Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
Технология производства и обеспечение качества синбиотиков ЛАКТОСУБТИЛ-ФОРТЕ и АВИЛАКТ-ФОРТЕ. эффективность их применения в птицеводстве
Автореферат докторской диссертации по биологии
|
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТАСостояние культур бактерий контролировали микроскопированием.
Изготовление готовых форм препаратов. Для пробиотиков разработано две готовые формы - жидкая и сухая. После культивированияа и контроля качества продукта в первом случае фасовали в первичную тару и укупоривали, во втором - фасовали в кассеты и подвергали сублимационному высушиванию по режимам, разработанным для двух питательных сред: МС и ФЗ.а Количество живых бактерий в сухом материале составляла не менее 3х109КОЕ/г и 1х1011КОЕ/г для L. acidophilus и B. subtilis соответственно. Жидкий препарат расфасовывалиа в стеклянную или полиэтиленовую тару, предназначенную для лекарственныха средств иа пищевых продуктов. Сухой препарат расфасовывали в полимерные пакеты.а
3.3.1.2. Технологияа производства пребиотика АВИСТИМ.а Культивирование гриба F. sambucinum. Посевной материал (P.s) получали культивированием в колбах со средой МС или ФЗ при температуре (261)0С на качалке (g=160 об/мин). Время культивирования пассажей: первого - 96 часов, второго - 48часов, третьего и последующих - 24 часа. Контролировали микроскопированиема состояние культуры, определяли накопление биомассы - 5-6 г/дм3 (одинаковое для обеих сред) и использовали для культивирования в биореакторе при следующих параметрах: объем P.s. - 2-4%; температура - (272)0С; время - 30-34 часа; перемешивание постоянное (g=120 об/мин.); барботаж воздухом (при 1,1 атм); остаточное давление 0,25 атм;а начальное значение рН 5,5-6,0; процесс заканчивали при снижении рН до 4,10,5. Через 12 часов после начала процесса отбирали пробы (1 раз каждые 3 часа) для определения рН среды, концентрации биомассы, контроля состояния мицелия. После окончания процесса культуральную средуа подкисляли до рН 3.,0-3,5 и выдерживали в течение 1-3 часов. Концентрация биомассы составляла 10-12 г/дм3, содержание белка а- 46-53%.
аПолучение готовой формы препарата. КЖ отделяли от биомассы фильтрацией на нутч-фильтрах (фильтрующая ткань типа лавсана, разрежение 0,05-0,07 МПа, скорость 90-110 л/м2/мин.), подвергали стерилизующей фильтрации иа расфасовывалиа в стекляннуюа или полиэтиленовую тару.
3.3.1.3. Технологияа производства белковой кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ. аКультивирование дрожжей-сахаромицетов. Посевной материал (P.s.) культивировали в колбах со средой МС или ФЗ на качалке (g=160 об/мин.) при температуре (331)0 С и рН 4,5-5,5 в течение 24-36 часов до полного потребления свободных углеводов. Контролировали состояние культуры, определяли концентрацию биомассы (23-25 г/дм3), содержание остаточных РВ в культуральной среде (0,1-0,2%) и использовали для культивирования в биореакторе при следующих параметрах: объем посевного материала - 4-5%; (P.s) начальное значение рН 5,00,5; температура - (311)0С; время - 18-19 часов; постоянное перемешивание (g=120 об/мин.), аэрация (1 дм3 воздуха/1 дм3 среды,а расход воздуха 7-9 м3/час); конечная концентрация биомассы - 20-25 г/дм3, асодержание РВ в средеа - 0,1-0,2%.
В качестве биокатализатора при культивировании дрожжей в промышленном биореакторе использовали КЖ гриба, которую добавляли в ферментолизат в количестве 0,1-1,0% от объема среды. При добавлении в питательную среду КЖ сокращалось время накопления биомассы с 19 до 10 часов, увеличивалась скорость потребления сахаров (на 32,1%), минерального азотаа (на 21,5%)а и фосфораа (на 45,4%).
аПолучение готовой формы препарата. Биомассуа подвергали плазмолизу при 800 С в течение 1 часа, контролировали на отсутствие живых клеток и сушили на распылительной сушилке типа Niro Atomizer (температура на входе - 3000 С, на выходе - 950С). В полученном продукте содержание сырого протеина составляло40-45%, истинного белка - 30-38%.Сухой препарат фасовали в полимерные пакеты.а
3.3.2. Разработка схемы доклинических исследований (ДИ) препаратов.
Исходя из общих требований к проведению ДИ, нами разработана для данного класса препаратов схема ДИ по основным показателям - безопасности, специфической активности и стабильности. Определена номенклатура показателей, методы их определения и допустимые значения. Методическую часть работы выполняли с использованием лабораторных рабочих эталонных материалов (ЛРЭМ).
3.3.2.1. Определение безопасности. Поскольку разрабатываемые препараты предназначены адля птицы, в качестве критериев оценки безопасности нами определены: отсутствие контаминации препарата посторонней микрофлорой, отсутствие токсичности для эмбрионов кур и безвредностьа для цыплят суточного возраста. Поскольку КЖ агриба впервые использована в качестве пребиотика для птиц, для нее введен дополнительный контроль - отсутствие потенциального раздражающего действия на слизистые оболочки ЖКТ. Требования к кормовой добавке ЦЕРЕВЕТ гармонизированы с существующей в РФ базой НДа на кормовые добавки (в том числе и кормовые дрожжи), для чего введены дополнительные контроли на отсутствие металломагнитных примесей и живых клеток дрожжей, а контроль на отсутствие контаминации посторонней микрофлоройа заменен на определение токсичности экспресс-методамиа на инфузориях и общей бактериальной обсемененности.
Для контроля безопасности нами разработаны новые методы с использованием биотестирования на моделях доорганизменного уровня: тест эмбриотоксичности и модифицированный ХЕТ-КАМ тест.
Токсичность для куриных эмбрионов (тест эмбриотоксичности). Развивающиеся эмбрионы кур (РЭК) занимают среднее положение по чувствительности к токсическим веществам между лабораторными животными и культурой клеток и являются удобной моделью для оценки острой токсичности. Нами разработан и использован в аДИ тест эмбриотоксичности - аэкспресс-тест, принципа которого заключался в следующем: 9-10 суточным SPF-эмбрионама в аллантоисную полость вводили 0,1-0,2 см3 препарата и инкубировали при температуреа (37+0,5)оС до вывода цыплят, учитывая раз в сутки количество погибших эмбрионов. Критерием эмбриотоксичности препарата являлась эмбриональная смертность, суммированная по всем дням инкубации, а также состояние вылупившихся цыплят (отсутствие уродств и внешних патологий). Контроль служили интактные и инокулированныеа физиологическим раствором (ФР) по 0,1-0,2 см3 эмбрионы.
Потенциальное раздражающее действие на слизистые оболочки ЖКТ. Для определения потенциального раздражающего действия КЖ на слизистые оболочки ЖКТа использовалиа ХЕТ-КАМ тест в нашей модификации.Принципа ХЕТ-КАМ теста: раздражающее действие исследуемого вещества моделируется наа хориоаллантоисной оболочке (ХАО) 9-10 суточных развивающихся SPF эмбрионов кур (Лукьянов А.С., 1998). На ХАО наносили 0,5 см3 испытуемого раствора и наблюдали с помощью бинокулярного микроскопа за состоянием оболочки под каплей раствора. При отсутствии раздражающего действия за период наблюдения (1-3 мин) оболочка не должна нарушаться, сеть кровеносных сосудов и капилляров должна функционировать нормально. Изменения на оболочке могут выражаться в замедлении тока крови и тромбозе отдельных капилляров, покраснении оболочки или выходе из капилляров форменных элементов крови, остановке кровотока. Поскольку исследуемые объекты относятся к нетоксичным соединениям иа не могут обладать сильным раздражающим действием, тест нами модифицирован: 1) при наблюдении за изменениями на ХАО выбирали поле с мелкими сосудами и капиллярами; 2) время наблюдения увеличено до 10 минут; 3) реакцию считали положительной (+), если изменения наступали через 3-5 минут наблюдения; слабоположительной (+-) при наблюдении изменений в интервале 5-10 минут; отрицательной, если изменения не наступали в течение 10 минут; 4) состояние ХАО фотографировали; 5) в качестве положительного контроляа использовали 70%-ный этиловый спирт, обладающийа выраженным раздражающима действиема на слизистые, отрицательного контроля а- физиологический раствор, не раздражающий слизистые.
Определение безвредности для суточных цыплят. Суточнымцыплятам-бройлерама перорально однократно вводили препараты АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ в дозах 109КОЕ и 1010КОЕ/гол. соответственно; АВИСТИМ выпаивали в дозе, равной 50% суточного объема воды; ЦЕРЕВЕТ давали с кормом (3% от суточной нормы корма). Цыплят наблюдали в течение 10 суток, регистрируя их состояние (активность, аппетит, динамику массы, поведенческие реакции) и уровень падежа.
3.3.2.2. Определение специфической активности. Специфическую активность пробиотиков оценивали по подлинности, количеству жизнеспособных микроорганизмов, антагонистической активности in vitro иа in vivo,а резистентности к антибиотикам. Для биологически активных добавок (в частности пребиотиков), которые являюстя поликомпонентными по своему составу и полифункциональными по механизму действия, в настоящее время не существует общепринятых подходов к определению показателей их специфической активности. Нами определены интегральные показатели состава и определяемого им физиологического действия.а Благодаря своему составу КЖ может обладать антиоксидантным действием, которое является одним из антистрессовых механизмов, его величина (антиоксидантная активность - АА) может служить показателем специфической активности препарата. Поэтому для характеристики пребиотика выбраны следующие показатели: содержание сухих веществ, авеличина рНа и АА. Специфическую активность кормовых добавок характеризовали по питательной ценности, которая согласноа НД на кормовые добавки определяется содержанием в них белка, углеводов, липидов, а также сухих веществ.
Определение подлинности бактерий-пробиотиков устанавливалиа общепринятым методом окрашивания по Граму.
Количество жизнеспособных микроорганизмов в препаратах АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ определяли стандартным методом подсчета колоний. Метод характеризуется большим разбросом данных, поэтомупроведена стандартизация условий определения количества жизнеспособных лактобактерий по разработанной нами и утвержденной директором ВНИТИБП Методике построения гистограмм для оценки стабильности и точности технологических процессов и операций. аПо результатам статистической обработки многократного (n = 68) определения количества жизнеспособных лактобактерий в образцах ЛРЭМ построенаа гистограмма распределения данных, определеноа среднее значение количества жизнеспособных бактерий
( ) и его среднеквадратичное отклонение ( ): = (6,7 0,5)х108 КОЕ/см3. Характер гистограммы свидетельствовал о нормальном характере распределения данных и, следовательно, о стабильности результатов определения показателя в контролируемых сериях препарата. Если полученное для ЛРЭМ значение количества жизнеспособных лактобактерий укладывалось в интервал (6,7 0,5)х108 КОЕ/см3, то условия определения считали стандартными, а полученное значение в контролируемой серии - достоверным при указанной величине ошибки определения.
Определение антагонистической активности (АнтА) препаратов АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛа по отношению к патогенным микроорганизмам в опытах invitro.а По данным, полученным при характеристике штаммов и контроле посевных материалов, установлены минимально допустимые значения АнтА для L. acidophilus (зона задержки ростаа эшерихий - не менее 7 мм, сальмонелл - не менее 6 мм) и B. subtilis (зона задержки ростаа эшерихий - не менее 15 мм, сальмонелл - не менее 10 мм). Для стандартизации условий определения АнтА использовали образцы ЛРЭМ. Если получали значения АнтА ниже заданных показателей, проводили повторное исследование параллельно с образцом ЛРЭМ. При подтверждении полученного результата серию считали не прошедшей контроль по данному показателю.Наличие антагонистической активности препаратов, установленное в опытах in vitro, подтвердилиа исследованиями АнтА в опытаха in vivo.
Определение антагонистической активности пробиотикова в опытах invivo. Величину АнтА определялиа по выживаемости цыплят при контрольном заражении патогенным изолятом E. coli, выделенным в ЭПХ из организма больной птицы. Работа по выделению изолята и определению его патогенности для мышей (500 млн.кл./гол.) проведена совместно с ВГНКИ ветпрепаратов. Для цыплят 10-суточного возраста при внутримышечном введении 10-кратных разведений культуры E.coli определили летальную дозу (ЛД50) и ее доверительный интервал (Р? 0,05) для контрольной группы (К) и групп, получавших L. acidophilus аи B.subtilis (Л и Б соответственно): lg ЛД50 (К) = - 2,9 0,2;а lg ЛД50 (Л) = - 2,4 0,2 и lg ЛД50 (Б) = - 1,92 0,2. Показано, что препараты обладали антагонистической активностью по отношению к патогенной культуре E. сoli, т.к. защищали 30 и 40% птицы (соответственно) при контрольном заражении.
Определение резистентности препаратов АВИЛАКТ-1К и АВИСУБТИЛ к антибиотикам. Для стандартизации условий определения резистентность препаратов сравнивали со значениями, полученными при характеристике штамма-продуцента и контроле посевных материалов. Если получаемые значения были ниже заданных показателей, проводили повторное исследование параллельно с образцом ЛРЭМ.
Определение антиоксидантной активности (АА) пребиотика АВИСТИМ. С помощьюа прибора Яуза--01 на базе ОАО НПО Химавтоматика нами исследована АА трех образцов КЖ, полученных при изготовлении посевного материала, в сравнении с маркером дигидрокверцетином. Препарат АВИСТИМ обладал выраженной антиоксидантной активностью, превышающей АА маркера в 5,5-5,9 раза.
Для стандартизации состава пребиотика АВИСТИМ общепринятыми методами определили содержание в КЖ сухих веществ (ГОСТ Р 52838) - не менее2,5% и величину рН (фармстатья аОФС 42-0048-07, Х11 изд. Гос. Фармакопеи РФ) - 6,6-7,0.
Состав кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ стандартизовали по минимально допустимому содержанию белка (38% АСВ) и максимально допустимому содержанию липидов (10%) и углеводов (28%). Сравнение химического состава ЦЕРЕВЕТа и аналогичной ему лечебно-профилактической добавки Естур (США) показало, что ЦЕРЕВЕТ содержал больше белка (на 36,3%), макро- и микроэлементов (фосфора - на 13,8%, кальция - на 39,4%, железа - в 3 раза, марганца - в 2,8 раза), аминокислот (лизина, аргинина, фенилаланина, треонина и триптофана - в 1,5-2 раза).
3.3.2.3. Определение стабильности препаратов. Стабильность препаратов оценивали с целью определения их сроков годности и условий хранения.
Исследование стабильности препарата АВИЛАКТ-1К. На образцах ЛРЭМаа определяли сохранность живых бактерийа (в жидкой и сухой формах) при повышенных температурах (термостабильность) и при длительном хранении. Исследование термостабильностиосуществляли согласно разработанным с нашим участием Методическим рекомендациям по исследованию стабильности иммунобиопрепаратов на этапе разработки и в условиях действующего производства.
Исследование термостабильности жидкой формы препарата.При прогревании жидких образцов трех серий препаратаа в течение 15 минут при температурах 40, 45, 50, 55, 600С показано, что при 500С в течение 15 минут количество живых клеток снижалось, в среднем, на 52%, поэтому при 500С исследовали кинетику инактивации бактерий в течение 5, 10, 15, 20, 25 и 30 минут. Статистическая обработка показала, что снижение количества жизнеспособных бактерий в суспензии зависело от продолжительности теплового воздействия и описывалось (коэффициента корреляцииа r*= -0,92) кинетическим уравнением первого порядка lg y = lg y0 - Kt,а где: y0 а- исходная активность препарата; y - величина активности через время t; K - константа скорости инактивации (сек-1). Рассчитана величина КТ = -1,6х10-3 сек-1. В качестве экспресс-теста оценки стабильности препарата АВИЛАКТ-1К в жидкой форме рекомендован тест лускоренного старенияа - 500С в течение 15 минут.
Исследованиеа термостабильности сухогоа препаратапроводили по аналогичной схеме.а При 600С в течение 30 минут количество живых клеток снижалось, в среднем, на 44,4%. При температуре 600С (10,а 20, 25, 30, 40 и 50а минут) исследовали кинетику инактивации бактерий. Показано,а что, как и для жидкого препарата, снижение количества жизнеспособных бактерий в суспензии имело линейный характер (коэффициента корреляцииа r*= -0,93), КТ = -3,8х10-4 сек-1. Условия теста лускоренного старения для препарата в сухой форме а- 600С в течение 30 минут.
Стабильность препарата при хранении определяли по снижению количества живых лактобактерий в течение 12 месяцев при 8-100С и при комнатной температуре 18-200С. Установлено, что с учетом определенной нами ошибки титрования (0,5 lg КОЕ/см3) достоверное снижение количества жизнеспособных лактобактерий в препарате начиналось: для жидкой формы через 4 месяца хранения при 8-10С и после 1месяца - при 18-20С; для сухой формы через 8 месяцев хранения при 8-10С и после 4 месяцев - при 18-20С. Исходя из этого, определен срок годности жидкого препарата 3месяца, сухого пренпарата - 9 месяцев приа температуре 8-10С.
Исследование стабильности препарата АВИСУБТИЛ. Стабильность препаратаопределяли по снижению количества живых бактерий при 8-100С и при комнатной температуре 18-200С в течение 12мес. Показано, что жизнеспособность бактерий в препарате достоверно сохранялась: для жидкой формы в течение 10 месяцев хранения при 8-10С и 8 месяцев - при 18-20С; для сухой формы в течение 12 месяцев хранения при 8-10С и 18-20С. Установлен срок годности жидкого препарата 9 месяцев, сухого пренпарата - 12 месяцев приа 8-10С.
Исследование стабильности препарата АВИСТИМ. Стабильность препарата оценивали по отсутствию осадка в течение 12 месяцев хранения при температуре 8-100С.а Осадок появлялся ачерез 4-5 месяцев, рН препарата за этот период не менялся. Определили срок хранения препарата - 3 месяца при 8-100С.а
Срок и условия хранения препарата ЦЕРЕВЕТ установлены согласно аналогичным требованиям, заложенным в нормативную документацию на родственные препараты кормовых дрожжей (ГОСТ 20083-74): 6 месяца при 8-100С.аа
3.3.3. Изготовление и контроль опытно-промышленных серий препаратов.
По разработанной технологии в условиях опытного производстваа ВНИТИБП изготовлено: 17 серий пробиотикаа АВИЛАКТ-1К (7 серий в жидкой формеа и 10 серий - в сухой); 13 серийа пробиотикаа АВИСУБТИЛа (7 серий в жидкой формеа и 6 серий - в сухой); 7 серий пребиотикаа АВИСТИМ; 8 серий белковой кормовой добавки ЦЕРЕВЕТ. Все серии прошли ДИ в соответствии с разработанной схемой. Полученные результаты контроля по всем показателям соответствовали установленным нормам, что свидетельствовало о воспроизводимости разработанной технологии. Разработаныа и утверждены в установленном порядке технологические регламенты производства и стандарты организации (ТУ).
|
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии