Geum.ru
   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

Диагностика респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и особенности проявления болезни в современных условиях ведения животноводства

Автореферат докторской диссертации по биологии

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
 Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 47 научных работ, в том числе 20 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации (Ветеринария, Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, Вестник КрасГАУ, Достижения науки и техники АПК, Аграрный вестник Урала, Сельскохозяйственная биология).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 330 страницах машинописного текста и состоит из введения, обнзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученнных результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения.а Работа иллюстрирована 36 таблицами и 33 рисунками. Список литературы включает 486 источников, из них 135 отечественных и 351 зарубежных авторов.

Основные положения, выносимые на защиту.а

1. Результаты разработки и изучения эффективности серологического и молекулярного методова диагностики РСИ КРС в экспериментальных и производственных условиях;

2. Эффективность усовершенствованных методов диагностики РСИ КРС при комплексной оценке особенностей проявления болезни в различных эпизоотических и хозяйственных условиях, в том числе в ассоциациях с другими вирусами и условно-патогенными бактериями в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства с наличием импортного скота и без него.

2. СОБСТВЕННЫЕа ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в лаборатории биотехнологии-диагностический центр ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии и на кафедре эпизоотологии и паразитологии Института прикладной биотехнологии и ветеринарной медициныа ФГОУ ВПО Красноярский государственныйа аграрныйа университет в 1988-2011 гг. Отдельные разделы диссертации выполнены совместно с сотрудникамиа проблемной лаборатории ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО Московской академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина.

Вирус. В опытах использовали штаммы РС-Б, полученный из БеНИИЭВ им. С.Н. Вышелесского, и К-18, выделенный и охарактеризованный нами.

Культуры клеток. Для выделения, адаптации и крупномасштабного культивирования вируса использовали 18 культур клеток различного происхождения. В качестве ростовой использовали питательную среду Игла МЕМ с однократным набором аминокислот и витаминов, 0,06% L-глутамина, 100 мкг/мл канамицина. Клетки культивировали при 370С в условиях 5% СО2. В качестве ростового фактора добавляли 5-10% эмбриональной сыворотки кровиа (HyClone, лот №ASA28574), тестированной на наличие вируса ВД-БС КРС и антител к нему. В качестве поддерживающей использовали ту же среду с 2% сыворотки.

При выращивании культур клеток и для культивирования вируса использовали 0,25% раствор трипсина, 0,01% раствор химопсина в 0,02% растворе Версена, диметилсульфоксид (ДМСО), ДЭАЭ - декстран, дрожжевой экстракт (ДЭ), фитогемагглютинин (ФГА), коммерческий 7,5% раствор бикарбоната натрия.

Реакцию нейтрализации проводили микрометодом с использованием наиболее чувствительных культур клеток. Инфекционную активность вируса определяли титрованием в чувствительной культуре клеток по ЦПД: в пробирочных культурах клеток и микрометодом; титр рассчитывали по методу Reed иа Muencn (1938) и выражали в ТЦД50/мл. Использовали также методы бляшек (БОЕ) по Прингл К. (1988) и окрашенных фокусов по Calnek В. et al. (1972); титр выражали в БОЕ/мл и ФОЕ/мл.

Электронная микроскопия. Образцы культурального и концентрированного очищенного вируса просматривали на электронном микроскопе JEM-100 CX-II совместно со ст. науч. сотр., канд. биол. наук ФГУ ВГНКИ ветпрепаратов Россельхознадзора Ю.И. Могильным Препараты готовили по методу негативного контрастирования с применением 2%-ного водного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты (рН 7,0).

Препараты для цитоморфологического исследования готовили из пробирочных культур клеток целлоидиновым методом и окрашивали гематоксилин-эозином по методу Волковой О.В., Елецкого Ю.К. (1971).

Эритроцитарный диагностикум готовили по методу Л. Денер. и др. (1976), Н. Martin (1983) в нашей модификации. Полученные препараты использовали для серодиагностики РСИ КРС, овец и коз в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Для получения гипериммунных сывороток к РСВ КРС использовали белых мышей линии BALB/C массой 20-30 г и морских свинок массой 300-350 г. Гипериммунизацию животных проводили путем введения культуральной вируссодержащей суспензии, а также концентрированного и очищенного по методу Trudel M. (1986) вируса интраназально с учетом схемы, предложенной Астаховой Л.Н. и Брайнингер М.Г. (1976). Дополнительно использовали баранов и кроликов.

Вирусологические и молекулярные исследования. При изучении распространения РСИ КРС использовали результаты собственных исследований. Дополнительно анализу были подвергнуты результаты серологических, вирусологических и бактериологические исследований, проведенных в ФГУ Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория (ЦНМВЛ), ГУ Тюменская областная ветеринарная лаборатория, ФГУ Новосибирская межобластная ветеринарная лаборатория, КГУ Алтайская ветеринарная лаборатория, КГУ Красноярская краевая ветеринарная лаборатория, ФГУ Иркутская межобластная ветеринарная лаборатория, РГУ Хакасская ветеринарная лаборатория, проведенных в 1991-2010 гг.

При анализе материалов по распространению инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота использовали результаты вирусологических исследований, предусмотренные Стандартом МЭБ (OIE Manual, Manual of Standarts //Chapter 2.3.5., 2000; Chapter 2.10.6., 2004), а также полученные при помощи ПЦР-тест-систем на основе ПЦР для диагностики ИРТ, ВД-БС, респираторно-синцитиальной инфекции (РСИ), разработанных в ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии: Свидетельства о Госрегистрации №№ ПВР-1-2.6/01845; ПВР-1-8.9/02498 и ПВР-1-8.9/02499. При исследовании на хламидиоз использовали тест-систему Хлаком производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Биоматериал. Выделение вируса проводили из проб носовых выделений, трахеального, бронхиального экссудатов, бронхов и легких больных и вынужденно убитых с диагностической целью животных, подозреваемых в инфицировании вирусом из нескольких областей Сибири.

Для доставки биоматериала использовали 3 метода. В двух - пробы помещали в пластиковые контейнеры и транспортировали в лабораторию в охлажденном виде на льду или в замороженном состоянии. В третьем случае их доставляли в пластиковых пробирках с транспортной средой в течение не более 24 часов с момента отбора.

В лаборатории пробы в день доставки гомогенизировали, разводили 1:10 питательной средой Игла МЕМ, центрифугировали, а надосадочную жидкость фильтровали через фильтры диаметром 0,22 -m. Полученные суспензии исследовали методом ОТ-ПЦР. Пробы, давшие положительный результат, использовали для выделения вируса. Для этого их в объеме 0,1 мл вносили в монослой культур клеток, выращенных микрометодом в 24-луночных пластиковых планшетах или 25 см3 матрасах.

Культивирование инфицированных культур клеток проводили при 20-37оС в атмосфере 5 0,5% СО2 в течение 5-8 дней. Всего проводили не менее 10 лслепых пассажей до наступления видимого цитопатического действия (ЦПД) вируса.

Для заражения культур клеток использовали три метода: с адсорбцией вируссодержащей суспензии в течение часа при +20 оС и последующим внесением поддерживающей среды с 2% эмбриональной сыворотки крови, с предварительным внесением в монослой культуры клеток 1% диметилсульфоксида (ДМСО) и адсорбцией вируссодержащей суспензии в течение часа при +20 оС и с внесением вируса без адсорбции.а

Идентификация цитопатических агентов. Вируссодержащую суспензию каждого пассажа исследовали в ОТ-ПЦР на наличие РНК вируса. Для выявления синцитиев под световым микроскопом просматривали фиксированные и окрашенные по Романовскому-Гимза препараты инфицированных культур клеток каждого пассажа (об. 40х, ок. 10х), выращенных в пробирках на покровных стеклах. После образования монослоя клеток его трижды отмывали раствором Хенкса и вносили вирус из расчета 1-2 ТЦД50 на клетку и добавляли питательную среду. Покровные стекла с монослоем культуры клеток извлекали из пробирок через 24;48;72;96 и 120 часов после заражения, промывали теплым раствором Хенкса и просушивали под струей теплого воздуха.

После тридцатиминутной фиксации в смеси этилового спирта и ледяной уксусной кислоты (3:1) их промывали 70о этиловым спиртом, просушивали и окрашивали, доводя рН красителя до 7,0 при помощи 1% раствора бикарбоната натрия. Препараты погружали в краситель на 60-90 минут, затем тщательно ополаскивали теплой дистиллированной водой и высушивали.

Гемагглютинирующие и гемадсорбирующие свойства изучали по общепринятым методикам.

Изучение эпизоотической ситуации по респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота. Исследования проводили на крупных молочных комплексах, средних и мелких молочно-товарных фермах в 16 административных регионах России, в том числе двух республиках, расположенных на территории Сибири, а также Республики Казахстан среди местного и импортированного скота.

Математические расчеты. Статистическую обработку проводили общепринятыми методами (И.П. Ашмарин и соавт., 1962). Достоверность результатов подтверждали с помощью критерия Стьюдента. Результаты считали достоверными при Р< 0,05. Для обработки данных использовали программу Microsoft Excel, входящую в пакет программ Microsoft Office 7.0.

ичное участие автора. Теоретический анализ, обобщение результатов, экспериментальные исследования выполнены автором самостоятельно. Участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие сотрудники ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии: д-р биол. наук, проф. Т.И. Глотова, ст. науч. сотр., канд. биол. наук О.В. Кунгурцева, ст. науч. сотр., канд. ветеринар. наук С.В. Котенева и А.В. Нефедченко, аспирант К.В. Войтова, а также ст. науч. сотр. проблемной лаборатории ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина Л.М. Акбаева, которым автор выражает глубокую благодарность.а

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Параметры выделения респираторно-синцитиального вируса

в культурах клеток

На начальном этапе предварительному исследованию в ОТ-ПЦР подвергли 190 проб биоматериала, из них выявили положительных 38, что составило 20%. В первично-трипсинизированной культуре клеток ТБ из проб легких, бронхов и трахеального экссудата, отобранных от животных на ранней стадии развития клинических признаков, выделили 6 изолятов вируса.

Наиболее эффективным было выделение вируса при условии транспортировки проб биоматериала не дольше 24 часов с момента отбора, в охлажденном состоянии на льду или в транспортной среде, заражения двухсуточного монослоя клеток в день доставки, избегая заморозки и хранения при низких температурах.

Дальнейшую работу проводили с изолятом К-18, выделенным из легких 3-х месячного теленка с признаками интерстициальной бронхопневмонии. В связи с невозможностью получения культуры клеток ТБ, его адаптацию с целью получения стабильного ЦПД и лурожая проводили в перевиваемых линиях культур клеток.

Наиболее чувствительной к вирусу оказалась перевиваемая линия культуры клеток ТЭБ. В ней видимое ЦПД регистрировали после 8 лслепых пассажей. Оно проявлялось на четвертые сутки девятого пассажа в виде образования характерных синцитиев. В окрашенных препаратах наблюдали гигантские клетки, содержащие от 4-х до 10-ти ядер, формирование которых начиналось уже с 24-72 часов после заражения до наступления видимого ЦПД. Результаты ОТ-ПЦР были положительными на протяжении всех пассажей. Титр вируса на уровне девятого пассажа составил 103,5ТЦД50/мл. Наиболее эффективным способом оказалось заражение монослоя клеток с часовой адсорбцией и добавлением 2% фетальной сыворотки КРС при 37оС.

Выделенный изолят не обладал гемагглютинирующими и гемадсорбирующими свойствами в отношении эритроцитов морской свинки.

При электронной микроскопии концентрированного препарата вируса девятого пассажа выявили филаментозные вирусные частицы размером 160 нанометров, однако часть из них была повреждена.

Адаптировать вирус к другим перевиваемым линиям культур клетока при данной методике заражения не удалось. Линии Vero,а FLK,а Taurus, MDBK, FBN,а FBTR, KCT, T-1, не поддерживали репликацию вируса, и результаты выделения в них были отрицательными. Однако чувствительность их к вирусу была различной. Так, например, результаты ОТ-ПЦР были положительными на протяжении 2 лслепых пассажей в культурах клеток FLK, MDBK, KCT и Vero, после чего вирус не выявляли.

В результате изолят был депонирован нами в коллекции микроорганизмов ФГУ Государственного научного центра вирусологии и биотехнологииа Вектор Роспотребнадзора под наименованием Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота К-18, V-406.

2.2.1.1. Спектр чувствительных культур клеток к штаммам

респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота

При выборе чувствительной клеточной системы использовали 18 разныха культур клеток, учитывая время проявления ЦПД и накопление вируса в пяти серийных пассажах. Исходный титр вируса при заражении составлял 1,5-3,0 lg ТЦД50/мл. Культивирование осуществляли при 37С в стационарных условиях. Результаты представлены в таблице 1.

Чувствительность первично-трипсинизированных культур клеток к штаммам РС-Б и К-18. В результате установили, что штаммы РСВ КРСа РС-Б и К-18 репродуцировались в культурах клеток: ТЭК, ПЭК, ЛЭК, ТБ и их субкультурах. Титры вируса были выше в первично-трипсинизированных культурах клеток ЛЭК, ПЭК и ТБ, чем в их субкультурах и ТЭК.

Чувствительность перевиваемых клеточных линий к штаммам РС-Б и К-18. Из перевиваемых культур клеток крупного рогатого скота нечувствительными к штамму РС-Б оказались четыре (FBG, FBN, FBTR, КСТ и CEF). Наибольшую чувствительность проявила линия T-I, в которой на протяжении 5 пассажей цитопатическое действие вируса было наиболее стабильным. Клеточная линия овечьего происхождения FLK также поддерживала репликацию этого штамма, титр которого в ней составил 3,740,12 lg ТЦД50/мл. Линии культур клеток Vero, FLK, Taurus, MDBK, FBN, FBTR, КСТ, T-1 не поддерживали репликацию штамма К-18 РСВ КРС.

Таблица 1 - Спектр чувствительных культур клеток к двум штаммам вируса РСИ КРС

(n = 18; P < 0,05)

№ п/п

Вид клеточной культуры

Наименование культуры клеток

Сроки наступления ЦПД, сутки после заражения штаммом

РСВ КРС

Титр вируса в lg ТЦД50/мл

(M m)

РС-Б

К-18

РС-Б

К-18

1

Первично - трипсинизированные

ТЭК

3-4

4-5

2,890,20

2,920,07

2

ПЭК

4-5

3-5

3,200,15

3,580,07

3

ЭК

3-5

4-5

3,360,17

4,830,07

4

ТБ

5

Субкультуры

ПЭК

4-5

3-4

2,870,07

2,830,07

6

ЭК

3-5

3-6

2,950,05

2,790,03

7

ТБ

8

Перевиваемые линии

FBG

-

-

-

-

9

FBN

10

FBTR

11

MDBK

4-6

-

1,650,10

-

12

T - 1

2-3

3-4

3,630,11

2,920,07

13

ТЭБ

3-5

3-5

3,170,07

4,580,07

14

Taurus

1,750,12

1,750,12

15

Vero

2-3

-

0,750,38

-

16

FLK

-

3,740,12

-

17

CEF

-

-

-

18

КСТ

-

-

-

-

Результаты исследований показали, что чувствительность культур клеток к вирусу имеет лштаммовую зависимость, т.к. спектр чувствительных культур клеток для двух штаммов вируса оказался различным. В связи с этим дальнейшую работу проводили с использованием первично трипсинизированной культуры клеток ЛЭК и перевиваемой линии FLK.

2.2.1.2. Оптимизация параметров культивирования вируса в

чувствительных клеточных системах

Изучение оптимальных условий культивирования вируса проводили по следующим параметрам: метод (стационарный и роллерный), температура культивирования в атмосфере 5% СО2 при 33-37С; возраст культуры клеток (2-7 суток); время адсорбции вируссодержащей суспензии (I- 1,5 - 2 ч), множественность заражения (0,0001-0,1 ТЦД50/клетка), рН питательной среды (6,0-7,8); вид сыворотки в поддерживающей среде (крупного рогатого скота, телят, эмбриона коровы, северных оленей, цыплят) и ее процентное содержание (2, 5 и 10%%).

В результате опытов изучили динамику накопления вируса, а также влияние некоторых биологических и химических веществ (ДЭ, ФГА, трипсин, ДМС0, ДЭАЭ-декстран) на титр вируса при культивировании. Была проведена адаптация штамма к чувствительным культурам клеток.

В результате серии опытов установили, что оптимальными условиями для накопления штамма РС-Б вируса являлись: использование 3-5 суточной культуры клеток ЛЭК и Л5Э и 3-х суточной FLKс предварительным 3-х кратным отмыванием монослоя от ростовой среды, в состав которой входит коммерческая сыворотка крови крупного рогатого скота или телят (10%),

Оптимальными условиями культивирования штамма К-18 были: использование 2-3 суточных культур клеток ТЭБ и ТБс предварительным 3-х кратным отмыванием монослоя клеток от ростовой среды. При использовании сыворотки эмбриона коровы производства фирмы Hyclone необходимость отмывания монослоя клеток отпадала.

В процессе адаптации штаммов вируса к различным культурам клеток установили, чтов 30 сериях коммерческих сывороток взрослого крупного рогатого скота и телят, используемых для культивирования культур клеток, присутствовали антитела к вирусу в титрах 4 - 7 lg2, отрицательно влияющие на сроки появления и характер ЦПД вируса и его репродукцию.

Множественность заражения составила 0,1 Т50/клетка; время адсорбции 1,5 ч с использованием питательной среды Игла MEM, Игла и RPMI - 1640 (2:1) с добавлением 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, сыворотки северных оленей или сыворотки цыплят при рН 7,4-7,8 с последующим инкубированием в стационарных или роллерных условиях при температуре 37С.

При данном режиме культивирования максимальное накопление вируса происходило на 6 сутки культивирования в ЛЭК и на 5 сутки в Л5Э иа FLK, а для штамма К-18 - в ТЭБ. Добавление ДЭАЭ-декстрана 50 мкг на 1 мл и ДМСО в 1%-ной концентрации повышало инфекционную активность вируса на 0,84 lg Т50/мл и 0,52 lg Т50/мл, соответственно.

В результате адаптации штамма к Л5Э и П5Э к 20-му пассажу титр вируса составлял 4,960,03 и 4,950,05 lg Т50/мл, соответственно. С помощью перемежающихся пассажей (1:2) из указанных диплоидных культур клеток провели адаптацию вируса к культурам клеток ЛЭК и FLK, в которых титр вируса к 10 пассажу достигал 4,820,07 и 4,83 0,04 lg ТЦД50/мл, соответственно. Дальнейшее пассирование вируса в этих культурах клеток не привело к повышению его инфекционной активности.

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
 Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии