Использование дифракционных методов для анализа структуры, фракционного состава и равновесных взаимодействий биологических макромолекул
Курсовой проект - Биология
Другие курсовые по предмету Биология
к условиям плоской волны. Величина проекции первичного пучка в плоскости приемника, а в сочетании с выбранным расстоянием от образца до детектора и тот наименьший угол 2?min (соответственно hmin), начиная с которого ведутся измерения интенсивности рассеянного излучения, и определяют разрешение конкретной коллимационной системы. Таким образом, верхний предел размеров неоднородностей, которые могут быть исследованы на данных установках (дифрактометрах), определяется углом 2?min, а нижний предел разрешения всегда соответствует величине 2? = 180о [14, 15].
2. Описание экспериментов
.1 Измерение рентгенограмм рассеяния от анализируемых образцов
Измерения малоугловых рентгенограмм проводили на дифрактометре фирмы Siemens (Германия) методом пошагового сканирования с использованием гониометра и рентгеновского сцинтилляционного детектора [14]. Малоугловые рентгенограммы измеряли в угловом диапазоне: h = 0.013 - 0.22 А-1, где h = 4 • ? • sin(?)/?; 2? - угол рассеяния. Для измерения рентгеновского рассеяния использовалась кювета из кварцевого капилляра диаметром 0.65 мм и с толщиной стенок 0.01 мм, установленная в металлическую оправу. Длина волны используемого излучения ? = 1.54 А, температура образцов при измерении рентгенограмм 20оС. Непосредственное измерение рентгенограмм МУРР проведено в.н.с. ГНЦ ВБ Вектор Тузиковым Ф.В., имеющим соответствующие допуски работы с рентгеновским оборудованием. В рентгенограммы вносились поправки на фоновое рассеяние, поглощение, коллимацию, проводилось сглаживание. Первичная математическая обработка экспериментальных данных МУРР и вычисление функций распределения сферических частиц по размерам выполнялись на ЭВМ PC по алгоритмам, описанным в [14], а также с использованием процедур оптимизации.
На рис. 3 приведена общая схема дифрактометров, в частности, малоуглового дифрактометра.
Рис. 3. Общая схема дифрактометров. 1 - источник излучения (рентгеновская трубка, лазерный источник) с коллиматором; 2 - анализируемый образец; 3 - падающий пучок излучения; 4 - рассеянное рентгеновское или световое излучение, вызванное образцом 2; 5 - приемная щель; 6 - рентгеновский или световой детектор (приёмник рассеянного излучения)
Чтобы исключить рассеяние рентгеновских лучей другими (кроме ЛП) белками крови, в анализируемые образцы плазмы предварительно вводили нейтральное (для структуры биополимеров) рентгеноконтрастное вещество - NaNO3, создавая плотность, равную средней плотности гидратированных белков. Плотность растворителей в образцах обеспечивали с помощью формулы [16-20]: m = V • (?0 - ?с) • ?к/(?к - ?0), где V, ?0 - объем и требуемая конечная плотность растворителя в образце (в сыворотке, плазме и контрольном буфере); ?с - исходная плотность жидкого образца; m, ?к - масса и плотность используемого сухого вещества-контрастера. Плотность растворителей контролировали пикнометрически. В сыворотках крови учитывали их разбавление за счет объема вещества сухого контрастера и вводили соответствующие поправки на концентрацию.
2.2 Измерение индикатрисс светорассеяния
Прибор для измерения светорассеяния от анализируемых образцов (световой дифрактометр) состоял из одного фотодетектора и 14 лазерных монохроматических источников, установленных по внутреннему периметру камеры светорассеяния. В центр камеры помещали образец, а управление установкой и получение значений интенсивности производили при помощи компьютера. При этом поочередно включались лазерные источники и рассеянное излучение попадало в фотоприемник (детектор), после чего сигнал с приемника поступал на фотоэлектронный умножитель, откуда через аналоговый цифровой преобразователь передавался на компьютер. Индикатриссы светорассеяния измеряли в угловом диапазоне 2? = 33,75 67,50 (h = 0.0011 0.0022 А-1), где h = 4 • ? • n ? sin(?)/?; n - показатель преломления буферной смеси (~1,35). Длина волны используемого светового излучения ? = 4300 А, температура образцов при измерении индикатрисс 200С. В индикатриссы вносили поправки на фоновое рассеяние и поглощение излучения образцом.
Калибровку прибора проводили для контроля влияния факторов, влияющих на точность измерений эффектов светорассеяния (состояние чистоты кюветы, аппаратные искажения и помехи). Для этого регулярно измерялись индикатриссы рассеяния (зависимости интенсивности рассеяния от угла) для стандартного образца (Daw Latex, Sigma, полистерин, диаметр частиц 2R = 0,234 мкм). Известно, что радиус инерции (Rg) и радиус (R) для однородной сферы связаны, как [14].
Для всех полученных в работе экспериментальных данных был проведен математический и статистический анализ. Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента для средних арифметических (результаты считали достоверными при Р < 0,05).
2.3 Титрование сывороток крови полиэтиленгликолями
Для титрования и анализа модифицированных ЛП методом МУРР предварительно в сыворотки и плазмы крови добавляли растворы ПЭГ до необходимой концентрации, после чего эти смеси инкубировали при 8оС в течение 18 ч [1, 2]. Осадки отделяли центрифугированием (центрифуга Т-51, Германия) при 6000 об/мин в течение 30 мин. Для растворения осажденных иммунных комплексов к осадку добавляли физиологический раствор (pH 7,4) в объеме исходной сыворотки [3]. Окончательную диссоциацию иммунных комплексов, включающих и модифицированные ЛП, проводили