Симбионтное пищеварение у кроликов и пути увеличения использования углеводов кормов
Диссертация - Сельское хозяйство
Другие диссертации по предмету Сельское хозяйство
?й ряд).
При идентификации учитывались такие показатели, как солеустойчивость, способность образовывать аммиак, индол, сероводород, каталазу, редуцировать нитраты, морфология и размеры клеток и колоний, подвижность, склонность к споро- и капсулообразованию, отношение к окраске по Грамму.
Однако использование одних культуральных методов недостаточно для выяснения общей динамики численности микрофлоры в возрастном аспекте и при изменении характера питания.
Это обстоятельство связано с тем, что микроорганизмы-симбионты кроликов далеко не однородны по своему составу и принадлежат к различным таксономическим группам, требующим для своего роста и развития соответствующих питательных сред, а также строгого анаэробиоза.
Считается, что культурально можно выделить лишь 15-20% от общей численности кишечной флоры.
Существенным недостатком культуральных методов является также значительная вариабельность получаемых данных. В связи с этим, мы в своих исследованиях применили также метод прямой микроскопии с дифференцированным окрашиванием мазков.
Подсчет численности микроорганизмов производился методом Брида. Для приготовления мазка химус разводился физраствором в отношении 1:500. Полученный материал микропипеткой объемом 0,02 мл наносился на предметное стекло и равномерно распределялся по площади 4 см2 . Мазок высушивался, фиксировался над пламенем горелки и окрашивался по Грамму в модификации Хукера. Препарат просматривался под масляной иммерсией (не менее 100 полей зрения) при увеличении 1350.
Кроме дифференциальной окраски по Грамму, для подсчета численности иодофильных бактерий была применена окраска раствором Люголя, для обнаружения спор - метиленовой синью по Леффлеру, капсул - контрастный мазок с тушью.
Активность амилазы (К.Ф. 3.2.1.1) в химусе слепой кишки регистрировали фотометрически (Асатиани В.С., 1965); протеаз - методом Мура и Стейна в модификации А.М. Уголева (1969), основанном на учете количества освобожденных L-аминокислот по реакции с нингидрином (субстрат - казеин по Гаммерстену); уреазы (К.Ф. 3.5.1.5) - по Самнеру и Соммерсу с последующим определением аммиака по Расселу; эндоглюканазы (К.Ф. 3.2.1.4) - вискозиметрически, по начальной скорости уменьшения относительной вязкости раствора карбоксиметилцеллюлозы (Клесов А.А. с соавт., 1980); липазы (К.Ф. 3.1.1.3) - титрометрическим методом Альтгаузена.
Техника определения активности амилазы состоит в том, что в пробирки А и Б добавляют по 5 мл 2 % раствора растворимого крахмала, 3 мл фосфатного буфера (рН 7,2) и 1 мл 0,5 н раствора хлорида натрия, а в пробирку В - 5 мл воды, 3 мл буфера и 1 мл раствора хлорида натрия. После прогрева на водяной бане (38 С) в пробирку А приливают 1 мл раствора фермента. Через 30 мин инкубации во все пробирки добавляют по 2 мл 1 н раствора соляной кислоты, а в пробирки Б и В по 1 мл раствора фермента и отмеряют по 2 мл полученной смеси из каждой пробирки в колбы с меткой на 500 мл, содержащие 400 л воды и 5 мл 1 н раствора соляной кислоты. В каждую колбу вносят 1 мл 0,3 % раствора йода в 3 % йодистом калии, доводят водой до метки и колориметрируют при ?=620 нм (гальванометр устанавливают на 100 по кювете с раствором В). Расчет активности производят по формуле:
(мг расщепленного крахмала).
Методика определения протеаз состоит в том, что 50 г сухого казеина по Гаммерстену, перемешанного с 2 мл раствора фермента (1 мл химуса + 1 мл физраствора) помещенные в пробирку инкубируют при 38 С в течение 20 мин, добавляют 3 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белков (10 мин при помешивании) и фильтруют. Контрольная проба содержит те же ингредиенты, но не инкубируется. Стандартная проба приготавливается смешиванием 3 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 2 мл 0,2 % раствора глицина. По 0,1 мл фильтрата из каждой пробы смешивают с 1 мл раствора нингидрина, приготовленного в равных объемах метилцеллосольва и цитратного буфера и помещают на кипящую водяную баню на 20 мин. После этого пробы охлаждают, приливают по 5 мл смеси пропилового спирта с водой (1:1) и через 15 мин колориметрируют (?=570 нм). Активность (прирост глицина в мкг за 1 мин) выражают по формуле:
? 4.
Для определения активности уреазы 1 мл источника фермента инкубируют в течение 20 мин при 38С с 4 мл 2 % раствора мочевины в фосфатном буфере (рН 7). После инкубации добавляют 2 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты, фильтруют и в 5 мл фильтрата определяют аммиак по Расселу или Конвею.
Для определения эндоглюканазы навески химуса (около 100 мг) помещали в центрифужные пробирки с 1 мл раствора глицерина (50:50) с добавлением тимола в качестве консерванта. Пробирки выдерживались в холодильнике при +10С для экстрагирования целлюлаз в течение 1-2 месяцев и центрифугировались 10 мин при 3000 об/мин. Для приготовления раствора субстрата 1,5 г карбоксиметилцеллюлозы добавляли к 100 мл натрий-ацетатного буфера (0,05 М, рН 4,5), содержащего 0,1 М раствор хлорида натрия, перемешивали 1 ч на магнитной мешалке с подогревом до 50-60 С, центрифугировали при 8000 об/мин и отделяли декантацией прозрачный раствор. Раствор разводили тем же буфером до рабочей концентрации 0,2-0,4 % (время истечения из вискозиметра должно составлять 100-120 с). В сухой вискозиметр Оствальда, помещенный в прозрачный термостатируемый сосуд (40С) вносили 5 мл раствора субстрата и через 3-5 мин фиксировали время его истечения. Затем в субстрат вводили 0,02 мл раствора ферментного препарата, тщательно перемешивая содержимое вискозиметра пробулькиванием воздухом, и фиксировали врем?/p>