Исследования иммунобиохимической лаборатории ГНУ СИБНИИЖ
Отчет по практике - Сельское хозяйство
Другие отчеты по практике по предмету Сельское хозяйство
?мпонентов реакции (антиген или антитело) заранее в производственных фирменных лабораториях фиксируется в лунках специально приготовленных полистироловых или поливинилхлоридных панелей. Исследуемый материал помещается в эти лунки. Для выявления антигена могут быть использованы лунки, в которых фиксированы антитела. Если в материале содержался антиген, то он присоединяется к фиксированным антителам и сам оказывается фиксированным в лунке.
Для выявления этого антигена используются меченые антитела, и после ряда отмывок для удаления несвязывавшихся компонентов эти антитела выявляются в соответствии со своей меткой. Для выявления антител могут быть использованы лунки, в которых фиксирован антиген. Добавленные антитела фиксируются на антигене, остаются в лунке и могут быть выявлены с помощью меченых антиглобулиновых антител. Мы привели примеры вариантов использования твердофазных методов и меченых компонентов реакций. Могут быть и другие варианты.
Так, например, клетки крови или костного мозга могут быть обработаны флюоресцирующими антителами в жидкости. При этом клетки могут быть обработаны разными антителами, помеченными разными флюорохромами. Пропуская такие взвеси через специальный проточный флюориметр, можно одновременно выявить и подсчитать разные виды клеток. Присоединив к проточному флюориметру прибор, именуемый сортером, можно выделить или удалить из взвеси те клетки, которые необходимы исследователю или врачу.
Современные иммунофлюоресцентные, иммуноферментные и радиоиммунные методы отличаются высокой чувствительностью (выявление 0,0005-0,00005 мкг/мл белка), специфичностью, воспроизводимостью, возможностью выявления широкого круга биологических веществ. Современные производственные фирмы готовят все необходимые ингредиенты и оборудование для их использования.
Таким образом, развитие серологических методов диагностики происходит в настоящее время в следующем направлении:
использование меченых антигенов или антител с помощью флюорохрома, фермента либо радиоактивной метки;
постановка реакции на твердофазном носителе - полистероловом планшете с лунками с нанесенными в них антигенами или антителами.
Это позволяет повысить чувствительность метода, автоматизировать постановку реакции и использовать специальную аппаратуру для снятия результатов.
4. ПЦР-диагностика
кровь серологический антиген фагоцит
Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp [8]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд. пар оснований.
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Термостабильная ДНК-полимераза - фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов - Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции - рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.
Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.
Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию [10].
Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18-30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.
После гибридизации матрицы с праймером (отжиг [11]), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже).
Важнейшая характеристика праймеров - температура плавления (Tm) комплекса праймер-матрица.m - температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Температуру плавления можно приблизительно определить по формуле
,
где: nX - количество нуклеотидов Х в праймере.
В случае невер?/p>