Некоторые аспекты диагностики нарушений гемостаза в клинико-диагностических лабораториях
| Вид материала | Исследование |
- Япоевна клиническое значение диагностики и коррекции нарушений в системе гемостаза, 316.66kb.
- Клинико-морфологические аспекты в диагностике внутренних нарушений височно-нижнечелюстного, 476.63kb.
- Клинико-функциональные критерии диагностики кардиореспираторных нарушений у работников, 336.35kb.
- Феохромоцитома/параганглиома: клинико-генетические аспекты диагностики и лечения. 14., 338.24kb.
- «российский нии гематологии и трансфузиологии», 676.98kb.
- Эмоционально-волевыми отклонениями в развитии, 28.61kb.
- Клинико-патогенетические аспекты формирования церебральных нарушений при сахарном диабете, 838.38kb.
- Клинико-экономические аспекты лечения абдоминального сепсиса, 357.21kb.
- Регламентацию лучевых диагностических исследований, 86.1kb.
- Федеральный детский центр диагностики и лечения нарушений ритма сердца, 103.08kb.
НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА
В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЯХ
Исследование системы гемостаза предназначено для:
- диагностики нарушений в системе гемостаза и уточнения их характера
- решения вопроса о допустимости оперативного вмешательства
- проведения контроля за лечением антикоагулянтами прямого и непрямого действия, а также тромболитической терапией
В настоящее время обычная практика распознавания нарушений гемостаза неоднородна и часто варьирует в разных клиниках от бесполезного выполнения одного-двух тестов (протромбиновый индекс, фибриноген) до использования перегруженного списка методов, часть из которых по информативности дублирует друг друга. Кроме того, многие исследования устарели, малоценны и неточны. На сегодняшний день несопоставима с общемировыми методическими подходами оценка результатов протромбинового времени по протромбиновому индексу.
Устаревшие методы исследования нарушений гемостаза и варианты их замены
| Метод | Недостатки | Современные методы |
| Время свертывания (венозной крови) | Низкая стандартизация | АЧТВ |
| Время рекальцификации | Низкая стандартизация | АЧТВ |
| Толерантность плазмы к гепарину | Низкая стандартизация | Тромбин-гепариновое время плазмы, определение анти-Ха-активности |
| Аутокоагуляционный тест (АКТ) | Низкая стандартизация | АЧТВ, активность антитромбина III |
| Бета-нафтоловый (фибриноген В), этаноловый или протаминсульфатный тесты | Малоинформативное, качественное выражение результатов, часто ложноположительных. | Тесты на тромбинемию: количественное определение РФМК (растворимых фибрин-мономерных комплексов) |
Для выявления нарушений гемостаза рационально использовать двухэтапное обследование: на 1 этапе проводят скрининговые исследования, на 2 этапе – уточняющие тесты.
КОАГУЛОГРАММА 1 ЭТАПА в качестве первичного скрининга включает необходимый и достаточный комплекс тестов для диагностики, в основном, геморрагических нарушений.
Для пациентов с тромботическими заболеваниями адекватного скрининга нарушений гемостаза не разработано.
Сосудисто-тромбоцитарное звено оценивают с помощью:
- определения количества тромбоцитов
- определения времени свертывания капиллярной крови
Информацию о состоянии плазменного звена дает определение:
- протромбинового времени
- тромбинового времени
- активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ)
- содержания фибриногена
Эту схему можно дополнить 1-2 показателями, специфичными для определенной категории обследуемых пациентов. Часто, особенно в амбулаторных условиях, такой спектр обследования оказывается достаточным для пациента.
В случае обнаружения изменений в скрининговых тестах (или при явных клинических показаниях) необходимо выполнение уточняющих исследований, позволяющих провести дифференциацию причин выявленных нарушений. В этом случае необходим контакт с лечащим врачом, чтобы избежать необоснованного выполнения редких и дорогих исследований.
КОАГУЛОГРАММА 2 ЭТАПА включает следующие тесты:
- оценка агрегационной активности тромбоцитов
- исследование антикоагулянтной системы: антитромбин III, эндогенный гепарин, комплекс тромбин – антитромбин, протеины С и S
- определение общей фибринолитической активности крови, определение Хаггеман-зависимого фибринолиза, плазминогена
- определение маркеров внустрисосудистого свертывания: РФМК, ПДФ, Д-димера
- поиск специфичных гемокоагуляционных маркеров, присущих данной категории пациентов
Отдельно рекомендуется выполнять исследование реологии крови.
Основные характеристики показателей, используемых в скрининговых исследованиях:
- подсчет количества тромбоцитов происходит при выполнении клинического исследования крови. На гематологических анализаторах определяются тромбоцитарные показатели – средний объема тромбоцита, распределение по объему, тромбокрит.
- наиболее доступным и дешевым методом для выявления нарушений сосудисто-тромбоцитарного звена является время капиллярного кровотечения по Дьюку. Но этот метод имеет ряд недостатков: плохая стандартизация, низкая чувствительность и специфичность, технические трудности в исполнении анализа. Более часто используется определение времени свертывания капиллярной крови унифицированным методом по Сухареву (в капилляре для СОЭ); на практике в КДЛ распространено исследование времени свертывания по Моравицу (на стекле). Но в этом случае необходимо обязательно использовать стекла c лунками cо шлифованным стеклом – это необходимо для исключения активации свертывания, которая имеет место при контакте с обычным стеклом и укорачивает время исследования.
Тромбиновое время дает оценку конечного этапа свертывания крови. Это показатель перехода фибриногена в фибрин, состояния антикоагулянтной системы. Не зависит от внутренней и внешней системы активации, но зависит от:
- концентрации фибриногена, наличия аномального фибриногена
- активности антитромбинов
- процессов полимеризации и стабилизации фибрина
В клинике определение ТВ используется для:
- контроля за терапией высомолекулярным гепарином и фибринолитической терапией
- диагностики активации фибринолиза
- косвенной диагностики гипо- и дисфибриногенемий.
Снижение активности фибриназы (фактор XIII) не отражается на тромбиновом времени.
Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) дает нам оценку внутреннего пути активации процесса свертывания. Тест называют также каолин-кефалиновым временем.
Является простым и многосторонним тестом, чувствительным к дефициту всех факторов свертывания (кроме VII и XIII). Чувствителен к избытку в плазме антикоагулянтов. На основе АЧТВ проводят тесты для выявления дефицита отдельных факторов гемостаза с использованием принципа заменных проб.
АЧТВ-тест – один из основных для контроля при лечении гепарином. У больных, получающих гепаринотерапию, АЧТВ удлиняется в 1,5-2 раза, что свидетельствует об эффективности лечения.
- удлинение теста свидетельствует о гипокоагуляции.
Больным, находящимся на лечении непрямыми антикоагулянтами, необходимо также контролировать, кроме ПВ, и АЧТВ. Хотя тест менее чувствителен, чем ПВ, он позволяет контролировать активность фактора IX свертывания крови, который ПВ не контролирует.
АЧТВ удлиняется при наличии ингибиторов свертывания крови - ПДФ, волчаночного антикоагулянта.
- укорочение теста указывает на гиперкоагуляцию, а также наблюдается при нормальной беременности, приеме пероральных контрацептивов.
Необходимо подчеркнуть, что чувствительность теста АЧТВ к разным изменениям гемостаза в значительной мере зависит от свойств используемых реактивов. Предпочтительно использовать реактивы, содержащие в контактном реагенте не один вид фосфолипидов (синтетических, выделенных из мозга кролика или сои), а смесь разных фосфолипидов, включая отрицательно заряженный фосфатидилсерин.
Важно отметить, что не все реактивы одинаково чувствительны к волчаночному антикоагулянту, поэтому при подозрении на его наличие необходимо применять реактивы, содержащие в качестве активатора не эллаговую кислоту, а каолин.
Внешний механизм каскада свертывания суммарно оценивают, определяя протромбиновое (тробопластиновое) время (ПВ) с вычислением международного нормализованного отношения (МНО) и протромбинового индекса.
Норма: ПВ - от 10 до 20 сек (в зависимости от тромбопластина); МНО – 0,8-1,3; ПИ - 80-110%.
Протромбиновое время зависит от содержания собственно протромбина и V, VII, X факторов.
Тест используют для контроля за лечением антикоагулянтами непрямого действия.
В настоящее время учет результатов протромбинового времени с помощью протромбинового индекса не соответствует современным требованиям. Чтобы однозначно интерпретировать результаты измерения протромбинового времени, независимо от лаборатории, используют МНО (INR): этот способ математически скорректировать разницу, даваемую тромбопластинами с разной чувствительностью. Вычисляется при использовании тромбопластина, стандартизированного по международному индексу чувствительности - МИЧ (ISI). Тромбопластин рекомендуется использовать со значениями МИЧ 1,0-1,2.
При лечении непрямыми антикоагулянтами МНО поддерживают на уровне 2,0-3,5 в зависимости от клинической ситуации. Определение МНО, по сравнению с протромбиновым индексом, позволяет более точно подобрать дозу антикоагулянта и уменьшить риск кровотечений, связанных с его передозировкой.
Определение содержания фибриногена. Норма – 1,5-3,75 (или 2,0-4,0 г/л). Фибриноген относится к острофазовым белкам. Повышение количества фибриногена даже в пределах нормальных значений (в диапазоне 3,0-4,5 г/л) рассматривается как фактор риска при сердечно-сосудистых заболеваниях, особенно у лиц молодого и среднего возраста.
Показания основных коагуляционных тестов
| Тест | Дефицит и/или ингибиция факторов | Эффекты антикоагулянтов | |||||
| XII,XI,IX,VIII, ПК, факторов Виллебрандта, Флетчера, Фитцжеральда | V, X | VII | II (протромбин) | I (фибриноген) | прямые | непрямые | |
| Тромбиновое время | норма | норма | норма | удлинено | удлинено | удлинено | норма |
| АЧТВ | удлинено | удлинено | норма | норма/ удлинено | норма/ удлинено | удлинено | тенденция к удлинению |
| Протромбиновое время (МНО) | норма | удлинено | удлинено | удлинено | норма/ удлинено | удлинено/ норма | удлинено |
| Фибриноген | норма | норма | норма | снижен или не определяется | снижен или не определяется | норма/ снижен | норма |
При ДВС-синдроме изменения тестов коагулограммы зависят от формы и стадии процесса.
Методы исследования плазменного гемостаза
1. Клоттинговые
2. Амидолитические - с использованием хромогенных или флуорогенных субстратов
3. Иммунохимические
4. Молекулярно-биологические
1. В настоящее время для оценки плазменного звена гемостаза наиболее распространены коагуляционные, или клоттинговые, методы, которые основаны на определении промежутка времени от добавления стартового реактива, запускающего каскад свертывания плазмы, до момента образования сгустка. Все больше входят в лабораторную практику коагулометры, которые обеспечивают необходимую точность и воспроизводимость тестов, уменьшают влияние человеческого фактора. В основе работы коагулометров лежат несколько принципов: механический, оптико-механический, турбидиметрический, нефелометрический. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки.
Краткая характеристика принципов работы коагулометров:
| Методы | Принцип работы | Преимущества | Недостатки |
| Механический | Регистрация сгустка с помощью магнитных мешалок | Принципиальная возможность работы на цельной крови, высокая толерантность к типу используемых реагентов и пробирок, низкая стоимость анализаторов | Низкая чувствительность – нет детекции слабых сгустков; необходимо применять мешалки |
| Оптико-механический | Регистрация сгустка с помощью светового потока и магнитных мешалок | Большая точность, чем в механическом методе, перемешивание пробы во время снятия показаний | Чувствительность ниже, чем у нефело-метрического метода; необходимо применять мешалки |
| Турбиди- метрический | Регистрация сгустка по приросту оптической плотности | Чувствительность и точность выше предыдущих методов, меньший расход плазмы и реагентов, доступная стоимость анализаторов | Чувствительность ниже нефелометрического метода |
| Нефело- метрический | Регистрация сгустка по изменению рассеяния света | Высокая чувствительность, высокая точность измерения | Высокая стоимость прибора |
Современные коагулометры используют сочетание нескольких методов измерения.
Клоттинговые методы имеют ряд ограничений:
- не все компоненты гемостаза можно исследовать по образованию сгустка – например, количественное определение компонентов системы фибринолиза
- метод чувствителен к различным неспецифическим внешним воздействиям - например, исследование фактора 8 невозможно у пациента, получающего терапию антикоагулянтами, хотя они не оказывают прямого влияния на этот фактор
- метод малочувствителен для определения повышенной активности компонентов свертывания
- для ряда тестов сложно создать устойчивые реактивы, доступные по цене и удобные для применения в КДЛ
2. Для исследования компонентов, которые невозможно учесть клоттинговыми методами - например, определение тромбина, плазмина, применяют методы с использованием хромогенных и флуорогенных субстратов. Эти методы схожи с тестами клинической химии, имеют высокую чувствительность и специфичность и могут выполняться на биохимических анализаторах, но имеют высокую себестоимость.
3. В последнее время все более широкое распространение получают иммунохимические методы исследования, которые позволяют количественно определять концентрацию конкретного белка, что отличает их от клоттинговых методов и методов с хромогенными субстратами, которые определяют функциональную активность компонентов, но не их концентрацию. Это методы, основанные на:
- латекс-агглютинации, выявляемой при турбидиметрическом и нефелометрическом методах регистрации
- методе ELISA – с помощью специфических моноклональных антител, реализуемом, в основном, в иммуноферментном анализе
4. Начинают внедряться в практику лабораторий молекулярно-биологические методы для выявления наследственных нарушений свертывания крови, связанных с мутациями генов, например, для диагностики гемофилий, болезни Виллебранда. В последние годы с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) широкое распространение получили исследования по выявлению генной мутации V фактора свертывания крови. Этот патологический V фактор получил название фактора Лейдена. Он вызывает резистентность к одному из антикоагулянтов крови – активированному протеину С. Этот вид генной мутации встречается в 10 раз чаще остальных и выявляется у 20% молодых больных с венозными тромбоэмболиями и у 4% в общей популяции.
Некоторые моменты преаналитического этапа
При выполнении коагулометрических исследований очень важен преаналитический этап, и часто он является критическим. Материалом для исследований может быть цельная кровь – венозная или капиллярная, и цитратная плазма венозной крови.
- Капиллярная кровь как диагностический материал имеет ограниченное значение. Но может быть использована для контроля за приемом непрямых антикоагулянтов в амбулаторных и домашних условиях, и для экспресс-диагностики у детей первых месяцев жизни. Но такое исследование имеет ряд недостатков: велика вероятность преаналитической ошибки – при заборе в пробу попадает неконтролируемое количество тканевого тромбопластина, резко искажающего результаты; длительность взятия крови является критическим моментом, сложно стандартизировать такое исследование. Кроме того, качественные портативные приборы и реагенты дорогостоящи.
- Основным материалом является плазма венозной крови. Кровь необходимо брать строго натощак, иглой с просветом около 0, 9 мм. Лучше всего использовать для забора современные коммерческие системы вакуумного забора - моноветты, вакутейнеры и вакуэты.
При самостоятельном приготовлении цитрата натрия важно учесть, что если используется трехзамещенный цитрат – то готовят его раствор с концентрацией 3,8%, а если используется двузамещенный – то 3,2%.
Кровь берут в принятом соотношении с цитратом натрия 9:1. Но большее соотношение - в пределах 12:1 - не оказывает существенного влияния на результаты тестов, а соотношение менее 8:1 может вызвать удлинение ПВ и АЧТВ.
Важно учитывать при заборе и гематокрит пациента: при гематокрите более 60% (у новорожденных, пациентов с эритремией, сердечной недостаточностью) может быть ложная гипокоагуляция. Более часто встречается гематокрит менее 25% (при анемиях), что приводит к ложной гиперкоагуляции.
Результаты тестов искажаются в гемолизированной плазме. Если плазма подвергалась заморозке, то перед исследованием ее необходимо повторно отцентрифугировать.
Контроль качества в коагулометрических исследованиях
Контроль качества в коагулогии является центральным элементом обеспечения эффективности диагностических исследований. О высокой степени качества лабораторных исследований можно говорить лишь тогда, когда под контролем находится весь процесс - от назначения исследования и взятия материала до получения достоверного результата.
Для адекватного контроля качества необходимо использовать коммерческие контрольные плазмы.