Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Молекулярная биология и физиология запрограммированной смерти дрожжей

Автореферат докторской диссертации по биологии

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

Таким образом, посредством поднятия [Са ] в цитозоле амиодарон активирует дыхание и сопряжение митохондрий. Отражается ли это на уровне мембранного потенциала? Для ответа на этот вопрос мы использовали митотрекер Orange. Этот краситель накапливается в митохондриях в зависимости от величины ?? ? на их внутренней мембране. Как показано на рис. 4 (а), в контрольных клетках окрашивание митохондрий заметно только при увеличенном контрасте микрофотографии. В то же время амиодарон в широком спектре концентраций вызывал заметное увеличение интенсивности окраски (Рис. 46). Важно отметить, что амиодарону требовалось около 5 минут чтобы вызвать такое

контроль

Ayspl

феромон

-1Я7

		г".ва
	,

амиодарон, мкМ

с АФКа мертвые

0^ юнграст^а О

Г',

СП

-1-А-Н1Й?

Ч А-йда

Рис. 4. Эффекты феромона и амиодарона на Л? митохондрий опосредованы подъемом [Са]. Для полу-количестве иного определения ?? использовали митотрэкер Orange. А, 01 мг/мл альфа-фактор. Б, цифры под фотографиями указывают концентрацию амиодарона. В, Г, кальциевый ионофор А-23187 вызывает подъем ??, генерацию АФК (В, Г) и смерть клеток (Г). Масштаб - 10 мкМ.

увеличение, в то время как альфа-фактор вызывал подобный эффект (Рис. 4а) не менее чем через 30 минут (данные не приводятся).

Известно, что аномально высокий ?? митохондрий может вызвать формирование АФК, которые, в свою очередь, являются интермедиатом каскада апоптоза. Чтобы проверить подобное развитие событий в нашей системе мы протестировали кинетику формирования АФК после добавки амиодарона. Аналогично альфа-фактору, амиодарон вызывал резкий подъем скорости окисления pDCF-DA, при этом эффект амиодарона был значительно быстрее эффекта альфа-фактора (Рис. 5а,б). Как и ожидалось, подъем ?? несколько опережал подъем уровня АФК (Рис. 5а). Более того, тот факт, что антиоксиданты (N-ацетилцистеин и альфа-токоферол) в несколько раз повышали выживание после обработки амиодароном, указывает на функциональную роль АФК в каскаде смерти. Достаточен ли вызванный амиодароном подъем [Са ] в цитозоле для инициации клеточной смерти? Как показано на Рис. 4в,г, кальциевый ионофор А23187 также вызывал накопление АФК и клеточную смерть, но эффект амиодарона был сильнее (Рис. 2ж) Возможно, различие вызвано тем, что амиодарон вызывал значительно более быстрый подъем [Саа ] (данные не приводятся).

Чтобы изучить роль ?? на внутренней мембране митохондрий в каскаде клеточной смерти, мы предотвратили его подъем добавкой FCCP. Как и ожидалось, подъем ?? и АФК были заингибированы. Что существенно, FCCP повышал в несколько раз выживание клеток (Рис. 2в). Следовательно, подъем ?? - не побочный эффект, а необходимый этап развития каскада. Как оказалось, 0,4 мкМ FCCP было достаточно для этих влияний. Более высокий (6 мкМ) FCCP оказывал негативное влияние на выживание (Рис. 2в), и этот негативный эффект не является специфичным для FCCP, поскольку другой разобщитель (SF6847) в относительно большой концентрации также снижал выживание (данные не приводятся).

Тот факт, что малые концентрации разобщителя снижают АФК, указывает на то, что они образуются в Q-цикле. Чтобы это проверить, мы использовали ингибиторы двух стадий Q-цикла. Оказалось, что миксотиазол снижал образование АФК, а антимицин, наоборот, усиливал их генерацию (Рис. 2в). Эти факты полностью соответствуют предположению о Q-цикле (Рис. 2в). Наконец, антиоксиданты N-ацетилцистеин и альфа-токоферол усиливали выживание (Рис. 2в), подтверждая функциональную роль АФК в каскаде смерти.

Фрагментация митохондриальных филаментов часто сопровождает апоптоз клеток животных. Мы также замечали, что в моделях феромон- и амиодарон-зависимой смерти клетки также фрагментируют митохондрии (Рис. 4а,б). Ответом на вопрос, является ли эта фрагментация этапом каскада или побочным явлением, послужил предпринятый нами генетический скрининг. С помощью случайной инактивации генов мы искали

аа митотрэюера АФКаа фаза

Оа 30 60аа 90 120аа 150а 180

время (мин)

Рис. 5. Кинетика роста ?? и уровня АФКпод действием алъфа-фактора и амиодарона. А, ?? и АФК после добавки 80 мкМ амиодарона. Б, накопление АФК-содержащих клеток после добавки 0,1 мг/мл альфа-фактора. АФК детектировалисьаа с помощью 50 мкМ p-DCF-DA Масштаб - 10

МКМ.

делеционных мутантов, устойчивых к губительному действию альфа-фактора. Для этой мы мутировали дрожжи делеционной библиотекой (лаб. М. Снайдера). Потом мутированные клетки обрабатывались высокой дозой альфа-фактора, а после культура высевалась на твердую среду и выжившие мутанты вырастали в колонии. Кроме специфических мутантов по программе смерти, в первичном скрининге мы получали клетки с полностью инактивированным ответом на феромон (стерильные клетки, как мутант ste20), а также клетки с потерянной респираторной функцией митохондрий (петиты). Чтобы исключить последние две категории мы протестировали полученных

Yipl-GFP

митотрэир

??????????

АФК

Ayipl,

30 мин

йсусЗ.

30 чип

+ FCCPQ,4MitM

30 ыин

дга;13!ттш, 30 ня

дакийтип, 2D мни.

Б днхнн пш, бсздебмм	ДНККЙТНП. + пмнодерои
Юн	\	#1а *

ш *	1	. а , iаа .1
Г '.-. ж	\|	V-v^
^в	у

Ayspl,

+ ?М№>Д4рОН

дикий тип,

+ амнод&роц MAC

uyspl, 20 мни.

20 млн

+ FCCP0r4MxM

20 мин

дикий тип, ЗОмин

дикий пш, |J мин

дихнн пш.

Ошш

ID' ТО1

флуоресценция

дао;ни тип, 0 мин. Ю" W W"??*

флуорг{цлнцня

Рис. 6. окализация и функция Yspl. А, ко-локализация Yspl-GFP и митотрэкера Orange. Масштаб - 10 мкм. Вверху показана рассчитанная структура Yspl, содержит плекстриновый домен и два транс-мембранных домена. Б, Ysp 1 необходим для фрагментации митохондрий после обработки амиодароном. Изображения получали путем объединения 20 оптических срезов через клетку. Масштаб - 10 мкм. В, Определение ?? и АФК в клетках методом FACS. Амиодарон (80 мкМ) был добавлен в момент времени 0 мин.

мутантов на способность спариваться и на способность роста на несбраживаемом источнике углерода.

В результате мы нашли один ген, YHR155W, делеция которого не снижала концентрацию альфа-фактора, необходимую для индукции шму, и не препятствовала росту на глицерине (данные не показаны). Ген кодирует предположительно трансмембранный белок без выраженных гомологии с генами высших организмов и содержащий плекстриновый домен. Мы назвали белок Yspl (от yeast suicidal protein). С помощью микроскопии клеток, экспрессирующих Yspl слитый с зеленым флуоресцентным белком (GFP-Yspl) мы обнаружили, что конструкция ко-локализуется с митотракером (Рис. 6а), то есть с митохондриями. Как и ожидалось, инактивация YSP1 снижала смертность как в модели

феромон-зависимой смерти (данные не приводятся), так и при обработке амиодароном (Рис. 2в)

Как показано на рис. 66, амиодарон вызывает полную фрагментацию митохондриальных филаментов, а делеция YSP1 существенно снижает этот эффект. В то же время эта мутация не снизила подъем ?? (Рис. 4а и 6в) и АФК (Рис. 6в), подтверждая, что амиодарон-зависимая генерация АФК как таковая не является летальной, но служит сигнальным этапом каскада смерти.

Поскольку амиодароновая модель клеточной смерти является схожей и одновременно более быстрой и эффективной по сравнению с феромон-зависимой системой, мы предприняли попытку скрининга генов, ответственных за амиодарон-зависимую смерть. Как и в случае с альфа-фактором был произведен случайный мутагенез клеток делеционной библиотекой, после чего мутанты тестировали на устойчивость к амиодарону. Мы ожидали, что устойчивость может возникать как от инактивации непосредственной программы смерти, так и от гипер-стабилизации гомеостаза кальция. Чтобы исключить мутантов второго типа, выжившие клетки тестировали на способность накапливать митотрэкер Orange в митохондриях после обработки амиодароном. Иными словами, искали мутантов, похожих по фенотипу на Ayspl.

В результате было обнаружено, что инактивация гена YDR326c приводила к существенному (в 5 раз) увеличению выживания после обработки амиодароном (Рис. 76), и при этом не предотвращала генерацию АФК (Рис. 7 а). Как и в случае с YSP1, делеция YDR326C существенно ингибировала амиодарон-зависимую фрагментацию митохондрий (Рис. 7в). Поскольку ген YDR326c к тому моменту был неохарактеризован, мы назвали его YSP2 (по аналогии с YSP1). Подобно YSP1, YSP2 не имеет выраженных гомологии среди генов высших организмов и предположительно кодирует продукт с транснмембранным доменом.

Интересно, что в этом скрининге мы также выделили мутантов с делецией YSP1 (данные не приводятся), что еще раз указывает на сходство феромонового и амиодаронового каскадов смерти. Суммируя данные по этим двум каскадам, можно их объединить в одной схеме (Рис. 8). Схема предполагает, что феромон гипер-активирует МАР-киназный путь (этапы 2-4), что приводит к повышению концентрации кальция, достаточному для инициации митохондриальных изменений (этапы 5-9), приводящих в итоге к клеточной смерти.

контраа ?????а unmalаа Дугр2

Рис. 7. окализация и функция Ysp2. А, в контроле после добавки амиодарона АФК окрашивают всю клетку, а в Aysp2 АФК - в структурах, морфологически похожих на митохондрии. Б, деления YSP2 повышает устойчивость и предотвращает фрагментацию митохондрий (В) после обработки амиодароном. Г, Снижение рН в среде вызывает образование АФК только в присутствии ацетата. Как и в панели А, заметна У8Р2-зависимое различие в локализации АФК. Г, делеция YSP2 повышает устойчивость к ацетату, рН=3. Масштаб - 5 мкм.

Используется ли рассмотренный выше каскад в других сценариях физиологического самоубийства дрожжей? Классическая экспериментальная система для изучения смерти дрожжей - хронологическое старение, т. е. старение в стационарной культуре. Этот вид смерти можно считать активным. Действительно, дрожжи, помещенные в воду, не теряют жизнеспособности в течении года, а дрожжи в стандартной питательной среде (YPD) умирают через 2-3 недели после достижения стационарной плотности. Большой объем публикаций указывает, что основная причина смерти в стационаре - закисление среды из-за накопления уксусной кислоты. Кроме того, известно, что уксусная кислота вызывает появление маркеров апоптоза и смерть дрожжей (см. работы и обзоры Ф. Мадео [Madeo]). Исходя из этих предпосылок, мы протестировали роль белка Ysp2 в ацетат-зависимой смерти дрожжей. Оказалось, что делеция YSP2 не снижает АФК, индуцированные уксусной кислотой (Рис. 7г), и в то же время (как и делеция гомолога про-апоптозной протеазы, гена NMA111) в несколько раз увеличивает выживание (Рис. 7д).

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Blog

Молекулярная биология и физиология запрограммированной смерти дрожжей