Исследования иммунобиохимической лаборатории ГНУ СИБНИИЖ
Отчет по практике - Сельское хозяйство
Другие отчеты по практике по предмету Сельское хозяйство
00мкл образца крови, предварительно встряхнув пробирку с образцом. К 100 мкл крови с помощью микропипетки добавляют 300 мкл раствора I, а затем - 10 мкл сорбента, в качестве которого использовалось жидкое стекло. После этого смесь тщательно перемешивали на вертексе до гомогенного состояния, а затем - инкубировали при комнатной температуре 10-15 минут. Затем центрифугировали на микроцентрифуге около 60 секунд, после чего отбирали и отбрасывали супернатант.
Далее к осадку приливали 150 мкл раствора II, разбивали остаток на вертексе и перемешивали до гомогенного состояния. После этого - центрифугировали на микроцентрифуге около 60 секунд, после чего отбирали и отбрасывали супернатант. Затем к осадку приливали 700 мкл раствора III, после чего разбивали остаток на вертексе и перемешивали до гомогенного состояния. После этого - центрифугировали на микроцентрифуге около 60 секунд, после чего отбирали и отбрасывали супернатант.
Далее пробирки помещали в микротермостат и инкубировали около 30 минут (хотя в инструкции сказано - 5 минут!) с целью удаления остатков раствора III, содержащего этанол, который является ингибитором последующих реакций. Далее к осадку добавляли 50 мкл стерильной воды, перемешивали на вертексе до гомогенного состояния и инкубировали в термостате 5 мин при температуре 550С. Вода содержала выделенное ДНК, пригодное для дальнейших ПЦР-реакций.
3. Серологические реакции
Реакции между антигенами и антителами in vitro или серологические реакции широко используются в микробиологических и серологических (иммунологических) лабораториях с самыми разнообразными целями:
серодиагностики бактериальных, вирусных, реже других инфекционных заболеваний,
сероидентификации выделенных бактериальных, вирусных и других культур различных микроорганизмов
Серодиагностику проводят с помощью набора специфических антигенов, выпускаемых коммерческими фирмами. По результатам серодиагностических реакций судят о динамике накопления антител в процессе заболевания, о напряженности постинфекционного либо поствакцинального иммунитета.
Сероидентификацию микробных культур проводят для определения их вида, серовара с помощью наборов специфических антисывороток, также выпускаемых коммерческими фирмами.
Каждая серологическая реакция характеризуется специфичностью и чувствительностью. Под специфичностью понимают способность антигенов или антител реагировать только с гомологичными антителами, содержащимися в сыворотке крови, либо с гомологичными антигенами соответственно. Чем выше специфичность, тем меньше ложноположительных и ложноотрицательных результатов.
В серологических реакциях участвуют антитела, принадлежащие главным образом к иммуноглобулинам классов IgG и IgM [6].
Реакции, протекающие с укрупнением антигена
Реакция агглютинации и ее варианты. Реакция агглютинации (agglutinacio - склеивание) внешне проявляется в склеивании и выпадении в осадок корпускулярных антигенов: бактерий, эритроцитов, а также частиц с адсорбированными на них антигенами под влиянием антител в среде с электролитом. Реакция протекает в две фазы. В первой фазе происходит специфическая адсорбция антител на поверхности клетки или частицы, несущей соответствующие антигены, во второй - образование агрегата (агглютината) и выпадение его в осадок, причем этот процесс происходит только в присутствии электролита (раствор хлорида натрия). Механизм реакции агглютинации описывается теорией решетки, согласно которой агглютинат образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой одного антигена, а второго активного центра - с детерминантной группой другого антигена. Избыток или недостаток антител препятствует проявлению агглютинации. Для постановки реакции агглютинации используют корпускулярные антигены (суспензии бактерий, эритроцитов). Характер и скорость реакции зависят от антигенного строения. бактериальной клетки. Мелкозернистую О-агглютинацию дают бактерии, лишенные жгутиков. О-агглютинация протекает медленно. При наличии Н-антигена реакция проявляется в образовании крупно-хлопьевидного осадка и протекает значительно быстрее.
Реакция агглютинации недостаточно специфична и чувствительна. По данным признакам она уступает другим серологическим реакциям (преципитации, связывания комплемента и т.д.). Повысить специфичность и чувствительность реакции можно путем разведения исследуемой сыворотки до ее титра или половины титра. Титром сыворотки называется то ее максимальное разведение, в котором обнаруживается агглютинация антигена. Чем выше титр сыворотки, тем достовернее результаты реакции. Чтобы дифференцировать причину положительной реакции (ранее перенесенная инфекция, вакцинация или текущее заболевание), оценивают динамику нарастания титра антител, которое наблюдается только при текущей инфекции.
При наличии у разных бактерий одинаковых или сходных групповых антигенов они могут агглютинироваться одной и той же антисывороткой, что затрудняет их идентификацию. В таких случаях применяют реакцию адсорбции антител по Кастеллани. Данная реакция основана на способности родственных групп бактерий адсорбировать из антисыворотки групповые антитела при сохранении в ней типоспецифических антител. Полученные сыворотки называются монорецепторными, так как содержат антитела только к одному определенному антигену. Они применяются для детального изучен?/p>