Исследования иммунобиохимической лаборатории ГНУ СИБНИИЖ
Отчет по практике - Сельское хозяйство
Другие отчеты по практике по предмету Сельское хозяйство
ви и антигены обязательно контролируются на антикомплементарность [6].
Постановку основного опыта производят в пробирках путем внесения в нее определенных объемов сыворотки крови, антигена и рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при 37С в течение часа. Регистрацию результатов реакции проводят по гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана. Их приготавливают при смешивании гемолитической сыворотки кролика с эритроцитами барана. При внесении комплемента в эту смесь происходит реакция гемолиза. Таким образом, в тех случаях, когда комплемент не связывается с исследуемой системой антиген - антитело, т.е. остается свободным, наблюдается полный гемолиз бараньих эритроцитов, который свидетельствует об отрицательной реакции. Отсутствие гемолиза указывает на связывание комплемента системой антиген - антитело, т.е. на положительную реакцию, которая обозначается крестами. Интенсивность задержки гемолиза оценивается по четырехкрестной системе, при этом полное отсутствие гемолиза обозначается ++++.
Реакция иммунного лизиса. В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко - реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации Холерных и холероподобных вибрионов).
Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с антителами в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость - лаковую кровь вследствие выхода гемоглобина. При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента.
Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток. Количество клеток, секретирующих антитела - гемолизины, определяют по числу бляшек гемолиза, возникающих в агаровом геле, содержащем эритроциты, суспензию клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент.
Реакция иммобилизации. Способность антисыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана с реакцией между микробными антигенами и специфическими антителами в присутствии комплемента. Иммобилизующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях, возбудители которых являются подвижными микроорганизмами [6].
Реакции, протекающие с участием фагоцитов
Опсонофагоцитарная реакция проводится для определения способности антител и комплемента усиливать фагоцитоз. Антитела, стимулирующие фагоцитоз, называют опсоншами (греч. opsonion - готовить пищу). Опсонизация определяется тем, что антитела, присоединившиеся к микроорганизму, обуславливают его быстрое поглощение фагоцитом благодаря тому, что фагоцит обладает рецепторами для Fc-фрагмента иммуноглобулина, присоединившегося к микробной клетке. Комплемент тоже обладает опсонизирующими свойствами, так как фагоцит содержит рецепторы и к компонентам комплемента. Для количественной оценки опсонического эффекта определяют опсонический индекс - отношение показателей фагоцитоза неопсонизированных микроорганизмов к показателям фагоцитоза (фагоцитарный индекс и фагоцитарное число) после обработки фагоцитоза антителами и/или комплементом [6].
Реакции, протекающие с участием меченых антигенов или антител
Тесты основаны на выявлении взаимодействия антигена с антителом с образованием иммунного комплекса антиген - антитело по метке одного из участников реакций, выявляемой либо визуально, либо с помощью специальных высокочувствительных приборов, позволяющих количественно выявить меченый субстрат и, следовательно, искомый антиген или антитело. В качестве метки используют либо флюоресцирующий в ультрафиолетовом свете краситель (изоционат флюоресцеина), либо фермент (пероксидаза, щелочная фосфатаза), выявляемый по изменению окраски соответствующего субстрата (иммуноферментный анализ - ИФА), либо изотоп, выявляемый радиометрией (радиоиммунный анализ - РИА).
В отечественных лабораториях в течение многих лет используется иммунофлюоресцентный метод, разработанный Альбертом Кунсом и получивший его имя. Одна модификация метода, получившая название прямого метода Кунса, включает обработку материала на предметном стекле (мазок мокроты, срез ткани) меченой флюорохромом диагностической антисывороткой. Если на предметном стекле был искомый антиген, антитела фиксируются на антигене, и после отмывки стекла от несвязавшихся антител антиген выявляется в люминесцентном микроскопе по яркому свечению.
Другая модификация - непрямой метод Кунса - основан на использовании меченой антиглобулиновой сыворотки. От прямого метода Кунса этот вариант отличается тем, что используется немеченая диагностическая сыворотка, а ее присоединение к антигену выявляется с помощью меченой антиглобулиновой сыворотки, выявляющей иммуноглобулин немеченой диагностической сыворотки, присоединившийся к искомому антигену.
Более современные методы выявления антигенов либо антител имеют множество вариантов. Большинство из них используют твердофазную технологию, основанную на том, что один из стандартизованных к?/p>