Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
?товерности экстракции, подготовки образца, хроматографической процедуры. В качестве стандартного вещества для флавоноидов часто используется рутин, являющийся коммерческим доступным продуктом. Он хорошо подходит для количественного анализа флавоноловых гликозидов. Для содержащихся в смеси других флавоноидов могут быть использованы такие коммерчески доступные стандарты, как апигенин-7-глюкозид - для флавоновых гликозидов, катехин - для флаван-3-олов, нарингенин - для дигидрофлавонов, дигидрокверцетин - для дигидрофлавонолов, даидзеин - для изофлавонов [13,14].
Для количественного анализа строится кривая зависимости концентрации флавоноида от площади пика для каждого стандарта в тех же самых хроматографических условиях (длина волны, растворитель), которые применяются по отношению к исследуемой смеси. Соответствующие калибровочные кривые могут быть использованы для расчета количества флавоноида, представляемого каждым пиком ВЭЖХ хроматограммы. В настоящее время практически исчезла надобность в построении калибровочных кривых в связи с обеспечением хроматографов компьютерной системой обсчета площадей пиков [13,14].
На примере хроматографирования смеси флавонов и флавонолов в обращенно-фазном варианте (рисунок 1.5) показано, что порядок выхода флавоноидов коррелирует с числом гидроксильных групп, а именно: время удерживания возрастает по мере снижения числа гидроксильных групп в молекуле.
Хроматографические условия: колонка Sep-Pak C-18, градиентный режим: метанол - 5 мМ, H3PO4.
Рисунок 1.5 - Хроматограмма смеси флавоноидов
Описание пиков и времени удерживания представлены в таблице 1.3.
Таблица 1.3 - Время удерживания различных флавоноидов
ПикиЧисло ОН-группВремя удерживания, мин1 - мирицетин111.52 - кверцетин219.53 - лютеолин323.04 - кемпферол431.05 - апигенин533.5
1.3 Количественное и качественное определение флавоноидов
1.3.1 Химические методы исследования флавоноидов
.3.1.1 Методы качественной идентификации флавоноидов
Для обнаружения различных видов флавоноидов используются качественные реакции. Они необходимы для подтверждения нахождения той или иной структуры на этапе идентификации флавоноидов. Наиболее характерными реакциями являются следующие:
)Цианидиновая проба (проба Шинода)
Общей реакцией на флавоноидные соединения является цианидиновая проба (рисунок 1.6), проводимая с помощью концентрированной соляной кислоты и металлического магния. Действие водорода в момент выделения приводит к восстановлению карбонильной группы и образованию ненасыщенного пиранового цикла, который под действием соляной кислоты превращается в оксониевое соединение, имеющее окраску от оранжевой (флавоны) до красно-фиолетовой (флаваноны, флавонолы, флаванонолы) [4].
Рисунок 1.6 - Цианидиновая проба
Изменение условий восстановления путем замены магния на цинк приводит к изменению окраски. При использовании цинка положительную реакцию дают флавонолы и флавонол-3-гликозиды, а флаваноны не обнаруживают ее.
Цианидиновую реакцию не обнаруживают халконы, ауроны, но при добавлении концентрированной соляной кислоты (без магния) образуют красное окрашивание за счет образования оксониевых солей.
Для постановки реакции 1 г порошка сырья заливают 10 мл 95% этанола, нагревают на водяной бане до кипения и настаивают 3 - 4 ч. Спиртовое извлечение фильтруют, упаривают до объема 2 мл, делят пополам и разливают в 2 пробирки; в каждую пробирку прибавляют по 3 капли концентрированной хлористоводородной кислоты. В 1-ю пробирку добавляют 0.03 - 0.05 г цинковой пыли и нагревают на водяной бане до кипения. Жидкость окрашивается в красный цвет. Во 2-й пробирке окрашивание отсутствует [4].
2)Борно-лимонная реакция (реакция Вильсона-Таубека)
5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с борной кислотой в присутствии лимонной (реактив Вильсона), образуют желтую окраску с красноватой флюореiенцией в УФ-свете. При замене лимонной кислоты на щавелевую (реактив Таубека) в УФ-свете отмечается зеленая или желтая флюореiенция (рисунок 1.7).
Рисунок 1.7 - Реакция Вильсона-Таубека
3)Реакция с треххлористой сурьмой
5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или желто-оранжевый цвет - флавоны, в красный или красно-фиолетовый - халконы (рисунок 1.8).
Рисунок 1.8 - Реакция с треххлористой сурьмой
Реакцией по Брианту (которая является модификацией пробы Шинода) можно отличить гликозиды от агликонов. Суть метода заключается в следующем: после проведения цианидиновой пробы к раствору добавляют октанол и взбалтывают. При наличии агликонов окраска переходит в органический слой.
) Образование фенолятов
Так как в своей структуре флавоноиды имеют фенольные гидроксилы, то им присущи химические свойства, соответствующие данной функциональной группе. Так, фенольные ОН-группы способны проявлять слабокислые свойства, образуя феноляты с основаниями.
) Взаимодействие со щелочами
Характерной реакцией на флавоноиды считается также их взаимодействие с щелочами. Флавоны, флавонолы, флаваноны и флаванонолы растворяются в щелочах с образованием жёлтой окраски, которая при нагревании изменяется до оранжевой или коричневой. Халконы и ауроны при взаимодействии со щелочами обычно дают красное или ярко-жёлтое окрашивание.
) Образование комплексов с солями метал