток контрастировали карболовым фуксином основным; в качестве красителя при флуоресцентной микроскопии применяли ДАФИ (4,6-диамино-2-фенилиндол); 2% водный раствор уранилацетата был использован для контрастирования препаратов при трансмиссионной электронной микроскопии; для сканирующего электронного микроскопирования образцы напыляли золотом.

Флуоресцентную гибридизацию in situ проводили при условиях реакций гибридизации основанных на протоколах, разработанных ранее (Amann et al., 1995). В работе были использованы следующие олигонуклеотидные зонды: CAU CGGAAGAGGTATGTGGAAC, ALF 968 GGTAAGGTTCTGCGCGTT, EUB 338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT. Зонды были мечены флуоресцентной меткой CY-3. Синтез зондов произведен фирмой «Синтол» (г. Москва).

Для подсчета числа клеток Caulobacter в образцах воды и осадков озера Байкал был использован метод десятикратных разведений (метод титра) (Беляев, 1968). Для расчета наиболее вероятного числа культивируемых клеток Caulobacter в природных образцах, полученного методом титра, использовали таблицу Мак-Креди, разработанную на основании методов вариационной статистики. Для определения доверительного интервала использовали коэффициент m, величина которого зависит от коэффициента разведений (К), условия значимости (Р) и числа засеянных пробирок. Значение коэффициента m для К=10 и Р_0.95 использовали по таблице и вычисляли доверительный интервал, используя следующую формулу: N/m ≤ M ≥ N х m (Егоров, 1976).

Эксперимент по выявлению ассимиляции неорганического фосфата бактериями рода Caulobacter проводили в модифицированной среде HiGg (Felzenberg et al., 1996). Измерение оптической плотности бактериальной суспензии производили на ФЭК при длине волны 590 нм.


Глава 3. РАСПРЕДЕЛЕНИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ БАКТЕРИЙ РОДА CAULOBACTER В РАЗЛИЧНЫХ БИОТОПАХ ОЗЕРА БАЙКАЛ


Распределение бактерий рода Caulobacter в мелководной литоральной зоне Южной котловины озера Байкал (мыс «Березовый»). По нашим наблюдениям в литоральной части Южного Байкала бактерии рода Caulobacter концентрируются в придонной зоне водной толщи. В весенний период наиболее благоприятные условия для развития стебельковых бактерий Caulobacter, судя по их численности, находились в самой мелководной зоне (глубина - 1.5-1.7 м). По мере удаления от береговой линии численность Caulobacter в придонной воде снижалась: 60 000 кл/мл, 200 кл/мл, 50 кл/мл в 50, 290 и 740 м от берега, соответственно. В октябре мы наблюдали перераспределение популяции бактерий Caulobacter из придонного слоя воды в верхний слой грунта. И вновь наблюдалась та же картина распределения, когда популяция была многочисленна у берега: 700 000 кл/мл в 50 м от берега, 130 000 кл/мл в 290 м от берега и 6 000 кл/мл в 740 м от берега. Так же, как и в октябре 2004 г., в октябре 2005 г. бактерии Caulobacter предпочитали заселять верхний слой осадка, нежели придонный слой воды.

Пробы, отобранные аквалангистами из поверхностного слоя осадков стерильными шприцами, содержали частицы детрита и различные виды водорослей. Прямое микроскопирование показало, что клетки Caulobacter избирательно прикрепляются к микроводорослям рода Scenedesmus sp. Был поставлен эксперимент - в течение 24 часов культивировали зеленые микроводоросли рода Scenedesmus sp. и выделенный из верхнего слоя грунта штамм Caulobacter sp. (№ 13). В результате проведенных наблюдений было установлено, что все клетки культуры Caulobacter sp. № 13 активно прикрепились как к живым, так и к отмирающим клеткам водорослей.

Распределение бактерий рода Caulobacter в зоне влияния крупных притоков озера Байкал. Изучение распространения популяции бактерий Caulobacter в зоне влияния третьей по величине водного стока реки Баргузин проводили на основе проб воды, отобранных в устье реки Баргузин и в Баргузинском заливе в июне 2004 г. Наиболее вероятное число клеток Caulobacter в поверхностной пробе воды в устье составило 700 000 кл/мл. Мы наблюдали уменьшение количества клеток данных микроорганизмов по мере удаления от устья реки Баргузин. В Баргузинском заливе на станции с глубиной 20 м количество клеток Caulobacter было на порядок меньше, чем в устье реки. В пробах воды на выходе из Баргузинского залива, где глубина составила 1000 м, мы наблюдали бактерии Caulobacter в количестве 25 кл/мл на поверхности воды, 6 кл/мл – на глубине 25 м и на глубине 1000 м бактерии Caulobacter не обнаружены.

Сопоставляя данные по пространственному распределению численности бактерий Caulobacter с физико-химическими параметрами вод Баргузинского залива, можно сделать вывод, что бактерии Caulobacter приурочены к высоким концентрациям взвешенных частиц. Гетеротрофные культивируемые микроорганизмы могут служить косвенным показателем наличия органического вещества, доступного для утилизации и метаболизма гетеротрофных микроорганизмов. Сравнение данных по численности гетеротрофных микроорганизмов, культивируемых на среде PYE, и числу клеток Caulobacter показало положительную корреляцию. На основании полученных результатов высокого уровня корреляции содержания бактерий Caulobacter и количества гетеротрофов можно заключить, что они сосредоточены в реке Баргузин и Баргузинском заливе в местах с повышенным содержанием биологически доступных органических субстратов и принимают активное участие в деструкции различных соединений.

Проведенные нами исследования в дельте и зоне влияния реки Селенги в июле 2004 показали также высокую численность бактерий Caulobacter с максимумом значений в воде устья протоки Харауз – 130 000 кл/мл (рис. 1). Распределение их в приустьевой части подчинялось определенной закономерности – наибольшие значения численности наблюдались на расстоянии до 9.5 км вглубь Байкала. Что касается вертикального распространения бактерий рода Caulobacter в этом уникальном биотопе озера Байкал, то они обнаруживались до глубины 15 м в прибрежной части дельты, а по направлению вглубь озера они регистрировались только в слое воды 0-10 м. Морфология бактерий рода Caulobacter, изолированных из зоны влияния реки Селенги, представлена на рис. 2.



Рис. 1. Распределение популяции бактерий Caulobacter в дельте и в 10-ти километровой зоне влияния реки Селенги.






Рис. 2. Морфологическое разнообразие бактерий Caulobacter в накопительной культуре, полученной на основе пробы, отобранной в 5 км от устья протоки Харауз. Трансмиссионная электронная микроскопия (Leo 906 E).


Распределение бактерий рода Caulobacter в пелагиали озера Байкал и сезонная динамика численности. Изучение сезонной динамики численности бактерий Caulobacter было проведено в пелагиали Южного Байкала с февраля 2005 г. по июнь 2006 г. на центральной станции разреза Листвянка-Танхой. Пробы воды отбирались в зимний, весенний, летний и осенний периоды с поверхности и глубин 5, 10, 15, 25, 50, 100, 150, 250, 500, 750, 1000, 1200 и 1400 метров. В феврале Caulobacter наблюдали в поверхностном слое воды и на глубинах 5 м, 15 м, 50 м, 250 м в количестве 6-130 кл/мл (рис. 3). В марте на глубинах 750 и 1200 м были найдены единичные микроорганизмы, а от поверхности по всей толще воды до 50 м обнаружено значительные количества Caulobacter с максимумом на 50-ти метровой глубине в количестве 1200 кл/мл. В мае мы не обнаружили бактерий Caulobacter во всей толще воды до максимальных глубин. В июле их популяция по результатам наших исследований обитала на глубинах 50 м, 250 м, 750 м и 1400 м с численностью от 60 до 600 кл/мл. В сентябре количество Caulobacter было самым высоким - мы находили стебельковые клетки Caulobacter по всей толще воды Байкала, кроме 10-25 м и 150-500 м. В этот сезон пик численности клеток приходился на 50 и 1000 м.

Таким образом было обнаружено, что бактерии рода Caulobacter предпочитают заселять относительно высокопродуктивные биотопы озера Байкал. В связи с этим, был поставлен эксперимент по выяснению жизнеспособности этих бактерий при различных концентрациях органических веществ. В результате его выявлено разделение байкальских штаммов Caulobacter на группы по скорости роста на различных концентрациях пептона. Показано, что все штаммы (70 выделенных штаммов) Caulobacter после 7 суток культивирования синтезирует биомассу при концентрации пептона 0.2 %; половине из них требуется в 2 раза больше времени для роста в среде с пептоном в концентрации 0.05%. Поэтому, возможно, в высокопродуктивных зонах озера Байкал бактерии Caulobacter за счет относительно высокой скорости роста клеток способны конкурировать с другими микроорганизмами и образуют высокую плотность популяции.

Анализ метода десятикратных разведений для учета бактерий рода Caulobacter в природных образцах. Прямая микроскопия проб воды, профильтрованных через поликарбонатные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм, выявила различные морфологические формы существования Caulobacter in situ. Было обнаружено, что данные организмы образуют «розеточные» скопления при высокой плотности популяции в придонном слое воды литоральной зоны озера Байкал (рис. 4.), а при невысокой численности в пелагиали клетки Caulobacter не образуют таких скоплений. Это наблюдение позволило предположить, что существование бактерий рода Caulobacter в виде скоплений должно оказывать влияние на результат, получаемый методом десятикратных разведений, одним из допущений которого является то, что клетки микроорганизмов распределяются в сериях разведений как



Рис. 3. Сезонная динамика численности культивируемых бактерий рода Caulobacter в пелагиали Южной котловины озера Байкал (центральная станция разреза Листвянка-Танхой).


отдельные единицы. Поэтому, был проведен эксперимент по влиянию образования скоплений бактерий Caulobacter на результат учета методом десятикратных разведений. В эксперимент был взят штамм Caulobacter № 83, образующий розеточный скопления, как и большинство штаммов исследуемого рода, и неидентифицированный штамм № 82, клетки которого, судя по микроскопическим наблюдениям, не склонны к образованию скоплений. Суспензии клеток титровали в жидкой питательной среде, подходящей для развития соответствующей культуры, а исходные суспензии высевали на агаризованные питательные среды для учета КОЕ (колонии образующие единицы). Согласно результатам эксперимента было выяснено, что клетки Caulobacter неравномерно распределяются при десятикратных разведениях в отличие от штамма № 82. У бактерий рода Caulobacter штамма № 83 количество КОЕ было 0, а количество клеток в исходной суспензии по таблице Мак Креди оказалось 200 кл/мл. У штамма № 82, который в отличие от штамма Caulobacter, не имеет прикрепительного материала и свойства адгезии, количество КОЕ составило 1200 кл/мл, а количество клеток в исходной суспензии, учитываемое по результатам десятикратных разведений по таблице Мак Креди, оказалось 1400 кл/мл при доверительном интервале 368 <1400< 5320. Таким образом, в результате исследования численности бактерий рода Caulobacter методом титра получается не учитываемая ошибка расчета при условии, если клетки Caulobacter образуют скопления.





Рис. 4. Caulobacter sp. in situ. Организмы, осажденные на поликарбонатный фильтр с диаметром пор 0.22 мкм. Источник – вода, отобранная из придонного слоя литоральной зоны озера Байкал. Слева-эпифлуоресцентная микроскопия, справа – сканирующая электронная микроскопия (шкала 10 мкм).


Ассимиляция и накопление неорганического фосфата бактериями рода Caulobacter. При исследовании морфологии бактерий рода Caulobacter озера Байкал с помощью ТЭМ (трансмиссионной электронной микроскопии) было обнаружено наличие гранул полифосфата внутри клеток. Для эксперимента по изучению особенностей метаболизма накопления фосфата был выбран штамм Caulobacter sp. № 82, выделенный с глубины 250 м центральной станции разреза Листвянка-Танхой. При культивировании на среде PYE, где источником фосфата является дрожжевой экстракт, этот штамм накапливал гранулы полифосфата. Штамм Caulobacter sp. № 82 был культивирован в модифицированной среде HiGg (Felzenberg, 1996). В качестве источника углерода была использована глюкоза в количестве 0.015 % (вес/объем), в качестве источника неорганического фосфора - 10 μM NaH₂PO_4. Клетки бактерий Caulobacter культивировали в аэробных условиях при температуре 20 ºС в течении 96 часов. В процессе эксперимента проводили измерение оптической плотности клеточной суспензии, а также измеряли концентрацию PO₄^3- и исследовали морфологию клеток с помощью ТЭМ и эпифлуоресцентной микроскопии. Полученные результаты эксперимента (рис. 5) позволяют сделать ряд выводов и предположений. Caulobacter sp. штамм № 82 выявил наличие индуцибельной системы высокого сродства ассимиляции фосфата. Это было показано уменьшением концентрации экстрацеллюлярного фосфата. Накоплением гранул полифосфата указывало на наличие фермента полифосфаткиназы, активность которой ингибируется высокими концентрациями минерального фосфора.

Р


а

б
ис. 5. Изменение оптической плотности суспензии клеток бактерий Caulobacter и концентрации PO₄^3-. OD₅₉₀-оптическая плотность культуры, при длине волны 590 нм (а). Морфология клеток бактерий рода Caulobacter штамма № 82 после инкубации в модифицированной среде HiGg. Черные электронно-плотные гранулы внутри клеток – полимеры фосфата (б).


Глава 4. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ГИБРИДИЗАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕННОГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО ЗОНДА ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ CAULOBACTER


Для расчета структуры зонда мы использовали последовательности бактериального гена 16S рРНК, принадлежащие к пяти родам семейства Caulobacteraceae: Asticcacaulis, Brevundimonas, Phenylobacterium, Nitrobacteria, Caulobacter. Названия видов, а также регистрационные номера соответствующих им последовательностей гена 16S рРНК приведены в таблице 12. Все последовательности выравнивали программой ClustalW (Thompson, 1994).

Среди выровненных последовательностей выявили консервативные участки для видов рода Caulobacter, по которым представители данной группы отличаются от других родов семейства Caulobacteraceae. Эти участки мы выбрали в качестве претендентов на роль родоспецифичного зонда. Каждый из предполагаемых зондов проверили на комплементарность к последовательностям разных микроорганизмов по базам данных молекул ДНК с помощью программы BLAST (Altschul, 1990; Gish et al., 1993). В результате этого получили список бактериальных последовательностей, которые демонстрировали большую степень сходства (до 100% совпадений в нуклеотидном составе) с анализируемыми нами фрагментами. Подавляющее большинство найденных последовательностей приходилось на некультивируемые неидентифицированные бактерии из природных образцов. Поэтому, перед нами встала задача – определить принадлежность данных последовательностей к роду Caulobacter. Для её решения мы воспользовались филогенетическим анализом. Молекулярное филогенетическое древо реконструировали методом объединения ближайших соседей (NJ-метод), реализованном в пакете филогенетических программ Phylip (Felsenstein, 1989). Древо включало в себя последовательности гена 16S рРНК бактерий семейства Caulobacteraceae, Pseudomonadaceae и последовательности, взятые из результатов поиска программы BLAST (Altschul, 1990). Таким образом, все найденные бактериальные последовательности, которые гипотетически могли бы гибридизоваться с зондом, разделились на две группы: одна группа образовывала общий кластер с последовательностями видов рода Caulobacter, другая группа последовательностей лежала вне этого кластера, то есть не относилась к данному роду. Последовательности неидентифицированных организмов, группирующиеся в один кластер с родом Caulobacter, было принято считать представителями этого рода. Оставшиеся «некаулобактерные» последовательности снова выравнивали с предполагаемыми зондами и отбирали из всех анализируемых олигонуклеотидов те, которые показывали наибольшую родоспецифичность. Таким образом, нами был выбран фрагмент, располагающийся в районе 602–620 п.н. полной последовательности гена 16S рРНК Caulobacter crescentus (идентификационный номер последовательности – ссылка скрыта), имеющий структуру CGGAAGAGGTATGTGGAAC и названный нами CAU. Разработанный зонд занимает позицию 328-347 нуклеотид в молекуле 16S рРНК по E. coli, т.е. комплементарен высокодоступному участку молекулы 16S рРНК (Behrens et al, 2003). Подбор оптимальных условий гибридизации разработанного зонда был проведен посредством флуоресцентной гибридизации с байкальскими штаммами рода Caulobacter, идентифицированными нами электронной микроскопией. В экспериментах варьировали концентрацию формамида в гибридизационном буфере и концентрацию NaCl в отмывочном буфере. Также задавали различную экспозицию в реакции отмывания несвязавшегося зонда.

Для работы с зондом использовали Caulobacter sp. штамм № 9 и штамм № 83. Данные штаммы выявили положительный результат гибридизации с зондами EUB 338, ALF 968. Разные сочетания реактивов были использованы для проверки специфической гибридизации зонда CAU. При разных условиях гибридизации (20 % формамид в гибридизационном буфере, 0.225 М NaCl в отмывочном буфере, 15 минут инкубации в отмывочном буфере - относительно строгие условия гибридизации, и при 0 % формамида в гибридизационном буфере, 0.225 М NaCl в отмывочном буфере, 15 минутах инкубации в отмывочном буфере - относительно нестрогие условия гибридизации), интенсивность флуоресценции визуально одинаковая. А при 35 % формамида в гибридизационном буфере и при 0.225 М NaCl в отмывочном буфере был получен слабый сигнал гибридизации для штамма № 9. Гибридизацию штамма № 83 проводили при следующих строгих условиях реакции гибридизации: 35% формамида в гибридизационном буфере, 0,0 М NaCl в отмывочном буфере, отмывка 20 минут; и при 35% формамида в гибридизационном буфере, 0.225 М NaCl в отмывочном буфере, отмывка 30 минут (рис. 6).

