Geum.ru
   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

ВЫСШИЕ УРОВНИ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМТИНА И РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА

Автореферат докторской диссертации по биологии

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
 Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 

В отличие от XCAP-D2, ХСАР-Е не обнаруживался в связи с мейотиче-скими хромосомами на III-VI стадиях созревания ооцитов. Эти ярко выраженнные различия в характере локализации ХСАР-Е в митотических и мейотиче-ских хромосомах, вероятно, связаны с тем, что диплотенные хромосомы нахондятся на более ранней стадии компактизации. Действительно, по мере созреванния ооцитов и компактизации мейотических хромосом ХСАР-Е постепенно понявляется в составе последних. Тем не менее, различия в хронологии ассоциации различных субъединиц конденсинового комплекса с мейотическими хромосоманми позволяет сделать вывод о том, что 8S коровый комплекс и 11S регулятор-ный комплекс в живых клетках могут существовать независимо друг от друга и сборка холокомплекса конденсина (по крайней мере, конденсина I) происходит не в цитоплазме, как предплагалось ранее, а непосредственно на хромосомах. При этом регуляторная субъединица pEg7/XCAP-D2, первой взаимодействую-

36


щая с хромосон

мами, рекрутирун

ет остальные

субъединицы.

Отсутствие клюн

чевых компоненн

това системы

компактизации

хроматина в мей-

отических хрон

мосомах на стан

дии диплотены,

по всей вероятн

ности, связано с

тем, что хрон

мосомы поддерн

живаются в дон

статочно декон-

денсированном

состоянии, тогда

как конденсины

и топоизомераза

II участвуют на

болееаа поздних

Phase /Ag

ь

XCAP-E

Х

жаа Х^^.а ^в^ь.

|аа V

LBCаа %Д

Б w

Picogreen

Merge

Х

Х

{аа

1

, $аа 1

fe

в

j

Х

Га 10pm

Рис. 18. XCAP-E не связан с мейотическими хромосомами и

окализуется перимущественно в ядрышках. (А) фазовый

контраст (Б) ХСАР-Е (В) ДНК (окраска Picogreen), (Г)

совмещение.______________________________________

этапах компактизации, или вообще не принимают участия в компактизации хронмосом, а требуются в большей степени для разделения сестринских хроматид.

Помимо мейотических хромосом, мы обнаружили ассоциацию субъединниц конденсина с различными нехроматиновыми структурами ядра. Так, ХСАР-D2 выявляется в составе телец Кахаля, где он колокализуется с коилином в мат-риксе, и никогда не обнаруживается в В-снурпосомах. Функциональное значенние ассоциации субъединиц конденсинов с тельцами Кахаля неясно, однако вынявление в тельцах Кахаля белков, участвующих в репликации ДНК (В24, МСМЗ, cdc21; Bucci et al, 1993; Albani et al, 1998), предполагает, что функция телец Кахаля не ограничивается исключительно созреванием компонентов синстемы транскрипции и сплайсинга, но может включать и контроль сборки/сонзревания/модификации белковых комплексов, участвующих в ремоделировании хроматина.

Локализация ХСАР-Е в ядрышке подтверждает наши данные, полученнные ранее на соматических клетках Xenopus XL-2 (Тимирбулатова и др., 2003; Uzbekov et al, 2003). Двойная окраска на ХСАР-Е и ДНК (с помощью высокончувствительного ДНК-специфичного флуорохрома PicoGreen) показала, что ХСАР-Е в ядрышке не связан с рибосомной ДНК и таким образом не может участвовать в структурной организации рибосомных генов. В дальнейших экс-

37


периментах были использованы антитела против маркерных белков гранулярнонго компонента (N038) и плотного фибриллярного компонента ядрышка (Nop-р180). Двойное окрашивание расправленных препаратов зародышевых пузырьнков этими антителами и антителами против ХСАР-Е продемонстрировало высонкую степень колокализации N038 и ХСАР-Е, тогда как сигналы ХСАР-Е и Nop-р180 практически не перекрывались, что свидетельствует в пользу преимущенственной ассоциации ХСАР-Е с гранулярным компонентом ядрышка. Эта ассонциация не нарушается при сегрегации ядрышек в ответ на ингибирование транскрипции под действием актиномицина D или DRB. Возможно, секвестри-рование 8S субкомплексов в ядрышке предотвращает их взаимодействие с регу-ляторными субъединицами, ассоциированными с профазными хромосомами и преждевременную сборку холокомплекса до завершения профазы I мейоза. Эта гипотеза хорошо согласуется с предложенной схемой двухступенчатой посадки конденсинового комплекса на хромосомы.

4. ВЫВОДЫ.

  1. Митотическая компактизация хромосом Ч многостадийный процесс, сопровождающийся формированием двух промежуточных уровней упаковки хроматина: 200-250 нм и 400 нм фибрилл, образующихся пунтем иерархической укладки хромонем диаметром 100 нм.
  2. Образование факультативного гетерохроматина при глобальная инакнтивации транскрипции Х-хромосомы сопровождается упаковкой хроматина в фибриллы диаметром 200-400 нм, при сохранении донступности внутренних областей хромосомной территории для транснфакторов
  3. На ультраструктурном уровне гетерохроматиновые репликативные сайты представляют собой сегменты хроматиновых фибрилл высшего порядка. Индивидуальные реплисомы равномерно распределены в объеме реплицирующихся доменов, не образуя компактных реплика-тивных фабрик. Репликация гетерохроматиновых локусов не требует полного разворачивания хромонемных фибрилл.
  4. Поперечная дифференцированность митотических хромосом на перинферическое гало и плотный осевой кор, выявляемая при помощи гипотонической обработки живых клеток, коррелирует с распределеннием эу- и гетерохроматина: транскрипционно-активный рано реплицирующийся хроматин располагается на периферии хромосом, а гетерохроматин занимает центральное положение.
  5. Активация транскрипции эухроматических генов сопровождается чанстичной деконденсацией высших уровней упаковки хроматина и транскрипция может осуществляться на высококонденсированной матрице.

38


  1. Транскрибирующиеся гены демонстрируют высокую локальную пондвижность, что указывает на отсутствие ассоциации транскрипционных комплексов с ригидными скелетными структурами клеточного ядра.
  2. Нарушение реконденсации митотических хромосом после гипотониченского воздействия in vivo в результате блокады транспорта Са++ через плазматическую мембрану свидетельствует о роли физиологических концентраций Са++ в поддержании высших уровней организации хронмосом.
  3. Конденсины и топоизомераза II не принимают участия в формированнии хромосомной оси в ходе профазной компактизации хромосом. Их роль в митотической компактизации хромосом связана со стабилизанцией метафазных хромосом, возможно, путем рекрутирования других архитектурных хромосомных белков.
  4. Нарушение связи конденсинов с метафазными хромосомами при индунцированной обратимой деконденсации, а также в процессе стабилизации конденсированного состояния хромосом при разрушеннии веретена деления свидетельствует о том, что конденсины не принимают участия в поддержании компактной структуры полностью сформированных хромосом.

10.В профазе мейоза I компактизация хроматина в осевых гранулах (хро-момерах) не требует присутствия 13S конденсина.

11.Сборка 13S конденсинового комплекса осуществляется непосреднственно на хромосомах (по крайней мере, в мейозе), причем XCAP-D2, по-видимому, связывается с хроматином первым и обеспечивает ренкрутирование остальных субъединиц.

12.Субъединицы конденсина локализуются в различных структурнно-функциональных доменах ядра независимо друг от друга. ХСАР-D2 связывается в осевыми структурами хромосом и тельцами Кахаля, тогда как ХСАР-Е взаимодействует с гранулярным компонентом ядрышек.

39


Список научных статей, опубликованных по теме диссертации:

  1. Belmont AS, Ни Y, Sinclair РВ, Wu W, Bian Q, Kireev I. Insights into Interphase Large-Scale Chromatin Structure from Analysis of Engineered Chromosome Regions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2010). 75: 453-460.
  2. Ни Y., Kireev I., Plutz M., Ashourian N., Belmont AS. Large-scale chromatin structure of inducible genes: transcription on a condensed, linear template. J. Cell Biol. (2009), 185:87-100.
  3. Kireev I, Lakonishok M, Liu W, Joshi VN, Powell R, Belmont AS. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nat Methods. (2008), 5(4):311-313.
  4. Rego A, Sinclair PB, Tao W, Kireev I, Belmont AS. The facultative heterochromatin of the inactive X chromosome has a distinctive condensed ultrastructure. J Cell Sci. (2008), 121(Pt 7): 1119-1127.
  5. Novikov DV, Kireev I, Belmont AS. High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution. Nat Methods. (2007), 4(6):483-485.
  6. В.Ю. Поляков, O.B. Зацепина, И.И. Киреев, A.H. Прусов, Д. Фаис, Е.В. Шеваль, Ю.В. Коблякова, С.А. Голышев, Ю.С. Ченцов. Структурнно-функциональная модель митотической хромосомы. Биохимия (2006), 71(1):6-16.
  7. Kobliakova I, Zatsepina О, Stefanova V, Polyakov V, Kireev I. The topology of early- and late-replicating chromatin in differentially decondensed chromosomes. Chromosome Res. (2005), 13(2):169-181.
  8. Sheval EV, Kireev II, Polyakov VY. Stabilization of macromolecular chromatin complexes in mitotic chromosomes by light irradiation in the presence of ethidium bromide. Cell Biol Int. (2004), 28(12):835-843.
  9. Kireeva N, Lakonishok M, Kireev I, Hirano T, Belmont AS. Visualization of early chromosome condensation: a hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. J Cell Biol. (2004), 166(6):775-785.

lO.Prasov A.N., Kireyev I.I., Polyakov V.Yu. Visible light irradiation of ethidium bromide-stained interphase nuclei causes DNA-protein linking and structural stabilization of nucleoprotein complexes. Photochemistry & Photobiology (2003), 78 (6):592-598.

ll.Beenders B, Watrin E, Leganeux V, Kireev I, Bellini M. Distribution of XCAP-E and XCAP-D2 in the Xenopus oocyte nucleus.Chromosome Res., (2003), 11:549-564.

12.Тимирбулатова Э.Р., Киреев И.И., Картавенко T.B., Гулак П.В., Поляков В.Ю., Ле Геллек К., Узбеков Р.Э. Исследование внутриклеточной локалинзации белка ХСАР-Е в клетках линии XL2 (Xenopus laevis) в норме и при ингибировании транскрипции и процессинга рРНК. Цитология (2003), 45:290-297.

40


13.Курчатова С.Ю., Филимоненко В.В., Гулак П.В., Киреев И.И., Поляков В.Ю., Гозак П. Индукция формирования ядерной оболочки вокруг индинвидуальных хромосом под действием гипотонического шока. Цитология (2003), 45:298-307.

14.Uzbekov R, Timirbulatova Е, Watrin Е, Cubizolles F, Ogereau D, Gulak P, Legagneux V, Polyakov VJ, Le Guellec K, Kireev I. Nucleolar association of pEg7 and XCAP-E, two members of Xenopus laevis condensin complex in interphase cells. J Cell Sci. (2003); 116(Pt 9): 1667-1678.

15.Тимирбулатова Э.Р., Киреев И.И., Грабеклис С.А.,Гулак П.В., Ле Геллек К., Поляков В.Ю., Узбеков Р.Э. Внутриклеточная локализация конденси-нов XCAP-E pEg7 в норме и в условиях, вызывающих искусственное изменение структуного состояния митотических хромосом. Цитология (2002); 44(6):576-584.

16.Sheval EV, Prusov AN, Kireev II, Fais D, Polyakov VY. Organization of higher-level chromatin structures (chromomere, chromonema and chromatin block) examined using visible light-induced chromatin photo-stabilization. Cell Biol Int. (2002), 26(7):579-591.

17.Chudinova EM, Kireev IL, Fais D, Gianguzza F, Giudice G, Morici G, Vorobjev IA, Poliakov VY. Noncanonical structural-functional organization of nucleoli in maturing oocytes of sea urchin Paracentrotus lividus. J Submicrosc CytolPathol. (2001), 33(3):301-311.

18.Шеваль E.B., Гулак П.В., Киреев И.И., Чудинова Е.М., Фаис Д., Джангуц-ца Ф., Поляков В.Ю. Особенности сегрегации неканонического ядрышка ооцитов морского ежа Paracentrotus lividus. Онтогенез (2001), 32(5):377-383.

19.Коблякова Ю.В., Киреев И.И., Стефанова Е.Н., Зацепина О.В., Поляков В.Ю. Дифференциальная деконденсация митотических хромосом культунры СПЭВ вызванное двойным гипотоническим шоком. Цитология (2001), 43(5):462-470.

20.Шеваль Е.В., Прусов А.Н., Киреев И.И., Поляков В.Ю. Изучение струкнтурных и структурно-функциональных субдоменов интерфазного ядра методом фотостабилизации. Цитология. (2001); 43(2): 122-132.

21.Курчатова С.Ю., Прусов А.Н., Гулак П.В., Киреев И.И., Поляков В.Ю. Особенности взаимодействия белка анкоросом р68 с ядерной оболочкой в клеточном цикле. Онтогенез (2000), 31(6):429-439. Russian.

22.Vladimirskaya EA, Kireyev II, Prusov AN, Fais D. Spatial localization of chromosome-nuclear envelope interaction sites. Membr Cell Biol. (1999), 12(6):857-869.

23.Amchenkova AA, Buzhurina IM, Gorgidze LA, Kireyev IV, Panov MA, Polyakov VJ. The role of Ca ions in restoration of the structure of interphase and mitotic chromosomes in PK living cells after hypotonic stress. Cell Biol Int. (1998), 22(7-8):509-515.

41


24.Ямшанов А.Н., Киреев И.И., Прусов А.Н., Поляков В.Ю. Стабилизация макромолекулярных комплексов хроматина под действием видимого свента в присутствие бромистого этидия. Цитология. (1998), 40(4):340-346.

25.Чудинова Е.М., Зацепина О.В., Воробьев И.А., Файс Д., Киреев И.И., Джудиче Д., Поляков В.Ю. Локализация аргентофильных белков в ядрышках ооцитов морского ежа Paracentrotus lividus. Цитология (1998), 40:302-307

26.Крохина Т.Б., Терехов СМ., Киреев И.И., Ляпунова Н.А., Тодоров И.Н. Действие циклогексимида на синтез белка, РНК и ДНК в культуре клеток СНО и диплоидных фибробластов человека. Бюлл. Эксп. Биол.Мед. (1991), 112(8):139-141.

27.Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Динамика структурной реконструкции митотических хромосом после их искуснственной деконденсации in vitro. Цитология (1990), 32(5):449-454.

28.Zatsepina O.V., Kireyev I.I., Frolova E.I., Polyakov V.Yu., Chentsov Yu.S. (1990) Chromomere - the structural unit of the chromtin in the interphase nucleus. In: Nuclear structure and functions. Eds. Zbarsky LB., Harris J.R. Plenum Press, New York., pp. 301-304.

29.Киреев И.И., Зацепина O.B., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Ультраструктура митотических хромосом клеток СПЭВ в ходе их обратимой искусственной деконденсации in vivo. Цитология (1988), 30(8):926-932.

По материалам диссертации было также сделано 24 доклада на Всесонюзных и Всероссийских научных конференциях и 8 докладов на международных научных конференциях, тезисы которых опубликованы в научнных журналах (25 докладов) или специальных сборниках (7 докладов).

Структура и объём диссертации:

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы по теме

исследования, описания методов исследования, 6 глав результатов, заключения,

выводов, листа благодарностей, библиографического списка, включающего

___ анаименований, и приложений. Работа изложена на ___ листах машинон

писного текста, содержитаа ___ фотографии, __ графиков, _ схем и рисунков,

таблиц.

42

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
 Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии