Разработка методики определения флавоноидов в лекарственном растительном сырье
Дипломная работа - Химия
Другие дипломы по предмету Химия
делят на бумаге.
Метод жидкостно-жидкостной хроматографии и, особенно, ВЭЖХ позволяет осуществлять качественный и количественный анализ всех видов флавоноидов.
Для разделения флавоноидов между собой и отделения от сопутствующих веществ используется адсорбционно-хроматографический метод [10].
1.2.4.1 Тонкослойная хроматография
Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) очень удобен для сравнительного анализа с использованием стандартных веществ.
Пятна флавоноидов на хроматограмме зачастую могут быть обнаружены просто при облучении пластинки УФ-светом. Широко используются методы обработки хроматограмм такими проявляющими (детектирующими) реагентами, как спиртовый раствор АlCl3, пары иода и концентрированная серная кислота (для силикагелевых слоев), а также нагревание (только для силикагелевых пластинок).
Метод ТСХ позволяет широко варьировать сочетание сорбента и подвижной фазы, подбирая наиболее оптимальный вариант для конкретного объекта (таблица 1.2).
Специфическим для хроматографии флавоноидов является полиамидный сорбент. Полиамидный сорбент (стационарная фаза), в зависимости от состава подвижной фазы, может проявлять двойственный характер, а именно выступать в роли полярной или неполярной фазы.
Соответственно разделение веществ может протекать либо как обычный распределительный (в водно-спиртовых элюентных системах), либо как обращенно-фазный распределительный (в элюентной системе метанол - хлороформ) процессы.
Таблица 1.2 - Типичные условия ТСХ анализа флавоноидов
Группа флавоноидовНеподвижная фаза (сорбент)Подвижная фаза (элюентная система растворителей)Флавоноидные гликозидыЦеллюлоза Бутанол - уксусная кислота - вода (3:1:1) трет-Бутиловый спирт - уксусная кислота - водаСиликагель Уксусная кислота (5 - 40%-я) Этилацетат - метилэтилкетон - метанол (5:3:1)ПолиамидМетанол - вода (8:2) Хлороформ - метанол (1: 1)Полярные гликоны (флавоны, флавонолы)Целлюлоза трет-Бутиловый спирт - уксусная кислота - вода Бутанол - уксусная кислота - вода (3:1:1) 50%-я уксусная кислотаСиликагель Бензол - уксусная кислота - вода (125:72:5) Толуол - ацетон - хлороформ (8:7:5) Хлороформ - ацетон - муравьиная кислота (9:2:1)ПолиамидХлороформ - метанол - уксусная кислота (9:1:0,1) Метанол - уксусная кислота - вода (18:1:1)Неполярные агликоны (дигидрофлавоны, изофлавоны, полиметилированные флавоны)Целлюлоза Уксусная кислота (10 - 30%-я) Хлороформ - метанол (15:1 или 3:1)СиликагельХлороформ - метанол (3:2)ПолиамидМетанол - вода (1:1)
Центром сорбции является амидная группировка полиамидной макромолекулы, например капрона. Хроматографируемые вещества образуют обратимые водородные связи между протонодонорной гидроксильной группой флавоноидного соединения и карбонильной группой амидного фрагмента.
Агликоны сорбируются на полиамиде прочнее, чем их гликозиды. Сорбция агликонов находится в пропорциональной зависимости от числа гидроксильных групп в молекуле, а также от их местоположения в молекуле [11, 12].
1.2.4.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография
Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является быстрым, хорошо воспроизводимым методом, который требует малого количества анализируемого вещества и используется для количественного, качественного анализа и препаративного выделения [13].
Для флавоноидов более употребительны колонки с обращенно-фазными сорбентами (RP-8; RP-18) и детектирование с помощью УФ-видимого детектора с переменной длиной волны. В настоящее время широко используется фотодиодный детектор, позволяющий одновременно с выделением пика на хроматограмме получать УФ-видимый спектр вещества, соответствующего этому пику. Такой экспериментальный прием значительно облегчает задачу идентификации веществ.
Подвижные фазы (элюентные системы), как правило, бывают бинарными и содержат подкисленный полярный компонент (водные растворы уксусной, перхлорной, фосфорной или муравьиной кислот) и менее полярный органический растворитель (метанол или ацетонитрил). Подвижная фаза может поступать в колонку как в изократическом, так и в градиентном режиме, когда в ходе процесса хроматографирования происходит во времени изменение соотношения компонентов подвижной фазы [13,14].
Градиентный режим наиболее подходит для разделения сложных смесей флавоноидов. Для колонок с обращенно-фазными сорбентами типичные градиентные программы основаны на использовании подвижных фаз с преобладанием на старте доли полярного растворителя с дальнейшим постепенным возрастанием доли менее полярного растворителя.
Соотнесение пика на хроматограмме с принадлежащим ему веществом является наиболее трудной задачей. Удобным приемом является использование параллельного хроматографирования хорошо известных, так называемых стандартных образцов и сравнение с ними хроматограммы исследуемого объекта. Стандартное вещество в идеале должно быть наиболее родственно флавоноидам и иметь подобные хроматографические свойства. В тех случаях, когда стандартное вещество хроматографируется в равных условиях, но параллельно, его называют внешним стандартом. Внутренний стандарт (добавляется в исследуемую пробу перед вводом в хроматограф) должен отвечать следующим условиям: в исследуемой смеси не должно содержаться аналогичное вещество и пик стандарта не должен перекрываться с каким-либо соединением в смеси. Такие ограничения отсутствуют в случае применения внешнего стандарта.
Преимуществами внутреннего стандарта является подтверждение до