Для подбора условий гибридизации с отрицательным контролем был использован штамм факультативного метилотрофа бактерий рода Methylorhabdus multivorans, который имеет одно несовпадение с последовательностью зонда в целевом участке. Нестрогие условия гибридизации: 0 % формамида и 0.225 M NaCl в отмывочном буфере при 15 минутной инкубации в отмывочном буфере давали одинаковый результат гибридизации как у Methylorhabdus multivorans, так и у Caulobacter. После подбора условий гибридизации удалось добиться отсутствия сигнала флуоресценции у Methylorhabdus multivorans при строгих условиях 35 % или 20 % формамида и 80 мМ NaCl при 15 минутах в отмывочном буфере и наличия сигнала у бактерий Caulobacter. Олигонуклеотидный зонд также был использован в накопительных культурах, где бактерии Caulobacter из-за истощения развивают гипертрофированные простеки. Таким образом, гибридизация, проведенная при 35 % формамида, 80 мМ NaCl и 15 минутной отмывке выявила клетки бактерий рода Caulobacter, выделенные из озера Байкал.




Рис. 6. Микрофотография байкальского штамма Caulobacter № 83. Голубое окрашивание (слева) получено обработкой клеток флуоресцентным красителем ДАФИ, красное окрашивание (справа) получено олигонуклеотидным зондом CAU, Условия гибридизации: 35% формамид в гибридизационном буфере, 0,0 М NaCl в отмывочном буфере, отмывка 20 минут (шкала - 10 мкм).

Были проведены эксперименты по гибридизации зонда CAU с бактериями, населяющими поверхностную пленку одной из проб воды озера Байкал. Как было уже описано ранее (Poindexter, 1964), в природных пробах воды в течение месяца культивирования в микробном сообществе развиваются бактерии, способные переживать недостаток питательных веществ. Среди таких микробов наблюдается и Caulobacter, который к тому же развивает гипертрофированные простеки и становится видимым в световой микроскоп. Теоретически предполагается, что зонд должен детектировать только Caulobacter. Данное предположение было подтверждено практически. Был выявлен сигнал флуоресцентной гибридизации зонда CAU.

ВЫВОДЫ

1. За период исследований 2003-2006 гг. из воды и донных осадков различных биотопов озера Байкал на различных по составу питательных средах выделено 70 штаммов бактерий рода Caulobacter.

2. Исследования сезонной динамики и вертикального распределения показали, что наибольшая численность бактерий Caulobacter наблюдается в верхнем слое осадка и придонном слое воды мелководной литорали Южного Байкала (до 700 000 кл/мл), в устье реки Баргузин (700 000 кл/мл) и в зоне смешения байкальских вод и реки Селенги (130 000 кл/мл). В пелагиали озера количество клеток Caulobacter не превышало значений порядка 10³ кл/мл.

3. Установлена положительная корреляция между количеством культивируемых гетеротрофных микроорганизмов и наиболее вероятным числом культивируемых бактерий рода Caulobacter в мелководной литоральной части озера Байкал и в Баргузинском заливе .

4. Обнаружено образование «розеточных» скоплений in situ бактериями рода Caulobacter в воде придонной зоны при высокой плотности популяции. Экспериментально показана допускаемая ошибка подсчета их численности методом десятикратных разведений при исследовании образцов, где клетки Caulobacter имеют вид «розеточных» скоплений.

5. Сконструирован олигонуклеотидный зонд с последовательностью CGGAAGAGGTATGTGGAAC. Специфичность зонда проверена флуоресцентной гибридизацией на штаммах бактерий рода Caulobacter, выделенных из озера Байкал. Подобраны условия специфичной гибридизации зонда CAU с применением в качестве отрицательного контроля штамма метилотрофной бактерии Methylorhabdus multivorans c одним несовпадением в целевом участке: 35% или 20 % формамида в гибридизационном буфере при 46 ºС’; 80 мМ NaCl и 15 минутах инкубации в отмывочном буфере при температуре 48 ºС – условия специфичной гибридизации для CY-3 меченого зонда CAU при флуоресцентной гибридизации со штаммами бактерий рода Caulobacter.

6. Экспериментально показана способность бактерий рода Caulobacter ассимилировать минеральный фосфор микромолярной концентрации и запасать его в виде гранул неорганического полифосфата.


БЛАГОДАРНОСТИ


Автор выражает благодарность и искреннюю признательность научному руководителю д.б.н., профессору, чл.-корр. РЭА В. В. Дрюккеру за постоянную помощь при выполнении работ, зав. лабораторией водной микробиологии к.б.н. В. В. Парфеновой, д.б.н., профессору Ю. А. Троценко, д.б.н. Н. В. Дорониной, к.б.н. Т. И. Земской, д.б.н. О. А. Тимошкину, к.б.н. Н. Л. Бельковой, к.б.н. О. И. Белых, к.б.н. И. В. Клименкову, Т. И. Трибой, С. Ю. Максименко, И. В. Тихоновой, М. В. Сакирко, Т. Е. Перетолчиной, Е. Д. Бедошвили. и А. П. Лопатину и всем сотрудникам лаборатории водной микробиологии Лимнологического института за поддержку и сотрудничество.


СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ


1. Дрюккер В.В., Ковадло А.С., Парфенова В.В. К вопросу о выделении бактерий рода Caulobacter из воды озера Байкал // Международный Байкальский симпозиум по микробиологии «Микроорганизмы в экосистемах озер, рек и водохранилищ», Иркутск, 2003, с. 37.

2 . Ковадло А.С. Особенности распределения бактерий рода Caulobacter в воде и осадках озера Байкал // Материалы межрегиональной научно-практической конференции, «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование», Иркутск, 2004, с. 142-143.

3. Drucker V.V., Dutova N.V.,Terkina I.A., Pavlova O.N., Kovadlo A.S. The structure of microbial community and water quality of Lake Baikal // Abstract Limnol Society of Japan, 69 Annual Meeting Niigata, 2004, p. 168.

4. Дрюккер В.В., Ковадло А.С., Сакирко М.В. Экологические факторы распределения и морфологическое разнообразие бактерий Caulobacter в озере Байкал // Четвертая Верещагинская байкальская конференция. Тезисы докладов и стендовых сообщений, Иркутск, 2005, 96-97.

5. Тимошкин О.А., Сутурин А.Н., Кравцова Л.С., Ситникова Т.Я., Оболкина Л.А., Ковадло А.С. Исследование биогеохимических процессов в литорали озера Байкал: распределение гидробионтов, взаимосвязь с пелагиалью, мониторинг (ланшафтно-экологический подход) //Четвертая Верещагинская байкальская конференция. Тезисы докладов и стендовых сообщений, Иркутск, 2005, 189-190.

6. Ковадло А.С., Дрюккер В.В. Распространение бактерий рода Caulobacter (Henrici and Johnson, 1935) в озере Байкал // Сибирский экологический журнал, 2006, № 5, с. 581-585.

7. Дрюккер В.В., Ковадло А.С. Природные условия обитания бактерий рода Caulobacter в экосистеме озера Байкал // География и природные ресурсы, 2006, № 2, с. 69-72.

8. Ковадло А. С. Бактерии рода Caulobacter в экосистеме озера Байкал // Материалы 10 всероссийской научно-практической конференции «Научное творчество молодежи», Анжеро-Судженск, 2006, с. 20.

9. Ковадло А.С. Пространственно-временное распределение популяций бактерий рода Caulobacter в пелагиали озера Байкал // Тезисы Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем внутренней Азии», Улан-Удэ, 2006, с. 51.

10. Дрюккер В.В., Дутова Н.В., Ковадло А.С., Косторнова Т.Я., Никулина И.Г. Вирусологический и бактериологический мониторинг экосистемы озера Байкал // Материалы международной научной конференции «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем», Ростов-на-Дону, 2006, с.118-120.

11. Тимошкин О.А., Сутурин А.Н., Кравцова Л.С., Ситникова Т.Я., Оболкина Л. А., Ковадло А.С. Экология, биохимия и мониторинг каменистой литорали озера Байкал // 9-ый съезд Гидробиологического общества РАН, тезисы докладов, Тольятти, 2006, с.193.