Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул
Курсовой проект - Биология
Другие курсовые по предмету Биология
?ческими данными нормолипемии
Рис. 10. Зависимость концентраций основных фракций модифицированных ЛП в преципитатах объединенной сыворотки (n = 11) от концентрации ПЭГ-6000
Таблица 2. Результаты анализа по определению спектра общих сывороточных ЛП в объединенной сыворотке крови пациентов с нормолипемией (n = 11). Средний возраст пациентов 38 лет
Фракции и подфракции ЛПКонцентрации ЛП (по холестерину)Результаты анализаНормолипемия, n = 120 [13]мг/длмМоль/лмг/длмМоль/лЛПВП319,60,5110 250,25 0,65ЛПВП226,50,6930 500,75 1,30ЛПВП (фракция)46,11,1940 751,00 1,95ЛПНП1-399,92,5960 801,55 2,10ЛППП22,00,5720 300,50 0,75ЛПНП (фракция)122,03,1680 1102,10 2,85ЛПОНП3-55,80,1510 150,25 0,40ЛПОНП1-21,20,031 50,02 0,13ЛПОНП (фракция)7,00,1810 200,25 0,50Общие концентрации липидовОбщ ХС175,04,53150 1903,80 4,95Общ ТГ132,11,4990 1501,02 1,70
Примечание: ЛПВП3, ЛПВП2 - подфракции ЛП высокой плотности (ЛПВП); ЛПНП1-3, ЛППП - подфракции ЛП низкой плотности (ЛПНП); ЛПОНП3-5, ЛПОНП1-2 - подфракции ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП).
ЛП ЛПЛПВП3ЛПВП2ЛПВПЛПНП1-3ЛПППЛПНПЛПОНП2ЛПОНП1ЛПОНПЛП(Все)Общ. ЛП, мг/дл19,027,146,199,922,0122,05,81,27,0175,1Мод. ЛП, мг/дл7,412,920,375,714,890,55,30,96,2117,0Ст. мод., %38,947,644,075,867,374,291,475,088,666,8
Таблица 3. Сравнительные данные о концентрациях фракций модифицированных ЛП в объединенной сыворотке после преципитации с различными ПЭГами. Анализ методом МУРР
Полиэтиленгликоли (ПЭГ)ЛПВП, мг/длЛПНП, мг/длЛПОНП, мг/длОбщ. ХС, мг/длКонцентрации ЛП по холестеринуПЭГ 1000 (42%)19.6 0.969.9 2.21.7 0.191.2 1.6ПЭГ 4000 (42%)14.2 0.991.2 2.57.9 0.7119.3 2.8ПЭГ 6000 (8%)20.3 1.190.5 2.07.2 0.8118.0 2.7ПЭГ 8000 (16%)20.5 1.185.6 2.97.6 0.6113.7 2.5Степень модификации ЛП (по преципитации с ПЭГ-6000), %ПЭГ 600044.074.110067.4
Видно, что полученные результаты действительно близки к нормальным значениям концентраций ЛП.
В табл. 3 и на рис. 10 приведены конечные результаты титрования методом МУРР цельной объединенной сыворотки крови различными ПЭГ при концентрациях, при которых термодинамическое равновесие смещается в сторону образующихся комплексов и происходит их осаждение (преципитация).
Было важно определить диапазоны концентраций ПЭГ, при которых происходит полная преципитация всех основных фракций модифицированных ЛП.
4.Обсуждение результатов
Как видно из рис. 7-8, значения параметров I(0) и размеров (Rg) образующихся комплексов ПЭГ-белки в смесях сначала почти линейно увеличиваются при повышении концентрации ПЭГ до 10 мг/мл (1%), а затем рост размеров комплексов замедляется и почти полностью прекращается, а значения I(0), наоборот, начинает резко возрастать. Также следует отметить, что полученные в экспериментах кривые титрования объединенной сыворотки различными ПЭГ заметно отличаются между собой.
Для получения информации о молекулярных механизмах взаимодействия ПЭГ с сывороточными белками использовали экспериментальные данные СР, приведенные на рис. 7-8, и рассчитанные из них значения параметра 1014*I(0)/Rg6, пропорционального среднему значению физического титра комплексов ПЭГ-белки в смесях сыворотки крови с ПЭГ (см. рис. 9). Действительно, поскольку I(0) ~ n M2 ~ n V2, где M и V - средние молекулярные массы и объемы образующихся комплексов, то отношение I(0)/Rg6 с точностью до калибровочного коэффициента характеризует значение физического титра комплексов ПЭГ-белки в смесях. Из рис. 9 видно, что после первых же порций ПЭГ в смесях титр резко падает (это связано с образованием более крупных комплексов из отдельных сывороточных белков и аутоиммунных комплексов). Далее процесс падения замедляется, а при концентрациях 10 мг/мл и выше начинается резкое увеличение титра комплексов но, как видно из рис. 10, размер комплексов при этом остается почти неизменным. Следует отметить, что в отличие от графиков рис. 7 и 8, графики физического титра комплексов ПЭГ-белки на рис. 9 почти совпадают между собой. Поскольку представленные на рис. 7-9 экспериментальные данные соответствуют допреципитационным (равновесным) стадиям взаимодействия сыворочных белков с ПЭГ, то все они свидетельствуют о сходстве их молекулярных механизмов взаимодействия.
Как видно из рис. 10, при концентрациях ПЭГ-6000 в диапазоне 6 8% (60 80 мг/мл) происходит полная преципитация фракций модифицированных ЛП в нативной объединенной сыворотке крови и при дальнейшем увеличении концентрации ПЭГ-6000 эффект преципитации остается неизменным. А вот для других ПЭГ, а именно, ПЭГ-1000, 4000 и 8000 преципитация фракций модифицированных ЛП происходит при значительно более высоких концентрациях соответствующих ПЭГ и при том не полная (см. табл. 3). Для ПЭГ-20000 эксперименты с применением методов СР и МУРР вообще не удалось провести из-за сильной агрегации этого ПЭГ с сывороточными белками уже при самых малых концентрациях ПЭГ, в результате чего также резко повышается вязкость растворов. Поэтому применение именно ПЭГ-6000 для целей препаративного выделения и анализа модифицированных ЛП вполне обосновано [1-3]. Кроме того, подтвердились данные, что концентрация ПЭГ-6000, при которой происходит полное отделение модифицированных ЛП от немодифицированных, равна 6-8% [1, 2].
В табл. 3 приведены значения степени модификации фракций ЛП используемой в работе объединенной сыворотки пациентов с нормолипемией. Степень модификации наименьшей оказалось у фракции ЛПВП (44%), а наибольшей - у ЛПОНП (~100%) и в целом около 68% ЛП оказались чужеродными ЛП. Такой результат не соответствует ранее полученным данным [3, 4, 21], где только около 40% ЛП модифиц?/p>