Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул
Курсовой проект - Биология
Другие курсовые по предмету Биология
путем добавления сухого NaNO3, используемого в качестве контрастера.
При титровании сывороток крови ПЭГ методом светорассеяния пластмассовую или стеклянную цилиндрическую кювету заполняли буферной смесью (физиологический раствор, 750 мкл, pH 7,4). Далее добавляли 100 мкл сыворотки и тщательно перемешивали, после чего производили титрование растворами ПЭГ по 5 или 10 мкл вплоть до достижения запланированных конечных концентраций. При каждой концентрации ПЭГ производили измерение интенсивностей рассеянного света (по четырем точкам углов рассеяния). Из полученных данных с использованием специальной программы вычислялись средние значения радиусов инерции (Rg) образованных комплексов ПЭГ - белки, а также значения интенсивностей светорассеяния в нулевом угле (I(0)) [14, 15].
3. Результаты
.1 Экспериментальные данные по светорассеянию
На рис. 4 приведена индикатрисса светорассеяния от стандартного образца в координатах Гинье (ln I(h), h2). Видно, что точки индикатриссы рассеяния хорошо соответствуют линейному графику и высокой монодисперсности частиц латекса. Значение радиуса инерции (Rg = 912 15 А), вычисленное из наклона этого графика оказалось близко к ожидаемому (Rg = 906 А) для данного стандартного образца (частицы стандартизованного латекса - однородные сферы).
Для изучения особенностей взаимодействия различных ПЭГ с белками сывороток крови нами были выбраны ПЭГ с молекулярными массами от 1000 до 20000 Да. Были приготовлены растворы ПЭГ в физрастворе с максимальными концентрациями (с учетом их растворимости). Для удобства экспериментов необходимо было привести все ПЭГ к одной объемной концентрации. Для этого измеряли индикатриссы светорассеяния от каждого из приготовленных исходных растворов ПЭГ. Как и следовало ожидать, для частиц в растворе с молекулярными массами от 1 до 20 кДа индикатриссы светорассеяния практически не отличались от констант (из-за соотношения длины волны света (4300 А) и размера молекул ПЭГ (20-100 А)). Поскольку известно, что , где С, М - концентрация и средняя молекулярная масса рассеивающих частиц, соответственно, то это позволяет определять необходимые коэффициенты разведения [15]. На рис. 5 приведены графические зависимости экспериментальных интенсивностей светорассеяния в нулевой угол (I(0)) до и после приведения их к одной концентрации.
Рис. 4. График Гинье для стандартного образца (Daw Latex, Sigma, полистерин, диаметр частиц 2R = 0,234 мкм). .
Рис. 5. Зависимость интенсивностей светорассеяния в нулевом угле (I(0)) для различных ПЭГ в исходном (черные точки) и приведенном состоянии концентраций (светлые кружочки).
(кроме ПЭГ-20000, у которого предельная концентрация разведения оказалась существенно ниже, чем у других ПЭГ). Таким образом, все концентрации используемых ПЭГ были приведены к концентрации 250 мг/мл, что соответствует примерно 25% объемной и весовой концентрации.
Таблица 1. Результаты титрования объединенной сыворотки ПЭГ-6000. Объем исходного буфера V = 750 мкл (метод светорассеяния)
Угол светорассея- ния 2?, градОбъемы компонентов смесей, мклСывороткаПЭГ-6000+100+5+10+15+20+25+30+35+40+45Интенсивности светорассеяния, имп/сек33,751084114712169721999621939257273015337964421016515845,00930012149141261643817703208302457929853431905307456,257182776880508644877698401092813082151252511267,506668706472287645767084699366108321445520243Средние значения параметровI(0), имп/с128121933623837294663352340619492676357773792106617Rg, А863101110991168122112571293130312881285
Рис. 6. Графики Гинье для объединенной сыворотки, титруемой ПЭГ-6000 (метод светорассеяния). Нижние графики соответствуют меньшим концентрациям ПЭГ-6000, а верхние - большим, соответственно
Рис. 7. Значения интенсивностей светорассеяния (I(0)) от комплексов ПЭГ-белки, образующихся в объединенной сыворотке крови при взаимодействии сывороточных белков с различными ПЭГ
Рис. 8. Средние значения радиусов инерции (Rg) комплексов ПЭГ-белки, образующихся в объединенной сыворотке крови при взаимодействии сывороточных белков с ПЭГ-4000, ПЭГ-6000 и ПЭГ-8000
Рис. 9. Значения параметра 1014*I(0)/Rg6, пропорционального среднему физическому титру комплексов ПЭГ-белки, образующихся в объединенной сыворотке крови при взаимодействии сывороточных белков с ПЭГ различной молекулярной массы
На рис. 7-8 приведены сводные графики изменения средних значений параметров I(0) и Rg при титровании объединенной сыворотки (разведение в буфере 1:16) различными ПЭГ.
Для получения дополнительной информации о молекулярных механизмах взаимодействия ПЭГ с сывороточными белками на рис. 9 приведены графики рассчитанных значений параметра 1014*I(0)/Rg6, пропорционального среднему значению физического титра комплексов ПЭГ-белки в смесях сыворотки крови с ПЭГ.
3.2 Анализ общих и модифицированных ЛП методом МУРР
Далее были исследованы реакции взаимодействия сывороточных белков с различными ПЭГ при концентрациях, при которых достигается эффект осаждения. Этот эффект и будет использоваться нами далее для препаративного отделения модифицированных ЛП от общих.
Для анализа общих и модифицированных ЛП методом МУРР также использовали объединенную сыворотку от 11-ти пациентов с нормолипемией. Подготовку образцов к измерениям, измерения рентгенограмм МУРР и математическую обработку данных проводили, как описано в работах [16-21]. В табл. 2 приведены результаты анализа по определению концентраций фракций и подфракций общих сывороточных ЛП в объединенной сыворотке крови. Из сравнения со статист?/p>