Исследования иммунобиохимической лаборатории ГНУ СИБНИИЖ
Отчет по практике - Сельское хозяйство
Другие отчеты по практике по предмету Сельское хозяйство
?я антигенной структуры бактерий с целью определения их серовара.
Реакция непрямой, или пассивной, агглютинации (РПА). Под непрямой, или пассивной, агглютинацией понимают реакцию, в которой антитела взаимодействуют с антигенами, предварительно адсорбированными на клетках или частицах. В качестве сорбентов чаще всего применяют эритроциты различных животных, частицы целлюлозы, бентонита или латекса. В некоторых случаях пользуются обратным вариантом, т.е. адсорбируют на эритроцитах или иных частицах не антигены, а антитела.
Реакция преципитации и ее варианты. Сущность данной реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена, находящегося в дисперсном коллоидном состоянии, воздействием специфических антител в растворе электролита. Механизмы реакций агглютинации и преципитации аналогичны и описываются теорией решетки.
Реакция преципитации является высокочувствительным тестом, так как позволяет обнаружить малые количества антигена или гаптена. Высокая чувствительность реакции преципитации позволяет использовать ее для выявления антигенов с помощью известных антисывороток. В одном из вариантов последовательные разведения антигена наслаивают на стандартное разведение диагностической сыворотки в пробирках, при этом осадок образуется в виде кольца на границе двух сред (кольцепреципитация). Реакцию оценивают по максимальному разведению антигена, при котором наблюдается кольцо преципитации визуально. Кроме того, помутнение может быть зафиксировано инструментальными методами - нефелометрией и др.
Реакция преципитации применяется в лабораторной практике при диагностике инфекционных заболеваний, а также в судебной медицинской экспертизе для определения видовой принадлежности белков, в частности белков кровяных пятен, спермы и т.д. С помощью этой реакции в санитарной практике определяют фальсификацию рыбных и мясных изделий. В биологии реакция прециации используется для установления степени филогенетического родства различных ядов животных и растений.
Иммунодиффузия. Методы иммунодиффузии представляют собой вариант реакции преципитации, в которой взаимодействие антигена с антителами происходит не в жидкости, а в геле, что позволяет лучше выявлять и фиксировать результаты взаимодействия. В качестве геля чаще всего используется агаровый или полиакриламидный гель.
Существует несколько вариантов постановки реакций. Чаще всего используется метод двойной диффузии, при котором растворы, содержащие антигены и антитела, помещают в лунки, вырубленные в пластинке геля, находящегося на стекле. При экспозиции антигены и антитела диффундируют из лунок и на месте их встречи образуется полоса преципитации, хорошо видимая невооруженным глазом. Если в растворах содержалось несколько антигенных компонентов и соответствующие антитела, то они диффундируют в геле с разной скоростью и могут образовать несколько полос преципитации. Это позволяет выявить не только факт присутствия антигена, но и число составляющих компонентов. Взаимное расположение полос при помещении в соседние лунки сравниваемых антигенов дает возможность судить об идентичности составляющих их антигенов [6].
В другом варианте реакции раствор, содержащий антитела, смешивается с гелем до его застывания и помещения на стекло. Антиген помещается в лунку и при его диффузии в гель, содержащий антитела, образуется зона помутнения, диаметр которой пропорционален количеству антигена. Эта модификация метода, часто называемая по имени автора - метод Манчини, позволяет количественно определять антигены.
Обычно тесты иммунодиффузии используют для идентификации белков в биологических жидкостях, таких, как сыворотка крови, цереброспинальная жидкость, секреты желез или экстракты различных органов и т.д. [6].
Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) представляет собой сочетание электрофореза в геле с иммунодиффузией. Принцип ЙЭФ состоит в следующем. Сначала проводят электрофоретическое разделение белков (смеси антигенов) в забуференном агаровом геле. Затем в канавку, которая идет параллельно направлению миграции белков, вносят преципитирующую иммунную сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в геле навстречу друг другу, в месте их взаимодействия образуются дугообразные линии преципитации, количество, расположение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов. С помощью ИЭФ успешно анализируются белки сыворотки крови, спинномозговой жидкости, мочи, белки микробного происхождения. В клинической практике ИЭФ используют при диагностике иммунодефицитных состояний, проявляющихся дисгаммаглобулинемией.
В результате комбинации с другими методами анализа предложены дискиммуноэлектрофорез, иммуноэлектрофокусирование, ракетный иммуноэлектрофорез, радиоиммуноэлектрофорез, иммуноблотинг [6].
Иммуноблотинг - один из современных высокоточных вариантов электрофореза с анализом разделенных белков иммунологическим методом. Тест осуществляется в три этапа: сначала проводится электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ионного детергента додецилсульфата натрия. Разделенные антигены переносятся за счет капиллярных сил или дополнительного электрофореза на иммобилизующую нитроцеллюлозную мембрану. Находящиеся на мембране антигены анализируются с помощью меченых ферментной или радиоактивной меткой антител (иммуноферментным или радиоиммунным методом) [6].
Реакция Кумбса (антиглобулиновый тест). Непол