Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и особенности проявления болезни в современных условиях ведения животноводства

Автореферат докторской диссертации по биологии

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

 

2.2.2. Эффективность различных методов индикации вируса

в инфицированных культурах клеток

В связи с тем, что размножение вируса в культурах клеток не всегда сопровождается развитием видимого цитопатического действия (ЦПД), для его ранней индикации в них использовали методы бляшкообразования (БОЕ), окрашенных фокусов (ФОЕ), цитоморфологические исследования (окраска инфицированных культур клеток 0,5%-ным раствором амидового черного на 0,5% -ной уксусной кислоте и выявление синцитиев в окрашенных по Романовскому-Гимза препаратах инфицированных клеток при помощи световой микроскопии), а также ОТ-ПЦР.

Учет результатов проводили в течение 7 суток культивирования вируса. Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Сравнительная эффективность различных методов индикации вируса в инфицированных культурах клеток

Вид культуры клеток	Метод индикации вируса	Сроки выявления вируса, (сутки)	Возможность количественного определения инфекционной активности вируса	Специфичность метода, (+; -)
FLK, ТЭБ	БОЕ	3-7	+	+
	ФОЕ	3-7
	Цитоморфологический	2-7	-
	ОТ-ПЦР	1-7	+	+

Из данных таблицы 2 видно, что наиболее точным методом титрования явился метод бляшек. Однако он более трудоемок, требует тщательного подбора ингредиентов и определенного навыка в постановке.

Фокусы цитопатического действия вируса в культуре клеток, различаемые микроскопически как скопления клеток, образовывались на 3-4 сутки после ее заражения и были видимыми на 5-8 день. Однако если деструкция в центре фокусов была слабо выражена, их учет без предварительной окраски затруднялся. Поэтому для выявления фокусов визуально необходимо дополнительно использовать окраску инфицированных клеточных культур 0,5%-ным раствором амидового черного на 0,5% -ной уксусной кислоте.

В фиксированных и окрашенных клеточных культурах фокусы ЦПД вируса были отчетливо видны и визуально. Окраска их не изменялась при длительном хранении, что значительно облегчало учет и анализ полученных результатов.

Далее необходимо было установить продолжительность инкубации вируса при окраске инфицированных культур для визуального учета фокусов. При окрашивании клеточных культур через 3-4 суток после заражения вирусом, различать и подсчитывать фокусы визуально было трудно. Окрашивание инфицированной культуры клеток FLK на 5-6 сутки инкубирования приводило к увеличению размеров фокусов и возможности их визуального подсчета, а на 7-8 сутки приводило к увеличению размеров фокусов, но и образованию вторичных фокусов или слиянию первичных. Поэтому окраску зараженных культур клеток проводили на 5-6 сутки инкубирования. Кроме того, указанный срок был признан оптимальным для накопления вируса, что было установлено в предыдущих исследованиях.

Результаты сравнительного определения инфекционной активности вируса штамма РС-Б в культуре клеток FLK представлены в таблице 3.

аа Таблица 3 - Сравнительное титрование штамма РС-Б респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культуре клеток FLK (n=3)

Методы титрования	Инфекционность вируса
	M а m	Р
Титрование в пробирочной монослойной культуре клеток Титрование по ФОЕ в 50 мл флаконах	3,96 0,02 lg ТЦД 50/мл 4,40 0,06 х 104,0 ФОЕ/ мл	< 0,001 < 0,001

В результате метод титрования по ФОЕ оказался несколько чувствительнее метода титрования по ЦПД в пробирках и простым в учете. Наиболее эффективными методами контроля репродукции вируса в инфицированных культурах клеток оказались ОТ-ПЦР и методы титрования по БОЕ и ФОЕ, однако результаты ОТ-ПЦР были положительными в более ранние сроки.

При электронной микроскопии проб культурального, концентрированного и очищенного вирусов обнаруживали характерные для PC-вируса вирионы, морфологически представляющие собой округлые или полиморфные частицы (80-160 Нм), наружная мембрана которых покрыта отростками.

Изучение морфологических изменений в зараженных культурах клеток FLK и ТЭБ проводили также на примере двух штаммов вируса - РС-Б и К-18. Размножение вируса сопровождалось образованием цитоплазматических включений, а также синцитиев различного размера, содержащих от 5 до 10 ядер. Цитоморфологический метод позволял выявлять вирус в культуре клеток в затруднительных случаях учета ЦПД световым микроскопированием, обнаруживать его в клетках на ранних стадиях репродукции, а также подтверждать специфичность цитопатогенного действия, однако по срокам постановки и специфичности уступал ОТ-ПЦР.

2.2.3. Параметры хранения вируссодержащей суспензии в

абораторных условиях

Учитывая высокую чувствительность вируса к замораживанию и оттаиванию, изучали сроки его сохранности при различных температурных режимах. Результаты показали, что хранение культуральной вируссодержащей жидкости при температуре 4С снижает инфекционную активность вируса на 3,0 lg в течение 2 месяцев, при минус 25С на 3,5 lg - в течение 6 месяцев, при минус 70 на 2,5 lg в течение 7 месяцев. Хранениеа лиофилизированного вируса при минус 25С в течение 12 месяцев снижало его титр на 1 lg ТЦД50/мл. Таким образом, оптимальными условиями хранения лиофилизированного вируса (штаммы РС-Б и К-18) являлись температура минус 25С, а нативного - минус 70С.

Хранение вируссодержащих суспензий, полученных из проб внутренних органов животных, при минус 18С обеспечивало сохранность материала из слизистой оболочки трахеи в течение двух месяцев, носовых выделений и бронхов - 4-х месяцев, бронхиального экссудата - 6-ти месяцев, а легких - 12 месяцев. Оптимальным режимом хранения выделенной РНК вируса являлся минус 18оС в течение 2-10 месяцев, в зависимости от вида исследуемого материала. Наиболее пригодным материалом для исследований в ОТ-ПЦР являлись пробы легких, бронхиального экссудата и бронхов.

2.2.4. Разработка эритроцитарного диагностикума для серологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного

рогатого скота, овец и коз методом РНГА

При разработке специфического эритроцитарного антигена для серологической диагностики болезни использовали методы Денера и Martin в авторской модификации. Технология изготовления антигена изложена в НТД на Набор для серодиагностики респираторно-синцитиальной инфекции (РС-инфекции) крупного рогатого скота, овец и коз (ТУ-10-19-162-91). Данные по сравнительной активности эритроцитарных антигенов представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Сравнительная активность эритроцитарных антигенов, полученных при репродукции штамма РС-Б РСВ КРС в различных культурах клеток (n = 3)

№ п/п	Культура клеток	Титр вируса, lg ТЦД50/мл М m; Р<0,05	Количество серий	Активность антигена со специфической сывороткой к РСВ в титрах, lg2, М m; Р<0,05
1	МDВК	1,650,10	12	4,50,25
2	ДЛЭК	2,140,21	2	5,50,25
3	ЭЛЭК	2,170,46	3	5,670,24
4	ТБ	3,040,04	2	6,50,25
5	ПЭК	3,200,15	3	6,670,24
6	Т-1	3,780,11	29	7,520,12
7	46/47	3,640,11	2	6,50,25
8	ЭК	4,750,14	19	7,730,11
9	FLK	4,760,13	18	8,550,09
10	П5Э	4,950,05	7	9,360,12
11	5Э	4,960,03	16	9,690,14
12	ПТ	3,740,11	13	7,380,09
Всего серий		126аа

Из данных таблицы 4 следует, что активность эритроцитарных антигенов зависела от титра вируса, который использовали для их получения. По мере повышения титра вируса повышался и титр антигена, что было связано с видом культуры клеток, в которой размножали вирус. Так, в культуре клеток 46/47 титр вируса составил 3,640,11 lg ТЦД 50/мл, а титр эритроцитарного антигена 6,50,25. В культуре клеток ЛЭК титр вируса составил 4,750,14 lg ТЦД 50/мл, в FLК Ца 4,760,13 lg ТЦД 50/мл, П5Э Ц4,950,05 lg ТЦД 50/мл, Л5Э Ц4,960,03 lg ТЦД 50/мл, а активность антигена в разведениях - 7,730,11; 8,550,09; 9,360,12 и 9,690,14 lg2, соответственно.

После адаптации штамма к перевиваемым линиям культур клеток Т-1 и ПТ его титр достигал 3,780,11 аlg ТЦД 50/мл и 3,740,11 lg ТЦД 50/мл, а активность эритроцитарного антигена 7,520,12 и 7,380,09 lg2.

Таким образом, было показано, что наиболее пригодными для репродукции штамма РС-Б с целью получения эритроцитарного антигена оказались диплоидные клетки легких и почки эмбриона коровы, несколько уступали им перевиваемая линия почки эмбриона овцы и первичная культура легкого эмбриона коровы и перевиваемые линии почка теленка (Т-1) и почка теленка (ПТ).

Из вируссодержащей суспензии, полученной в этих культурах клеток, готовили наиболее активные эритроцитарные антигены, титры которых со специфической к PC-вирусу сывороткой составляли от 7,920,22 до 10,150,09 lg2.а

Совместно с Л.М. Акбаевой изготовили 126 серий эритроцитарного антигена, из них 96 использовали для выявления антител к вирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота, овец и коз в РНГА. Полученные антигены сохраняли активность в течение 12 месяцев со дня приготовления при хранении в сухом месте и температуре 2-10С.

С целью получения положительного контроля в РНГА получали специфические гипериммунные сыворотки к штамму РС-Б РСВ КРС с использованием мышей, морских свинок, баранов и кроликов. Результаты, опытов показали, что штамм РС-Б РС-вируса крупного рогатого скота не обладает выраженной антигенной активностью для белых мышей и морских свинок при использованном способе иммунизации. На его введение у животных синтезировались вируснейтрализующие антитела в титре 2,22 0,11 lg2. Для иммунизации баранов и кроликов использовали концентрированный препарат РСВ КРС с адьювантом Фрейнда, на который получили сыворотки крови с титром в РН у баранов 6,080,09 аlg2, у кроликов 5,380,16 lg2, которые и использовали в дальнейшей работе.

2.2.5. Распространение РСИ КРС в хозяйствах Российской Федерации

по результатам серологических исследований

Исследованию подвергли 3623 пробы сыворотки крови от крупного рогатого скота различных половозрастных групп из 16 регионов Российской Федерации. Результаты показали, что РСИ КРС широко распространена во всех обследованных областях и краях Российской Федерации. Наибольшее распространение она получила в регионе 12 (94,9%), 13 (93,2%), 7 (87,2%) и 9 (86,6%), 11 (83,3%), 10 (83,2%). В других регионах инфицированность животных находилась в пределах 52,6% - 81,8%. Наименьшее количество положительных проб выявляли от животных из регионов 1 и 2: 34,7% иа 15,1%, соответственно.

Нами не установлено различий в географическом распространении болезни среди крупного рогатого скота различных возрастов. Наибольшее количество серопозитивных к вирусу животных выявили в крупных молочных хозяйствах с высокой концентрацией и молочной продуктивностью коров, куда вводились новые животные. Инфицированность крупного рогатого скота в средних и мелких хозяйствах была ниже, однако при повышении молочной продуктивности она возрастала, а вместе с ней - риск возникновения респираторных болезней, протекающих с участием данного вируса. Большое значение имела плотность животных на единицу площади, а также ввод вирусоносителей в стадо.

Антитела к вирусу чаще выявляли у молодняка крупного рогатого скота в возрасте: 4-6 месяцев (71,9%); 2-4 месяца (69,2%); 6-9 месяцев (55,9%); взрослых животных (50,8%) и до 1,5 месяцев (36,8%).

При ретроспективных исследованиях сероконверсию к вирусу, свидетельствующую о его роли в развитии респираторной патологии, выявляли у телят в возрасте: 4-6 месяцев в 52,6% случаев; 7-9 месяцев в 50,0%; 3-4 месяца в 37,5%; 6-8 месяцев - 25,0%; 2-3 месяца - 6,7%; 1 месяц - 4,0% случаев.

Таблица 5 - Результаты серологических исследований крупного рогатого скота на респираторно-синцитиальную инфекцию в различных регионах РФ

Регион	Исследовано проб всего	Выявлено положительных
		всего	% от числа исследованных
1	533а	185	34,71
2	378а	57а	15,08 а
3	165а	135а	81,82а
4	57а	30а	52,63а
5	233а	130а	55,79а
6	32а	25а	78,13а
7	179а	156а	87,15а
8	139а	108а	77,70а
9	575а	498а	86,61а
10	196а	163а	83,16
11	215а	179а	83,26а
12	237а	225а	94,94а
13	44а	41а	93,18а
14	239а	140а	58,58а
15	351а	191а	54,42а
16	50	40	80,00
Всего	3623а	2303а	63,57а

Данные таблицы 5 свидетельствуют о том, что наиболее восприимчивыми к заболеванию респираторно-синцитиальной инфекцией являются телята в возрасте от одного до 6-месячного возраста. В некоторых случаях болезнь может проявляться и у животных старших возрастов.

Наличие циркуляции вируса подтверждено также среди овец и коз. Антитела к вирусу выявляли у 33,01% обследованных овец и 87,76% коз, что может свидетельствовать о межвидовой передаче возбудителя и роли этих животных в эпизоотическом процессе болезни. Полученные результаты свидетельствуют также о возможности применения РНГА для ретроспективной диагностики РС-инфекции крупного рогатого скота, овец и коз.

2.2.6. Особенности эпизоотической ситуации по респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота

в современных условиях

2.2.6.1. Распространение и характер проявления РСИ КРС

ав хозяйствах региона Сибири в зависимости

от наличия импортного скота

Характеристика хозяйств. Сопоставляемые хозяйства, несмотря на сходство целого ряда элементов в технологии производства молока, имели существенные различия в системе содержания, кормления, эксплуатации, а также отличались по ряду других хозяйственных признаков. В связи с этим они были разделены на три группы. Первая группа включала шесть крупных молочных комплексов, куда осуществлялся ввоз импортного скота из различных стран, и концентрация и молочная продуктивность животных были высокими (интенсивный способ ведения животноводства: 800 и более дойных коров со среднегодовой молочной продуктивностью около 7000 л молока). Вторая группа: 14 крупных молочных хозяйств аналогичного профиля со среднегодовой продуктивностью от 4000 до 7000 л молока, куда не было ввода животных, поступающих по импорту. Третья насчитывала 9 мелких и средних хозяйств, где концентрация животных и их продуктивность были относительно невысоки (в среднем до 300 дойных коров с продуктивностью не выше 3000-4000 л молока в год), куда новых животных не вводили в течение нескольких лет.

До 2008 г. случаев массовых заболеваний РСИ КРС животных в Сибири не регистрировали в связи с тем, что лабораторные исследования проводились в незначительном объеме. В период с декабря 2007 г. по январь 2008 г. инфекцию установили на молочном комплексе в Иркутской области после завоза нетелей из Канады.

Во все хозяйства первой группы (табл. 6) осуществлялся импорт скота из разных стран. В некоторых случаях животные за 2 недели до отправки были иммунизированы вакциной против РСИ КРС, поэтому уровень их серопозитивности к полевому вирусу установить было сложно. В двух хозяйствах импортные животные содержались отдельно, и признаки болезни регистрировались, в основном, у телят до 6 месяцев, рожденных от них (до 80%) и у незначительного количества нетелей и коров до 5 лет. В остальных допускали смешивание местного и импортного скота. Несмотря на хорошие условия кормления и содержания в одном из хозяйств признаки болезни выявили у коров и телят местной фермы, тогда как импортные нетели не болели. Заболеваемость и отход коров и телят были очень высокими. В других хозяйствах заболеванию были подвержены телята до 6-месячного возраста, рожденные как от импортированных, так и от местных матерей, а также незначительное количество молодых коров. Большой разницы в показателях заболеваемости и падежа импортных и местных телят не выявляли. Клинические признаки болезни у местного скота после контакта с завезенным развивались через 2-5 дней. В одном хозяйстве болели телята в возрасте до 10 дней.

Таблица 6 - Особенности проявления РСИ КРС на крупных молочных комплексах после завоза импортных животных

№ хозяйства	Категории восприимчивых животных, (+;-)		Сопутствующие инфекции		Выявление возбудителя/ наличие сероконверсии к вирусу,а (+;-)
	нетели, коровы	телята	нетели, коровы	телята	нетели, коровы	телята
1	+	+	ИРТ, ВД-БС	Сальмонеллез, микоплазмоз	+/+	+/+
2	+	+	ИРТ, ВД-БС, хламидиоз	Диплококковая септицемия, сальмонеллез,	-/+	+/+
3	-	+	ВД-БС	ВД, ИРТ, ПГ-3, сальмонеллез, диплококковая септицемия	+/+	+/+
4	-	+	ВД-БС	ВД, ИРТ, ПГ-3, сальмонеллез, диплококковая септицемия	Не проводили	+/+
5	+	+	ВД-БС, ИРТ	диплококковая септицемия, сальмонеллез		+/+
6	+	+	ВД-БС, ИРТ	ИРТ, ВД-БС, диплококковая септицемия, сальмонеллез	+/+	+/+

Течение болезни и характер клинических признаков можно было разделить на три группы: сверхострая форма инфекции, сопровождавшаяся угнетением, повышением температуры тела до 420С, снижением молочной продуктивности у коров, выделением обильной пены из ротовой полости, хрипами, кашлем, конъюнктивитами и быстрой гибелью животных. Такую ситуацию наблюдали в хозяйстве №1 у коров и телят и в хозяйствах №№ 2-4 только у телят до 6-месячного возраста и у незначительного количества молодых коров. Летальность во всех случаях была высокой. На вскрытии регистрировали интерстициальную пневмонию вплоть до полного разрушения паренхимы, бронхиты, увеличение и геморрагическое воспаление легочных лимфоузлов и легочную или бронхиальную эмфизему. Гибель животных наступала в течение нескольких дней, несмотря на проводимое лечение.

При остром течении у животных регистрировали бронхиты и интерстициальную бронхопневмонию. При всех клинических формах течение болезни осложнялось развитием вторичной микрофлоры (пастереллез) с выделением из легких павших и вынужденно убитых животных всех возрастов Mannheimiahaemolytica и Pasteurellamultocida. На вскрытии выявляли петехиальные кровоизлияния на миокарде и фибринозную бронхопневмонию.

В некоторых хозяйствах второй и третьей категорий, неблагополучных по бронхопневмониям, произошло наслоение РСИ КРС на хроническое течение сальмонеллеза и диплококковой септицемии у телят. Кроме этого у коров и телят регистрировали ИРТ и ВД-БС, что было подтверждено вирусологическими и ретроспективными серологическими исследованиями. Однако уровень сероконверсии к вирусу РСИ в хозяйствах с наличием импортного скота был очень высоким (до 128-кратного), что, на наш взгляд, свидетельствовало о его ведущей роли в этиологии массовых вспышек респираторных болезней. Во всех случаях результаты ОТ-ПЦР были положительными, а от животных различного возраста выделили изоляты вируса.

Субклиническая форма болезни проявлялась у восприимчивых животных в виде слабого респираторного синдрома.

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии