Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
Рисунок 1.20 - Химическая структура дигидрофизетина
Рисунок 1.21 - Химическая структура физетина
Шифт-проба с ацетатом натрия для дигидрокемпферола (рисунок 1.14) приводит к батохромному сдвигу полосы II на 36 нм, что соответствует наличию 7-ОН-группы во флаванонолах (см. табл. 6). В то же время артеметин, в структуре которого присутствуют замещенные (метилированные) гидроксильные группы в положениях 7 и 4', не дает положительной шифт-пробы с ацетатом натрия (отсутствует батохромный сдвиг полосы 1) (рисунок 1.19).
Широко используемой является реакция взаимодействия флавоноидов с хлоридом алюминия. Флавоноиды способны образовывать комплексные соединения с включением ионов А13+. Считается, что в образовании комплекса с ионами металлов могут участвовать три центра в структуре молекулы флавоноида (рисунок 1.23).
Рисунок 1.22 - УФ-спект дигидрофизетина и физетина с добавлением шифт-агента
Рисунок 1.23 - Возможные центры хелатирования флавоноидами ионов металлов
В результате комплексообразования в УФ-спектрах поглощения наблюдается сильный батохромный сдвиг полос поглощения I или II в зависимости от типа флавоноидного соединения (таблица 1.7). Для определения центров комплексообразования - снимают спектр (1) метанольного раствора исследуемого раствора исследуемого вещества. К аликвоте метанольного раствора исследуемого вещества добавляют 2-3 капли 5%-го метанольного раствора А1С13 и снимают спектр (2). Спектры (1) и (2) сравнивают между собой [13].
Например, в УФ-спектре кверцетина максимум полосы I сдвигается с 375 до 435 нм (батохромный сдвиг) и соответственно раствор приобретает яркое желтое окрашивание. На этом основано использование спиртового раствора AlCl3 в качестве проявляющего реагента в ТСХ флавоноидов.
Для рамнетина, в молекуле которого в комплексообразовании могут участвовать три центра, шифт-проба с AlCl3 приводит к батохромному сдвигу полосы I на 80 нм (рисунок 1.17), а в артеметине, где возможность комплексообразования ограничена одним центром, поскольку имеется только одна свободная ОН-группа в положении 5, батохромный сдвиг в результате шифт-пробы с А1С13 составляет 32 нм (рисунок 1.15). Отсутствие в молекуле 5-ОН-группы и возможность участия в комплексообразовании только двух других центров, как это показано на рисунке 1.22 на примере физетина, приводит тем не менее к довольно большому батохромному сдвигу - на 96 нм.
Таблица 1.7 - Шифт-проба с хлоридом алюминия
Группа флавоноидовПолоса поглощенияСдвиг, нмДетектируемый структурный признакФлавоны ФлавонолыI35-70 Нет сдвигаСвободные 5-ОН-и/или 3-ОН-группы Отсутствуют или амещены 3-ОН-и/или 5-ОН-группыФлаваноны Флаванонолы ИзофлавоныII10-25Свободная 5-ОН-группаХалконы АуроныI I40-64 60-70Свободная 2-ОН-группа Свободная 4-ОН-группа Для дигидрофлавонолов в целом шифт-пробы с А1С13 характеризуются меньшими бахромными сдвигами. Например, в случае дигидрокемферола бахромный сдвиг равен 25 нм (рисунок 1.15), а дигидрофизетина - 31 нм (рисунок 1.22).
Наибольший батохромный сдвиг соответствует комплексообразованию с одновременным участием всех трех потенциальных центров молекулы (рисунок 23). При этом более прочными считаются комплексы, образованные с участием карбонильной группы и 5-ОН- и/или 3-ОН-группами. Комплекс с 3',4'-дигидроксигруппировкой в кольце В нестабилен, легко разрушается в слабокислой среде и соответственно при этом уменьшается батохромный сдвиг, что, в свою очередь, служит тестом для обнаружения этой дигидроксигруппировки в молекуле. Так, для рамнетина шифт-проба с А1С13 + НС1 приводит к уменьшению батохромного сдвига на 28 нм по сравнению с шифт-пробой с А1С13 (рисунок 1.17).
Проблема состава комплексов флавоноидов с ионами металлов является предметом многочисленных научных исследований и нельзя сказать, что она решена и в настоящее время. Доказано, что хелатирование кверцетина с А13+ происходит только по двум центрам: во-первых, с участием 4-оксогруппы и 3-ОН-группы и, во-вторых, с участием 3',4'-дигидрокси - группировки (рисунок 1.24 и 1.25) [13].
Рисунок 1.24 - Центры хелатирования комплексов кверцетина с хлоридом алюминия
- кверцетин; 2 - кверцетин-А1С13 (2:1, моль); 3 - кверцетин-А1С13 (0,1:1, моль)
Рисунок 1.25 - УФ-спектр комплексов кверцетина с хлоридом алюминия:
Гидроксильная группа в положении 5 не участвует в хелатировании в силу своей низкой кислотности. Образование хелата с участием 5-ОН- и 4-оксогруппы стерически затруднено из-за возникновения в молекуле соседнего хелата.
В настоящее время происходит смена приоритетов и зачастую сложные структурные вопросы решаются уже более коротким, но более технически оснащенным путем за счет высокоразрешающих современных физико-химических методов [13].
1.3.4 Комбинированные методы исследования флавоноидов
Широкое распространение в анализе получили комбинированные методы, включающие предварительное хроматографическое разделение на бумаге, в тонком слое с последующим определением веществ в элюатах из пятен хроматограмм, а также непосредственным сканированием оптической плотности или определением площади пятна па хроматограмме [10].
1.3.4.1 Хроматомасспектрометрическое определение флавоноидов
Хроматомасспектрометрия - метод анализа смесей, преимущественно органических веществ, и определения следовых количеств веществ в объеме жидкости . Метод основан на комбинации двух самостоятельных методов - хроматографии