Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

ВЫСШИЕ УРОВНИ ОРГАНИЗАЦИИ ХРОМТИНА И РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА

Автореферат докторской диссертации по биологии

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

 

КИРЕЕВ ИГОРЬ ИГОРЕВИЧ

ВЫСШИЕ УРОВНИ ОРГАНИЗАЦИИ

ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ЭУКАРПОТ

И РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат

диссертации на соискание ученой

степени доктора биологических наук

Москва-2011

Работа выполнена в Отделе электронной микроскопии Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (директор - академик РАН, профессор В.П. Скулачёв) Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Онищенко Галина Евгеньевна, доктор биологических наук, профессор Коломиец Оксана Леонидовна, доктор биологических наук, профессор Зеленин Александр Владимирович.

Ведущая организация: Институт биологии развития РАН

Защита диссертации состоитсяаа л __________ 2011 г. в ____ часов на

заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета

МГУ.

Автореферат разослан ла _________ 2011г.

Калистратова Е.Н.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

1. ВВЕДЕНИЕ

Значительное увеличение размеров и сложности генома в процессе эвонлюции повысило важность решения проблемы упорядоченной пространственнной организации генетического материала и его аккуратной сегрегации в ходе деления клетки у высших эукариот. Это достигается многоуровневой упаковнкой ДНК в сложный нуклеопротеидный комплекс Ч хроматин. Вершиной танкой упаковки являются митотические хромосомы, степень компактизации ДНК в которых на стадии метафазы достигает 104. Важную роль в упорядоченной укладке ДНК в составе хроматина играют как гистоны, так и негистоновые белнки, причем до недавнего времени считалось, что гистоны выполняют исключинтельно структурную роль, обеспечивая упаковку ДНК на низших уровнях компактизации - в составе нуклеосом и 30-нм фибрилл хроматина. Дальнейший способ упаковки 30-нм фибриллы и формирование т.н. высших уровней органнизации хроматина до сих пор остаются предметом дискуссий. Неполнота и противоречивость сведений о пространственной организации хроматина сущенственно осложняют адекватную интерпретацию биохимических и генетических данных о молекулярных механизмах, лежащих в основе процессов компактиза-ции/декомпактизации хроматина. Например, прогресс в исследовании функционнальной роли лархитектурных негистоновых хромосомных белков, таких как топоизомераза II и белки конденсинового комплекса, существенно тормозится из-за того, что изучение характера их взаимодействия с хромосомами проводинли преимущественно в системах in vitro, а также в условиях искусственной де-конденсации хромосом (Earnshaw, Heck, 1983; Hirano, Mitchison, 1994; Maeshi-ma et al, 2005). Поскольку данные об ультраструктурной локализации этих важннейших структурных компонентов хромосом в контексте нативного хроматина практически отсутствуют, многие аспекты структурно-функциональной органинзации и динамики хромосом в митозе остаются непонятными.

Следует отметить, что сложности в исследовании структуры хромосом обусловлены не в последнюю очередь особенностями их организации. Так, вынсокая плотность упаковки хроматина не позволяет непосредственно проследить характер укладки хроматиновых фибрилл разного уровня в составе компактизо-ванных метафазных хромосом. Это обстоятельство и является главной причинной популярности экспериментальных подходов, использующих различные ментоды декомпактизации хроматина (Paulson, Laemmli, 1977; Brinkley et al, 1980; Zatsepina et al., 1983). В то же время, значительные структурные перестройки хроматина, происходящие даже в достаточно узком диапазоне изменений сонстава окружающей среды, могут не отражать истинной природы хромосом, а сами эти подходы могут служить потенциальным источником артефактов. Это особенно актуально для высших уровней организации хроматина, демонстрирунющих высокую лабильность в системах in vivo и in vitro. В связи с этим, особое значение приобретает разработка методических подходов, направленных на иснследование организации хроматина в его нативном состоянии. Дополнительные

3

сложности в решении данной задачи связаны с тем, что структурная организанция хроматина не монотонна: различные участки генома различаются по харакнтеру упаковки ДНК, и эти различия связаны с функциональным состоянием генных локусов. Классическим примером может служить подразделение интер-фазного хроматина на слабо компактизованный, транскрипционно активный эухроматин и плотно упакованный, инертный в отношение экспрессии генетинческой информации гетерохроматин. Различия в структурном состоянии эу- и гетерохроматина становятся менее очевидными при переходе от интерфазы к митозу, однако фундаментальные особенности структуры этих фракций генома по-видимому, сохраняются. В связи с этим особенно важно иметь возможность исследовать особенности структурной организации индивидуальных хромосомнных локусов в составе нативного хроматина. Для решения такой задачи требунются новые методические подходы, поскольку используемые в настоящее вренмя методы гибридизации in situ не позволяют в должной степени сохранить ин-тактной тонкую структуру хромосом. Одним из таких подходов является конструирование искусственных хромосомных локусов, визуализуемых при понмощи системы 1ас-опреатор/1ас-репрессор как in situ, так и in vivo (Robinett et al, 1996).

Однако биологическое значение высших уровней организации хромосом эукариот не ограничивается необходимостью компактизации длинных молекул ДНК для аккуратной трансмиссии генетической информации в процессе кленточного деления. Сложно организованный и плотно упакованный хроматин неизбежно создает топологические проблемы при репликации ДНК, что требунет точной координации процесса синтеза ДНК со структурными преобразованниями реплицирующегося хроматина. Отсутствие детальной информации об организации хроматиновых структур высшего порядка ограничивает выработку единой точки зрения на пространственно-временную организацию процесса синтеза ДНК и механизмы пострепликативной сегрегации сестринских хрома-тид.

Структурное состояние хроматина также является важным элементом синстемы эпигенетической регуляции экспрессии генов. Роль упаковки хроматина проявляется как на уровне контроля доступности ДНК для связывания транснфакторов за счет ограничения диффузии (John et al, 2011), так и на уровне модунляции их взаимодействий с хроматиновой матрицей через посттрансляционные модификации гистонов (Allis et al, 2007). В последнее время становится все бонлее очевидным, что и высшие уровни компактизации хроматина, и даже позинционирование хромосомных локусов или целых хромосом в трехмерном пронстранстве интерфазного ядра представляют собой дополнительные уровни эпингенетического контроля, однако механизмы реализации такого рода регуляции, и способы поддержания эпигенетических состояний, связанных с пронстранственной организацией интерфазного хроматина, в ряду клеточных деленний или остаются гораздо менее исследованными. Очевидно, что ответы на эти

4

вопросы не могут быть даны без полного понимания принципов структурной организации хроматина на этих надмолекулярных уровнях.

1.2. Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы было исследование формирования высших уровнней организации хроматина в процессе митотическои компактизации хромосом и роли лархитектурных белков хромосом в этом процессе, а также изучение взаимосвязи структурной организации хроматина и его функционального сонстояния, в первую очередь, в отношение транскрипционной и репликативнои активности.

Конкретные задачи работы состояли в следующем:

- 1) провести сравнительный ультраструктурный анализ и исследовать осонбенности высших уровней компактизации ДНК в хроматиновых доменах с различным генетическим статусом (эухроматин, факультативный и конститутивный гетерохроматин), используя инактивированную Х-хро-мосому и прицентромерный гетерохроматин (хромоцентры) в качестве модели.

1. исследовать динамику высших уровней организации хроматина в пронцессе репликации ДНК и характер пострепликативных структурных преобразований хроматина.
2. изучить топологию рано реплицирующегося, транскрипционно активнного эухроматина и поздно реплицирующегося, молчащего гетерохроматина в митотических хромосомах
3. исследовать на ультраструктурном уровне структурные преобразованния хроматина при активации транскрипции, используя в качестве модели искусственные генные локусы, визуализуемые in vivo.

5) изучить динамику митотическои компактизации хроматина на

ультраструктурном уровне и процесс формирования высших уровней орн

ганизации хроматина в ходе естественной компактизации.

1. исследовать роль Са++ в формировании высших уровней компактизанции хроматина в живых клетках
2. исследовать топологию основных архитектурных белковых компоненнтов хромосом - конденсинового комплекса и топоизомеразы II в ход митотическои компактизации хроматина и установить их связь с форнмирование высших уровней компактизации хромосом.
3. исследовать динамику конденсинового комплекса при искусственно индуцированных изменениях характера компактизации хромосом в жинвых клетках
4. исследовать топологию конденсинового комплекса в мейотических хромосомах.

5

1.3. Научная новизна работы.

В работе было впервые проведено детальное ультраструктурное исследованние динамики формирования высших уровней компактизации хромосом млекопитающих в профазе митоза. Обнаружено, что митотическая компактиза-ция происходит с образованием как минимум двух промежуточных уровней Ч хроматиновых фибрилл диаметром 200-250 нм и 400 нм.

Впервые исследована трехмерная организация доменов факультативного гетерохроматина, соответствующих неактивной Х-хромосоме человека. Показанно, что инактивация сопровождается упаковкой хроматина в фибриллы диаметром 200-400 нм, при сохранении доступности внутренних областей Xi для транс-факторов.

Показано, что репликативные кластеры в поздно-реплицирующемся гете-рохроматине соответствуют хроматиновым доменам диаметром 250-300 нм. Репликация не требует глобальной деконденсации плотно упакованных доменнов, и репликативные комплексы распределены равномерно в объеме реплицирующегося домена, не формируя репликативные фабрики.

Исследована динамика основных архитектурных белков хроматина топо-изомеразы II и конденсинов в процессе профазной компактизации хромосом, а также в экспериментальных условиях, вызывающих изменение степени компакнтизации хромосом in vivo. На основании полученных данных предложена новая модель структурной организации митотических хромосом.

Впервые продемонстрирована локализация субъединиц конденсина в тельнцах Кахаля, а также явление независимой локализации индивидуальных субъединиц конденсинового комплекса в различных структурно-функциональнных доменах ядра.

Разработан новый метод in vivo иммуномечения клеточных белков наноча-стицами золота, и с помощью данного метода впервые удалось визуализовать на ультраструктурном уровне характер упаковки индивидуальных хромосомнных локусов в виде хроматиновых фибрилл высшего порядка в интактных клетках.

Разработан метод индукции линейной и поперечной дифференциации митотических хромосом и впервые продемонстрированы различия в организанции рано- и поздно реплицирующихся хроматиновых доменов относительно хромосомной оси.

Впервые в интактных клетках показано, что индукция транскрипции эухро-матиновых генов сопровождается частичной деконденсацией высших уровней организации хроматина. В то же время, транскрипция может осуществляться на плотно упакованной хроматиновой матрице.

Впервые прижизненно прослежена динамика ассоциации генов с кластеранми интерхроматиновых гранул при активации транскрипции, а также продемонстрированаа высокаяа локальнаяа мобильностьа транскрибирующихся

6

хромосомных локусов. На основании полученных данных предложена новая модель организации процесса транскрипции в контексте нативного хроматина.

1.4. Научно-практическая ценность работы.

Настоящая работа является фундаментальным научным исследованием. В ходе ее выполнения получены новые данные об организации генетического аппарата высших эукариот и о структурных перестройках высших уровней упанковки ДНК в хромосомах, сопровождающих протекание фундаментальных биологических процессов, связанных с экспрессией, репликацией и сегрегацией генетического материала клетки. Эти данные позволяют расширить наши преднставления о структурно-функциональной организации генома, а также в перспективе использовать полученные сведения для разработки подходов для коррекции различных патологических процессов, связанных с нарушениями структурного состояния хроматина.

Разработанные автором методы фотостабилизации хроматина, in vivo-им-муномечения могут быть использованы и уже успешно применяются в различных цитологических исследованиях (Kanazawa et al, 2011)

Результаты работы включены в учебные курсы для студентов Биологиченского факультета, факультета биоинформатики и биоинженерии, химического факультета МГУ, для слушателей научно-образовательного центра по нанотех-нологиям МГУ, Биологического факультета Университета штата Иллинойс (Урбана-Шампейн, США).

1.5. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Европейском совещании по структуре и функции ядра памяти В.Бернара (1989, 1999, 2003); Конгрессе Европейского общества по фотобиологии (Кембридж, Великобритания, 1995); Съезде Британского общества клеточных биологов (Кентербери, 1995); Совенщании ЕМВО по структуре и функции клеточного ядра (Прага, Чехия, 1999). Европейского конгресса по клеточной биологии (Прага, Чехия, 1994); Конфенренциях Американского общества клеточных биологов (2001, 2002, 2008); 52 Симпозиуме Европейского общества гистохимии (Прага, Чехия, 2010), 17 Межндународной хромосомной конференции (Бун, США, 2009), 3 Конференции памяти Марии Кюри по архитектуре генома в связи с патологией (Эдинбург, 2009), Всесоюзных (всероссийских) симпозиумах "Структура и функция кленточного ядра" и Биология клетки в культуре (1990, 1997, 2010), 1-ом Съезде Российского общества клеточных биологов (С-Петербург, 2003), а также на сенминарах Московского общества клеточных биологов, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Биологического факультета Университента Ренна (Франция), Департамента клеточной биологии и биологии развития

7

Университета Палермо (Италия), кафедры цитологии и гистологии Биологиченского факультета МГУ.

2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Принятые сокращения: AT - антитела; ИФ - иммунофлуоресценция; ЭМ - электронная микроскопия; BrdU - бромдезоксиуридин; EdU - этинилдезокси-уридин; FISH - флуоресцентная гибридизация in situ, PBS - физиологический фосфатный буферный раствор, GFP - зеленый флуоресцирующий белок.

В работе были использованы несколько типов клеточных культур, включая клетки человека (HeLa, WI-38), свиньи (СПЭВ), шпорцевой лягушки (XL2), мыши (эмбриональные фибробласты), китайского хомячка (СНО К1, СНО DG-44). Также были получены субклоны линии СНО, несущие интегрированные в геном трансгенные конструкции, содержащие тандемные повторы lac-оператонра. Визуализация трансгенных локусов in vivo осуществлялась при помощи экспрессии в этих клетках GFP-Lac-репрессора (Robinett et al., 1996). Культивинрование клеток и процедуры сихронизации клеточных популяций осуществлялись по описанным ранее методам (Li et al., 1998, Uzbekov et al., 1998). Получение препаратов распластанных зародышевых пузырьков ооцитов Xenopus laevis и иммунофлуоресцентный анализ хромосом типа ламповые щетки проводили по стандартной методике (Beenders et al, 2003).

Приготовление препаратов для иммунофлуоресцентной микроскопии и FISH, а также методы флуоресцентной ЗО-микроскопии описано в нескольких публикациях (Uzbekov et al, 2003; Kireeva et al, 2004; Rego et al, 2008; Hu et al, 2009). Электронномикроскопический анализ проводили на ультратонких срезах по стандартной методике, а также с использованием микроинъекции первичных антител, коньюгированных с наночастицами золота. Микроинъекцию осущенствляли с помощью микроинъектора IM300 (Nikon, Япония) и микроманипулятора MO-202U (Narishige, Япония), смонтированного на инвер-тированом флуоресцентном микроскопе IMT-2 (Olympus, Япония). Электронно микроскопические исследования проводили на микроскопах HU-11B, HU-12 и Н-700 (Hitachi, Япония). Анализ ЗО-организации хроматина проводили методанми реконструкции по серийным ультратонким срезам (регистрация и препроцессинг изображений и создание трехмерных моделей проводились при помощи ImageJ и Matlab) или по угловым проекциям полутонких (500-нм) срензов при 200кВ в микроскопе Philips СМ200 (FEI, Нидерланды), оборудованном гониометром с большими углами наклона (Gatan, США) и CCD-камерой Тет-Cam-F224 (TVIPS, Германия).

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии