Экспериментальная фармакотерапия повреждений почек растительными лекарственными средствами 14. 00. 25 фармакология, клиническая фармакология
| Вид материала | Автореферат диссертации |
- «Экспериментальная и клиническая фармакология» журнал к сведению, 84.61kb.
- Комплексная фармакотерапия тяжелых форм псориаза с учетом биохимических и иммунологических, 218.32kb.
- Комплексная фармакотерапия тяжелых форм псориаза с учетом биохимических и иммунологических, 211.59kb.
- Клиническая эффективность и фармакоэпидемиология лекарственных средств у детей с аллергическим, 462.25kb.
- «Клиническая фармакология» Специальность: 111201 Ветеринария Пояснительная записка, 94.74kb.
- Программа вступительных испытаний для специальности магистратуры 1-79 80 10 Фармакология,, 197.39kb.
- Антиметастатическая активность препаратов природного происхождения 14. 00. 25 фармакология,, 1023.15kb.
- Оптимизация фармакотерапии плоского лишая 14. 00. 25. фармакология, клиническая фармакология, 214.56kb.
- Лекарственные растительные средства в профилактике респираторных заболеваний у детей, 439.68kb.
- Оптимизация противотромботической терапии острого инфаркта миокарда 14. 00. 06 кардиология, 862.58kb.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов исследования были использованы растительные полиэкстракты: нефрофит (условное название) и фитоуросепт (условное название), а также сухой экстракт из корней и корневищ сабельника болотного - эксабол (условное название).
Нефрофит представляет собой четырехкомпонентный сухой экстракт, полученный из сырья ортосифона тычиночного (^ Orthosiphon stamineus Benth.), горца птичьего (Polygonum aviculare L.), толокнянки обыкновенной (Arctostaphylos uva- ursi L.) и десмодиума канадского (Desmodium canadense (L.) D.S.), взятых в соотношении 4,0 : 3,5 : 2,0 : 0,5 масс. частей. На способы получения сухих экстрактов из указанных растений получены патенты № 1737797 от 15.03.1993 г.; № 2064301 от 27.06.1997 г.; № 2064300 от 27.07.1996 г.; № 1828590 от 22.12.1993 г. Основным действующим началом нефрофита является полифенольный комплекс. Стандартизация нефрофита проводится по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин и кверцетин.
Фитоуросепт представляет собой сухой экстракт из следующих видов растительного сырья: горца птичьего (^ Polygonum aviculare L.), толокнянки обыкновенной (Arctostaphylos uva-ursi L.), брусники обыкновенной (Vaccinium vitis idaea L.), крапивы двудомной (Urtica dioica L.) и календулы лекарственной (Calendula officinalis L.), взятых в соотношении 3,0 : 2,0 : 2,0 : 1,5 : 1,5 масс. частей. На способ получения фитоуросепта получен патент РФ № 2237488 от 10.11.2004 г. В состав экстракта входит сумма экстрактивных веществ, представленных комплексом веществ полифенольной природы. Стандартизация его осуществлена по сумме флавоноидов и фенологликозидов в пересчете на рутин и арбутин.
Эксабол представляет собой сухой экстракт, полученный из корней и корневищ сабельника болотного (^ Comarum palustre L.). На способ получения эксабола получен патент РФ №2318531 от 10.03.2008 г. В составе экстракта сумма полифенольных соединений, аминокислоты, полисахариды. Стандартизация осуществляется по сумме полифенольных соединений в пересчете на (+)-катехин.
В качестве препаратов сравнения использовали леспенефрил (Франция) и канефрон (Германия), а также другие средства по условиям эксперимента в изоэффективных дозах. Перед применением настойки деалкоголизировали путем выпаривания на водяной бане до 1/10 от исходного объема, полученный остаток доводили дистиллированной водой до исходного объема (Руководство …, 2000).
Эксперименты выполнены на 1885 белых крысах линии Wistar обоего пола массой 190 – 230 г; 120 мышах линии CBA и F1 (CBA x C57 B1/6) массой 18 – 20 г. Животные находились в стандартных условиях содержания в виварии Института общей и экспериментальной биологии СО РАН на обычном для указанных видов животных рационе (Приказ МЗ СССР № 1179 от 10.10.83 г.). Эксперименты проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г.) и «Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей». Эвтаназию животных осуществляли методом мгновенной декапитации под легким эфирным наркозом. В работе были использованы также модельные системы и культуры тканей: 1 % суспензия эритроцитов донорской крови; культура мононуклеарных лейкоцитов (Boyum, 1968); суспензия липосом из яичного желтка (Лопухин и соавт., 1983); микросомальные препараты коры больших полушарий мозга человека; культуры условно-патогенных микроорганизмов; препараты отрезков тонкого кишечника белых крыс; биохимические тест-системы.
С целью оценки функционального состояния почек животных определяли: диурез по общепринятому методу без нагрузки и с 2,5 % водной нагрузкой (Берхин, Иванов, 1972); концентрацию катионов натрия и калия в моче - методом пламенной фотометрии на приборе “Flapho 4” (Германия). Депурационную функцию почек оценивали по содержанию мочевины и креатинина в сыворотке крови и моче - унифицированными методами с использованием наборов реактивов Био-Ла-Тест “Лахема”; содержание белка в моче - реакцией с сульфосалициловой кислотой (Меньшиков и соавт., 1987); оценку скорости клубочковой фильтрации (СКФ)- по клиренсу эндогенного креатинина; интенсивность канальцевой реабсорбции - общепринятым методом (Рябов, Наточин, 1997). Функциональное состояние печени животных оценивали по активности щелочной фосфатазы (ЩФ), аланинаминотрансферазы (АлТ) и аспартатаминотрансферазы (АсТ) в сыворотке крови (Меньшиков и соавт., 1987); содержанию гликогена в печени (Seifter, 1953).
Изучение антиэкссудативной активности указанных средств проводили на моделях острого асептического воспаления задней конечности животного и острого перитонита. Асептическое воспаление моделировали путем однократного субплантарного введения в заднюю конечность белых крыс растворов: 3% формалина (Стрельников, 1960), 6% декстрана (Лещинский, 1976), 0,5 % гистамина гидрохлорида (Александров и соавт., 1986), 1 % раствора каррагенина (Winter, 1962) в объеме 0,1 мл. Острый перитонит у крыс вызывали внутрибрюшинным введением 1 мл 0,2% раствора серебра нитрата (Александров и соавт., 1986). Оценку влияния указанных фитосредств на образование фиброзно-грануляционной ткани осуществляли по методу Ф. Тринус и соавт. (1975). Для определения влияния средств на процессы альтерации воспалительный процесс моделировали по методу Menkin (Ойвин, Шетель, 1961) путем подкожного введения белым крысам в область спины 0,5 мл 9 % раствора уксусной кислоты. Определение влияния растительных средств на сосудистую проницаемость осуществляли на модели 24-х часового иммобилизационного стресса у крыс с использованием метода меченых сосудов (Горизонтова и соавт., 1975). Влияние растительных средств на скорость циклооксигеназной реакции in vitro определяли полярографически по интенсивности поглощения кислорода (Vane, 1996).
Изучение антибактериальной активности указанных средств осуществляли методом двукратных серийных разведений в жидкой среде (Першин, 1971). В качестве тест-объектов использовали музейные штаммы: Escherichia coli 408, Staphylococcus aureus 209P, Proteus vulgaris H 50, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa. Микробная нагрузка составляла 250000 клеток в 1 мл.
Исследование спазмолитической активности растительных средств проводили на изолированном отрезке тонкой кишки белых крыс (Furchgott, 1967).
Определение мембраностабилизирующей активности данных фитосредств осуществляли по степени их влияния на перекисный и осмотического гемолиз эритроцитов (Ковалев и соавт., 1986).
Иммуномодулирующее действие растительных экстрактов оценивали по их влиянию на состояние клеточного, гуморального и макрофагального звеньев иммунитета на фоне иммунодефицита, вызванного введением классического иммунодепрессанта азатиоприна в объеме 0,1 мл/мышь в дозе 50 мг/кг перорально 1 раз в сутки в течение 5 дней (Лазарева, Алехин, 1985). Состояние клеточного звена иммунного ответа определяли в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (Петров и соавт., 1987), гуморального - по числу антителообразующих клеток (АОК), определяемых методом локального гемолиза (Cunningham, 1965), макрофагального - в реакции фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей в отношении Staphyllococcus aureus in vitro по методике И.С. Фрейдлин (1976).
При исследовании стресспротективной активности фитоэкстрактов использовали модель иммобилизации белых крыс на спине в течение 24 часов с определением «триады Селье» и язвенного индекса Паулса (Амосова и соавт., 1998).
Изучение анаболической активности указанных средств проводили с использованием модели односторонней нефрэктомии. В гомогенате почек определяли содержание общего белка по методу Лоури (Lowry, 1951), концентрацию РНК и ДНК – по методу Шмидта, Тангаузена в модификации М.Г. Трудолюбовой (1977).
Концентрацию общего холестерина (ОХ), триацилглицеридов (ТГ), липопротеидов низкой плотности (ЛПНП), липопротеидов очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) в сыворотке крови определяли на биохимическом анализаторе «DIANA» с использованием аналитических наборов фирмы «Cormay» (Польша). Коэффициент атерогенности (КА) рассчитывали по формуле: КА = (ОХС-ХС ЛПВП)/ХС ЛПВП.
Показатели периферической крови определяли на автоматическом гематологическом анализаторе «Абакус», влияние испытуемых средств на показатели системы гемостаза у белых крыс определяли по методике Б. Беркарда в модификации Л.З. Баркагана (Методы…, 1993), также по скорости образования фибринового сгустка крови на тромбоэластографе «Тромб-2» (Россия).
Влияние указанных средств на интенсивность индуцированного апоптоза определяли по активности каспазы-3 с использованием набора реактивов «Caspase assay kit» (Sigma), концентрацию белка в пробах определяли по методу Thorne (1978).
Оценку влияния растительных средств на активность “ Na+, K+-АТФазы осуществляли с использованием пара-нитрофенилфосфатного метода (Болдырев, 1986).
Антиоксидантные свойства фитосредств оценивали по их влиянию на интенсивность образования продуктов свободнорадикального окисления (СРО) и эндогенную антиоксидантную систему (АОС) организма с использованием методов in vivo и in vitro. Концентрацию ТБК-активных продуктов определяли спектрофотометрически в сыворотке крови (Asakawa, 1979) и в гомогенате почек (Стальная, Гаришвили, 1977). Содержание диеновых конъюгатов (ДК) в сыворотке крови определяли спектрофотометрическим методом (Гаврилов, Мишкорудная, 1983). В эритроцитах определяли содержание восстановленного глутатиона (ВГ) (Anderson, 1989); активность супероксиддисмутазы (СОД) (Чевари и соавт., 1985), каталазы (Королюк и соавт., 1988), глутатионпероксидазы (ГП) (Flon, 1988). Определение влияния испытуемых средств на скорость генерации супероксидного анион-радикала (О2 - ) осуществляли по Nichikimi et al. (1972) и Chen A.-S. et al. (2003). Антирадикальную активность по отношению к NO· определяли по методу Govindarajan R. еt al. (2003); связывание H2O2 - по методу Chen A.-S. et al. (2003); общую антиоксидантную активность - по методу Кузьменко-Лаптева (1999). Определение влияния испытуемых фитосредств на Fe2+-индуцированную хемилюминесценцию плазмы крови и суспензии липосом проводили на приборе «Хемилюминометр РХL–01» (Россия) по общепринятому методу (Сергеев и соавт., 1991). Хелатирующие свойства фитосредств определяли фенантролиновым методом (Методы …, 1987).
Для патоморфологических исследований почки животных фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина и фиксаторе Буэна (Микроскопическая техника…1975). Депарафинированные гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином (Киселева и соавт., 1983). Для проведения морфометрических исследований и микрофотографирования использовали цифровой микроскоп Motic DMW B1-223 с использованием программного обеспечения «Motic Images-2000».
^ Двустороннюю ишемию почек воспроизводили путем выделения почек крыс из жировой капсулы и окклюзии сосудистых пучков обеих почек на 60 мин (Шепотиновский и соавт., 1989). Сулемовый некронефроз у крыс вызывали однократным внутрибрюшинным введением водного раствора сулемы в дозе 2 мг/кг (Соколова и соавт., 1975). Модель гепаторенального синдрома воспроизводили путем подкожного введения крысам 50 % (V/V) масляного раствора углерода четыреххлористого из расчета 0,4 мл/100 г 4-х кратно, 1 раз в день (Руководство …, 2000). Нефрит Хеймана моделировали по методу J. Reynolds и C. Pusey в модификации И.В. Мухина (2000) путем двукратного введения смеси адъюванта Фрейнда и гомогената коркового слоя почек крысы. Лекарственные повреждения почек у животных вызывали внутримышечным введением канамицина (300 мг/кг), бруфена (6 мг/кг) внутрижелудочно (Руководство…, 2000); комплексом туберкулостатиков - изониазида (50 мг/кг), рифампицина (50 мг/кг), пиразинамида (1,5 мг/кг) внутрижелудочно (Скакун, Табачук, 1992); урографина (10 мл/кг) внутривенно однократно (Vari et al., 1988). Острый пиелонефрит у крыс воспроизводили путем наложения лигатуры на левый мочеточник на 24 часа, после чего в хвостовую вену за 1 час до снятия лигатуры вводили 1 мл суспензии E. coli с титром 5х108 микробных тел в 1 мл (Лисица, Рудзит, 1983). Индуцированный апоптоз у крыс воспроизводили путем ишемии/реперфузии почек (Kaushal et all, 1998).
Полученные в ходе экспериментов данные статистически обработаны с применением пакета прикладных программ «Ехсеl 2003». Различия считали значимым при вероятности 95 % (Р ≤ 0,05).
^ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В серии предварительных экспериментов было установлено, что показатели острой токсичности испытуемых средств (DL50) при внутрибрюшинном введении белым крысам составила: у нефрофита - 1466,7 ± 319,3 мг/кг, у фитоуросепта - 550,0 ± 64,0 мг/кг, у эксабола - 370,5 ± 21,3 мг/кг. При внутрижелудочном введении фитоэкстрактов в максимально возможных дозах гибели животных не наблюдали, что позволяет отнести нефрофит к группе практически нетоксичных, а фитоуросепт и эксабол к группе малотоксичных веществ (Руководство…2000).
^ Исследование фармакологических свойств фитосредств
Установлено, что испытуемые средства при их однократном внутрижелудочном введении интактным белым крысам оказывают мочегонное и салуретическое (Na+–уретическое) действие, повышают скорость клубочковой фильтрации (СКФ) (табл. 1).
Таблица 1
Влияние фитосредств на диурез, салурез и СКФ у интактных крыс
| Группы животных | Дозы, мг/кг | Показатели функционального состояния почек крыс, % от контроля | ||
| Диурез | Na-урез | СКФ | ||
| Интактная | - | 100 ± 6,35 | 100 ± 4,85 | 100 ± 7,34 |
| Нефрофит | 50 | 108,9 ± 7,92 | - | - |
| 150 | 143,0 ± 9,87* | 127,7 ± 7,38* | 190,0 ±11,53* | |
| 300 | 137,5 ± 8,65* | - | - | |
| Фитоуросепт | 25 | 103,8 ± 8,62 | - | - |
| 50 | 124,5 ± 6,68* | 129,0 ± 8,47* | 149,0 ± 9,38* | |
| 100 | 115,1 ± 8,54 | - | - | |
| Эксабол | 50 | 114,2 ± 7,56 | - | - |
| 100 | 127,8 ± 9,28* | 112,5 ± 10,67 | 150,8 ± 10,31* | |
| 150 | 117,7±8,90 | - | - |
Примечание: * - здесь и далее, значения, достоверно отличающиеся от данных контрольной группы при Р ≤ 0,05.
Как следует из данных, приведенных в таблице 1, введение животным указанных средств в малых дозах не оказывает существенного влияния на водовыделительную функцию почек белых крыс, тогда как при их введении в более высоких дозах отмечается достоверный дозозависимый диуретический эффект. В связи с тем, что наиболее выраженная диуретическая активность выявлена для нефрофита в дозе 150 мг/кг, фитоуросепта - в дозе 50 мг/кг, эксабола – в дозе 100 мг/кг указанные дозы были использованы в дальнейших экспериментах в качестве экспериментально-терапевтических. Повышение водовыделительной функции почек под их влиянием обусловлено преимущественно увеличением скорости клубочковой фильтрации, а также ускорением натрийуреза у нефрофита и фитоуросепта.
Испытуемые средства в экспериментально-терапевтических дозах проявляют выраженную противовоспалительную активность, снижая степень экссудативных и альтеративных процессов при введении провоспалительных агентов, также под их влиянием ускоряется регенерация тканей (табл. 2). При этом по ряду параметров эффективность испытуемых средств превосходила таковую у препарата сравнения – калефлона.
Кроме того, для эксабола установлено наличие анальгетической и жаропонижающей активности, сопоставимой по эффективности с натрия метамизолом.
Таблица 2
Влияние фитосредств на процессы экссудации, альтерации и регенерации при асептическом воспалении у белых крыс
| Группы животных | Доза, мг/кг | % угнетения отека от контроля | Сокращение площади альтерации, % от контроля | ||||
| формалин | декстран | гистамин | 2 сутки | 9 сутки | 25 сутки | ||
| Нефрофит | 150 | 14,5±1,06* | 15,0±1,15* | 22,0±1.56* | - | 41,0±2,34* | 40,3±3,45* |
| Фитоуросепт | 50 | 15,1±1,07* | 14,5±1,76 | 27,8±1,95* | 37,1±2,67* | 42,8±3,76* | 45,5±3,21* |
| Эксабол | 100 | 26,7±1,82* | 24,0±1,67* | 31,5±2,45* | 44,6±3,17* | 42,9±2,83* | 35,2±3,05* |
| Калефлон | 100 | 10,8±1,89 | 12,5±1,45 | 17,0±2,78 | 48,8±3,28 | 48,2±4,21 | 40,5±3,62 |
Также показано, что экстракт сабельника снижает скорость образования циклооксигеназы в модельной системе на 18% при его концентрации 7 мг/мл пробы. С использованием модели «меченых сосудов» установлено, что все испытуемые средства оказывают сосудоукрепляющее действие, о чем свидетельствует снижение степени импрегнации черной туши в брыжейке на фоне иммобилизационного стресса, а также уменьшение объема перитонеального экссудата и количества дегранулированных тучных клеток при асептическом перитоните у крыс.
Изучение антимикробной активности фитоэкстрактов показало, что испытуемые средства обладают антибактериальными свойствами по отношению к Staphylococcus aureus 209 p, Proteus vulgaris H50, Escherichia coli - 408, Streptococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa (табл. 3). Как следует из указанной таблицы, наиболее выраженную антибактериальную активность проявляет фитоуросепт, ингибируя рост указанных штаммов бактерий в концентрациях 0,62 - 5,00 мг/мл. Кроме того, установлено, что фитоуросепт обладает синергидным действием с антибиотиками (полусинтетическими пенициллинами и цефалоспоринами) по отношению к кишечной палочке и золотистому стафилококку.
Таблица 3
Антибактериальные свойства фитосредств
| Фитосредства | Бактерицидное действие экстрактов, мг/мл | ||||
| Staph. аureus | Pr. vulgaris | Esch. сoli | Str. faecalis | Ps. aeruginosa | |
| Нефрофит | 25,00 | 12,50 | - | 25,00 | 25,00 |
| Фитоуросепт | 1,25 | 5,00 | 1,25 | 2,50 | 0,62 |
| Эксабол | 12,50 | 12,50 | 12,50 | 12,50 | 12,50 |
При исследовании спазмолитической активности указанных средств установлено, что под влиянием нефрофита сокращения препарата тонкого кишечника, индуцированные карбахолином, уменьшаются на 34% по сравнению с контролем. Для фитоуросепта и эксабола статистически значимая спазмолитическая активность не установлена (Р≥0,05).
Показано, что однократное введение интактным крысам фитоуросепта и эксабола в указанных дозах сокращает время снижения тромбопластин-тромбиновой активности в 2 – 2,5 раза и повышает индекс инактивации тромбопластина и тромбина в 3 – 10 раза соответственно. Введение крысам нефрофита удлиняет время образования фибринового сгустка, что указывает на их фибринолитические свойства.
С использованием модели односторонней нефрэктомии показано, что под влиянием курсового введения нефрофита и фитоуросепта в экспериментально-терапевтических дозах наблюдается повышение концентрации РНК на 124% и 20%, соответственно, и общего белка в гомогенате оставшейся почки, что сопровождается развитием ее компенсаторной гипертрофии.
Установлено, что испытуемые средства обладают существенным иммуномодулирующим потенциалом, обеспечивая повышение показателей иммунных реакций организма при иммунодепресивных состояниях. В частности, при азатиоприновой иммуносупрессии фитоэкстракты способствовали активации основных звеньев иммунного ответа организма на 36 – 100%, уменьшали выраженность инволюции иммунокомпетентных органов, повышали активность клеточно-опосредованной реакции, макрофагального звена иммунитета на 54 – 60%. Показано также, что нефрофит не обладает митогенной активностью, ингибирует спонтанную и Кон-А стимулированную пролиферацию лимфоцитов, а также ингибирует бласттрансформацию лимфоцитов (в концентрациях 75-300 мкг/мл) до полного угнетения. В то же время, данный фитоэкстракт в малых концентрациях от 0,3 до 3,0 мкг/мл повышает цитотоксическую активность мононуклеарных клеток крови, что свидетельствует о наличии у нефрофита значительного иммуномодулирующего потенциала. Аналогичные данные получены и в отношении эксабола: его внесение в модельную систему в концентрации 100 мкг/мл приводило к достоверному подавлению пролиферации Т-лимфоцитов на 28%. При этом установлено, что из исследованных средств только фитоуросепт проявляет иммуностимулирующую активность, поскольку под его влиянием возрастала стимулированная конканавалином-А и липополисахаридом пролиферативная активность лимфоцитов на 30 и 50%.
Испытуемые средства оказывали выраженное стресспротективное действие: их введение животным на фоне иммобилизационного стресса препятствовало развитию катаболических изменений во внутренних органах белых крыс. У животных опытных групп наблюдали уменьшение выраженности инволюции тимуса, гипертрофии надпочечников и развитие деструкций в слизистой оболочке желудка.
Указанные средства значимо снижали гемолиз эритроцитов, индуцированный реактивом Фентона (табл. 4). При этом, наиболее выраженное мембраностабилизирующее действие проявляет нефрофит, уменьшая выраженность перекисного гемолиза в 3 раза по сравнению с контролем. Поскольку известно, что реактив Фентона индуцирует перекисное окисление липидов, можно полагать, что мембранопротекторное действие фитосредств обусловлено их способностью ингибировать процессы свободнорадикального окисления биомакромолекул, что было подтверждено далее в отдельной серии экспериментов.
Таблица 4
Влияние фитосредств на гемолиз эритроцитов
| Условия опыта | Концентрация, мг/мл | Перекисный гемолиз, % | Осмотический гемолиз, % |
| Контроль (гемолиз) | - | 86,0 1,5 | 84,0 4,0 |
| Гемолиз+нефрофит | 1,5 | 25,0 1,0* | 55,0 1,0* |
| Гемолиз +фитоуросепт | 0,5 | 57,0 2,8* | 91,0 4,0 |
| Гемолиз +эксабол | 1,0 | 32,0 3,0* | 82,0 6,0 |
В частности, о наличии у фитосредств антиоксидантной активности свидетельствуют полученные данные об их способности существенно снижать скорость генерации супероксидного анион-радикала (.О2-) в модельной системе: уровень их перехвата составил 50% - 90 %. Принимая во внимание, что .O2 - является пусковым звеном свободнорадикальных реакций, можно полагать, что фенольные соединения, входящие в состав фитоэкстрактов, обладая антирадикальной активностью по отношению к .O2 - , предотвращают их развитие уже на начальной стадии процесса. Также, с использованием модельных систем показано, что ингибирование процессов СРО под их влиянием связано с наличием достаточно высокой восстанавливающей способности, сопоставимой с таковой у классического антиоксиданта – ионола, что свидетельствует о наличии высокой общей антиоксидантной емкости. Испытуемые сухие экстракты оказывают антирадикальное действие по отношению к радикалам дифенилпикрилгидразина (ДФПГ) и оксида азота (NO). При этом наиболее выраженная активность выявлена для эксабола, его антирадикальные и хелатирующие свойства были близки к таковым у ионола. Подтверждением антирадикального механизма действия указанных средств служили данные об их ингибирующем влиянии на кинетику Fe2+- индуцированной хемилюминесценции, что выражалось в уменьшении амплитуды «быстрой вспышки» в среднем в 2 раза, а также предотвращении «медленной вспышки». При этом отмечен дозозависимый эффект: с увеличением концентрации испытуемых средств их эффективность повышается до определенных значений, а при дальнейшем повышении концентрации – снижается, что свойственно для истинных антиоксидантов, например, альфа-токоферола. Под влиянием фитосредств повышалась активность ферментов антиоксидантной защиты: каталазы, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы. Показано, что антиоксидантное действие испытуемых средств связано также с их способностью связывать металлы переменной валентности, в частности, ионы железа и, тем самым, ограничивать развитие свободнорадикальных процессов. Наиболее выраженное хелатирующее действие, превосходящее таковое у аскорбиновой кислоты, установлено в отношении эксабола.
Выявлено стимулирующее влияние нефрофита и фитоуросепта на энергетический обмен клеток, о чем свидетельствует более чем двукратное повышение активности пируваткиназы под их влиянием. Показано также, что курсовое введение нефрофита на фоне ишемии-реперфузии почек сопровождается повышением уровня АТФ в ишемизированных почках животных на 30% по сравнению с контролем, что свидетельствует об активации ресинтеза АТФ под его влиянием.
Курсовое введение нефрофита и эксабола в экспериментально-терапевтических дозах на фоне ишемии-реперфузии почек животных сопровождается снижением выраженности индуцированного апоптоза, о чем свидетельствует снижение активности каспазы-3, сопоставимое с действием специфического ингибитора этого фермента Ac-DEVD-CHO (табл. 5).
Таблица 5
Влияние нефрофита на активность каспазы-3 при ишемических повреждениях почек у белых крыс
| Группы животных | Активность каспазы-3, пмоль/мин/мг белка | |||
| 1 ч | 4 ч | 8 ч | 16 ч | |
| Ложнооперированная | 2,40 ± 0,13 | |||
| Контр. (ишемия) | 7,2 ± 1,04 | 14,7 ± 1,18 | 36,6 ± 3,05 | 36,2 ± 2,46 |
| Контр. (ишемия + ингибитор) | 4,3 ± 0,34 | 5,0 ± 1,31 | 14,0 ± 1,56 | 19,6 ± 2,83 |
| Опытная (ишемия+нефрофит) | 3,4 ± 0,23* | 8,5 ± 1,75* | 21,5 ± 1,10* | 29,1 ± 2,21 |
^ Исследование фармакотерапевтической эффективности
растительных средств
Исследование проведено с использованием моделей повреждения почек токсической, ишемической, лекарственной, иммунной и бактериальной этиологии. Введение животным водных растворов испытуемых средств осуществляли в соответствии с условиями эксперимента интрагастрально курсами в экспериментально – терапевтических дозах: нефрофит – 150 мг/кг, фитоуросепт – 50 мг/кг, эксабол – 100 мг/кг 1 раз в сутки в объеме 10 мл/кг. Препаратами сравнения служили леспенефрил и канефрон, которые вводили животным в изоэффективных дозах по аналогичным схемам. Установлено, что курсовое введение нефрофита в дозе 150 мг/кг при нефропатии ишемической этиологии оказывает выраженное нефропротекторное влияние (табл. 6.).
Как следует из данных таблицы 6, двусторонняя ишемия почек сопровождается развитием выраженной азотемии, снижением диуреза и СКФ, а также индукцией процессов СРО и снижением активности эндогенной антиокислительной системы.
Курсовое введение крысам нефрофита в экспериментально – терапевтической дозе 150 мг/кг сопровождалось существенным уменьшением выраженности азотемии во все сроки наблюдения. Наряду с этим, введение животным экстракта способствовало повышению СКФ и диуретической функции почек. Диурез у животных опытной группы на 1 и 3 сутки опыта возрос на 75 - 100 % , а СКФ увеличивалась в 2 и 1,5 раза по сравнению с таковой у крыс контрольной группы. Введение нефрофита крысам оказывало также выраженное антиоксидантное действие. Так, на 1 и 3 сутки исследования концентрации ДК и ТБК-активных продуктов в крови, а также в гомогенате почек крыс, получавших испытуемый фитоэкстракт, снижались в среднем на 15 - 53% по сравнению с аналогичными показателями у крыс контрольной группы.
Таблица 6
Влияние нефрофита на показатели функционального состояния почек и активности процессов СРО при постишемической нефропатии у крыс
| Показатели | Группы животных | |||
| Интактная | Контрольная (ишемия) | Опытная 1 (ишемия + нефрофит) | Опытная 2 (ишемия + леспенефрил) | |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 1 сутки | ||||
| Креатинин, сыв.кр. мкмоль/л | 87,9 2,45 | 224,4 26,02 | 131,9 6,55* | 145,3 11,5* |
| Мочевина сыв.кр., ммоль/л | 7,5 0,34 | 33,1 3,43 | 14,8 0,85* | 13,5 1,25* |
| СКФ, мкл/мин | 538,5 48,00 | 108,8 7,62 | 216,1 14,85* | 232,0 25,3* |
| Диурез, мл/100г/ч | 0,37 0,036 | 0,13 0,002 | 0,23 0,026* | 0,27 0,016* |
| МДА в гомог. почек, нмоль/г | 14,7 0,83 | 38,6 1,40 | 24,3 1,11* | 23,5 1,35* |
| МДА в сыв.кр., мкмоль/мл | 2,10 0,11 | 3,90 0,16 | 2,40 ± 0,08* | 2,30 0,13* |
| ДК в сыв.кр., усл.ед. | 1,40 ± 0,05 | 4,50 ± 0,38 | 2,70 ± 0,15* | 3,30 0,28 |
| Каталаза, мкат/л | 4,1 0,31 | 2,1 0,10 | 3,3 0,20* | 2,9 0,27 |
| 3 сутки | ||||
| Креатинин сыв.кр., мкмоль/л | 87,9 2,45 | 167,7 18,30 | 122,0 10,04* | 112 8,33* |
| Мочевина сыв.кр., ммоль/л | 7,5 0,34 | 24,9 4,42 | 11,9 1,12* | 15,6 1,25* |
| СКФ, мкл/мин | 538,5 48,00 | 238,6 21,14 | 348,4 34,40* | 332,7 25,4* |
| Диурез, мл/100г/ч | 0,40 ± 0,036 | 0,13 ± 0,006 | 0,27 ± 0,016* | 0,23 0,008* |
| МДА в гомог. почек нмоль/г | 15,5 ± 1,09 | 31,0 ± 2,21 | 14,5 ± 0,83* | 18,0 ± 2,25* |
| МДА в сыв.кр., мкмоль/мл | 2,41 ± 0,18 | 4,40 0,21 | 2,95 ± 0,15* | 3,36 0,28 |
| ДК в сыв.кр., усл.ед. | 1,3 ± 0,06 | 4,6 ± 0,56 | 2,0 ± 0,07* | 3,2 0,25* |
| Каталаза, мкат/л | 4,1 0,31 | 2,4 0,10 | 3,8 0,30* | 3,20 0,33* |
| 7 сутки | ||||
| Креатинин сыв.кр., мкмоль/л | 87,9 2,45 | 114,6 9,43 | 78,9 2,46* | 90,5 7,33 |
| Мочевина сыв.кр., ммоль/л | 7,5 0,34 | 28,0 1,55 | 9,3 1,08* | 11,4 0,74 |
| СКФ, мкл/мин | 538,5 48,00 | 406,5 ± 36,60 | 537,0 ± 40,90* | 487,0 34,40 |
| Диурез мл/100г/ч | 0,40 ± 0,036 | 0,37 ± 0,01 | 0,41 ± 0,036 | 0,36 0,040 |
| МДА в гомог. почек, нмоль/г | 14,9 ± 0,75 | 14,5 ± 0,1,03 | 14,8 ± 0,61 | 13,7 ± 1,45 |
| МДА в сыв.кр., мкмоль/мл | 2,4 ± 0,18 | 3,7 ± 0,32 | 2,4 ± 0,08* | 3,3 0,35 |
| ДК в сыв.кр., усл.ед. | 1,3 ± 0,06 | 2,6 ± 0,18 | 1,6 ± 0,09* | 1,8 0,12* |
| Каталаза, мкат/л | 4,1 0,34 | 3,2 0,30 | 4,0 0,20* | 3,8 0,23 |
Наряду с этим, наблюдали повышение активности антиоксидантной системы организма, на что указывало повышение каталазной активности сыворотки крови в среднем на 43 % по сравнению с показателями у крыс контрольной группы на 1 сутки эксперимента с нормализацией этого показателя на 3 сутки опыта. Патоморфологические исследования показали, что на фоне введения белым крысам нефрофита в почках наблюдаются менее выраженные дистрофические и некротические изменения структур нефронов по сравнению с контролем, характеризующиеся зернистой дистрофией клеток проксимальных канальцев, некрозом и десквамацией единичных эпителиальных клеток в просвет канальцев.
При этом испытуемый фитоэкстракт не уступал, а по некоторым показателям превосходил препарат сравнения - леспенефрил.
^ Исследование фармакотерапевтической эффективности нефрофита при нефропатиях, вызванных лекарственными препаратами (аминогликозидами, нестероидными противовоспалительными средствами, комплексом туберкулостатических средств, рентгенконтрастным веществом) показало, что независимо от механизма их повреждающего действия наблюдается развитие процессов СРО биомакромолекул, регистрируемых по динамике накопления их метаболитов в сыворотке крови и гомогенате почек животных. В таблице 7 представлены данные о влиянии нефрофита на течение нефропатии, вызванной канамицином.
Как следует из данных табл. 7, при введении крысам канамицина в максимальной терапевтической дозе развивается характерный симптомокомплекс, свойственный нефропатиям, который сопровождается активацией процессов СРО, снижением возможностей эндогенной антиоксидантной системы. Курсовое введение нефрофита на фоне канамицинового повреждения почек крыс оказывало выраженное нефропротекторное влияние, о чем свидетельствовало повышение диуретической, экскреторной и салуретической функций. Так, на 8 и 15 сутки опыта экскреция белка с мочой у животных уменьшалась на 68 % и в 3,2 раза соответственно; СКФ повышалась на 52 и 64 %; диурез на 32 и 55 %, концентрация катионов калия и натрия в моче повышалась в 1,9 и 3,2 раза соответственно по сравнению с аналогичными данными у животных контрольной группы. На фоне введения нефрофита наблюдали снижение выраженности процессов СРО и повышение активности ферментов антиоксидантной защиты.
Таблица 7
Влияние нефрофита на течение нефропатии у крыс, вызванной канамицином
| Показатели | Группы животных | |||
| Интактная | Контрольная (канамицин) | Опытная 1 (канамицин + нефрофит) | Опытная 2 (канамицин +канефрон) | |
| 3 сутки | ||||
| Креатинин сыв.кр., мкмоль/л | 57,0±3,03 | 63,3±3,79 | 59,2±3,07 | 63,1±4,72 |
| Мочевина сыв.кр., ммоль/л | 5,4±0,46 | 6,9±0,61 | 6,1±0,49 | 6,7±0,47 |
| МДА в сыв.кр., мкмоль/мл | 5,2±0,33 | 8,7±0,81 | 5,9±0,73* | 7,3±0,45 |
| ДК в сыв.кр., усл.ед. | 5,8±0,67 | 14,5±1,69 | 8,7±8,43* | 11,0±1,19 |
| Каталаза, мкат/л | 8,8±0,69 | 10,0±0,61 | 12,1±0,73* | 11,2±1,85 |
| МДА в гомогенате,нмоль/г | 2,4±0,15 | 4,6±0,51 | 3,1±0,29* | 4,0±0,38 |
| СОД, мкмоль/л | 19,2±1,37 | 17,5±1,68 | 19,0±1,75 | 17,9±2,01 |
| 8 сутки | ||||
| Креатинин сыв.кр., мкмоль/л | 54,0±5,12 | 87,5±2,03 | 69,5±3,44* | 84,0±4,19 |
| Мочевина сыв.кр., ммоль/л | 5,2±0,28 | 9,1±0,92 | 6,2±0,81* | 6,7±0,94 |
| СКФ, мкл/мин | 84,9±7,31 | 45,3±3,72 | 68,9±4,11* | 51,7±4,35 |
| Диурез, мл/100г/ч | 0,71±0,06 | 0,54±0,03 | 0,72±0,025* | 0,69±0,03 |
| Белок в моче, г/л | 1,02±0,52 | 3,49±0,43 | 1,12±0,17* | 1,83±0,17 |
| МДА в сыв.кр., мкмоль/мл | 4,2±0,21 | 6,0±0,22 | 4,4±0,19* | 5,3±0,27 |
| МДА в гомогенате,нмоль/г | 2,4±0,15 | 5,7±0,29 | 4,1±0,26* | 4,9±0,42 |
| ДК в сыв.кр., усл.ед. | 5,9±0,48 | 12,6±1,34 | 8,5±0,81* | 10,1±0,95 |
| Каталаза, мкат/л | 8,3±0,49 | 5,8±0,57 | 7,2±0,48* | 6,1±0,54 |
| СОД, мкмоль/л | 27,0±1,50 | 19,3±1,52 | 24,9±1,31* | 17,8±1,64 |
| 15 сутки | ||||
| Креатинин сыв.кр., мкмоль/л | 54,0±5,12 | 304,7±24,51 | 176,3±16,99* | 262,0±31,01 |
| Мочевина сыв.кр., ммоль/л | 5,2±0,28 | 23,1±2,06 | 12,2±1,08* | 20,3±1,72 |
| СКФ, мкл/мин | 84,9±7,31 | 13,9±1,49 | 22,9±3,78* | 16,8±1,67 |
| Диурез, мл/100г/ч | 0,7±0,06 | 0,4±0,03 | 0,68±0,04* | 0,65±0,03 |
| К+ в моче, мг/мл | 2,9±0,17 | 1,3±0,14 | 2,5±0,20* | 2,1±0,17 |
| Na+ в моче, мг/мл | 1,0±0,08 | 0,24±0,04 | 0,77±0,07* | 0,51±0,08 |
| Белок в моче, г/л | 1,0±0,52 | 4,5±3,85 | 1,4±0,08* | 4,0±3,20 |
| МДА в сыв.кр., мкмоль/мл | 4,2±0,33 | 8,8±0,93 | 5,3±0,21* | 7,3±0,39 |
| МДА в гомогенате, нмоль/г | 5,4±0,31 | 15,3±1,24 | 9,0±0,85* | 13,0±1,2 |
| ДК в сыв.кр,. усл.ед. | 5,9±0,48 | 20,7±0,87 | 13,2±0,76* | 18,2±1,12 |
| Каталаза, мкат/л | 8,3±0,49 | 3,6±0,17 | 5,5±0,21* | 4,7±0,19 |
| СОД, мкмоль/л | 27,0±1,60 | 15,6±1,39 | 22,2±2,31* | 18,0±0,91 |
Так, через 8 и 15 суток отмечалось снижение концентрации ДК в сыворотке крови на 33 и 36 %, концентрации ТБК-активных продуктов в крови и гомогенате почек белых крыс - на 26 и 40 % и на 28 и 41 %, соответственно, по сравнению с показателями у крыс контрольной группы. На 8 сутки наблюдения активность каталазы и СОД в крови повышалась по сравнению с контролем на 23 и 29 % соответственно; при введении нефрофита через 15 суток – на 54 и 42 %. Патоморфологические исследования показали, что при курсовом введении нефрофита в корковом слое почек отсутствовали очаги вакуольной и гидропической дистрофии. В цитоплазме клеток канальцев выявлялась лишь зернистая дистрофия, значительно снижалась круглоклеточная инфильтрация, не просматривались участки кальцинозов в отличие от таковых показателей у животных контрольной группы. При этом установлено, что фармакотерапевтическая эффективность нефрофита при канамициновом повреждении почек значительно превосходит таковую у канефрона.
Аналогичное влияние нефрофита в дозе 150 мг/кг отмечено при лекарственных нефропатиях у крыс, вызванных введением бруфена, комплекса противотуберкулезных средств (изониазида, рифампицина и пиразинамида) и в/в введением урографина. Курсовое введение этого средства способствовало восстановлению функционального состояния почек на более ранних сроках патологического процесса, ингибированию процессов СРО и повышению потенциала эндогенной антиоксидантной системы организма.
^ Исследование фармакотерапевтической эффективности нефрофита при гепаторенальном синдроме показало, что его курсовое введение в дозе 150 мг/кг оказывало выраженное нефропротекторное влияние во все сроки эксперимента. Так концентрация мочевины и креатинина в сыворотке крови животных опытной группы была достоверно ниже, чем в контроле. Наблюдали повышение СКФ от 2 до 20 раз и диуреза соответственно от 1,5 до 2,0 раз по отношению к контролю. К окончанию эксперимента (21 сутки) у крыс опытной группы показатели функциональной состоятельности почек соответствовали физиологической норме, тогда как у животных контрольной группы СКФ и диурез оставались достоверно сниженными. Наряду с этим, введение крысам нефрофита сопровождалось уменьшением выраженности нарушений функциональной состоятельности печени животных, о чем свидетельствовало статистически значимое снижение активности трансаминаз, щелочной фосфатазы в сыворотке крови и повышение концентрации гликогена в печени на фоне уменьшения интенсивности СРО. Так, на 7 сутки опыта концентрации ДК и ТБК-активных продуктов у белых крыс, получавших испытуемое фитосредство, снижались в среднем на 20 %, а активность каталазы крови на 54% возрастала по сравнению с аналогичными показателями у животных контрольной группы. На 21 сутки опыта у животных опытной группы наблюдали практически нормализацию указанных показателей ПОЛ, тогда как у крыс контрольной группы эти показатели были достоверно выше, чем у интактных животных. При патоморфологическом исследовании почек белых крыс установлено, что под влиянием нефрфофита структурные изменения характеризуются менее выраженной, чем в контроле дилатацией капсулярного пространства клубочков и просвета канальцев, очаговой гидропической и белковой дистрофией клеток проксимальных и дистальных канальцев, десквамацией щеточной каймы в просвет канальцев.
^ Исследование фармакотерапевтической эффективности нефрофита при экспериментальном гломерулонефрите у крыс показало, что его введение крысам опытной группы в дозе 150 мг/кг оказывает выраженное нефропротекторное влияние, заключающееся в снижении концентрации креатинина и мочевины в сыворотке крови на 12 и 49% соответственно, увеличении диуреза в 2,7 раза и скорости клубочковой фильтрации на 118%, снижении протеинурии на 39%, количества лейкоцитов и эритроцитов в моче в 2 и 5,3 раза соответственно по сравнению с показателями в контрольной группе. Под влиянием испытуемого средства у животных наблюдали нормализацию липидного состава крови: содержания ТГ и ЛПНП снижались соответственно на 30 и 43%, а ЛПОНП - более чем в 2 раза, содержание ЛПВП повышалось на 55%, в результате чего коэффициент атерогенности был ниже чем в контрольной группе почти в 2 раза. Также под влиянием испытуемого средства у животных достоверно снижается активность окислительных процессов, на что указывало снижение содержания продуктов пероксидации в сыворотке крови и гомогенате коркового слоя почек более чем в 2 раза, повышение содержания восстановленного глутатиона и активности каталазы в сыворотке крови. Также отмечено иммуномодулирующее действие нефрофита с нормализацией показателей гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа организма. У животных опытной группы наблюдали снижение содержания IgМ, IgG и IgA соответственно на 34,7, 19,2 и 22,5 %, уменьшение количества циркулирующих иммунных комплексов в крови – в 1,6 раза и повышение фагоцитарной активности нейтрофилов в среднем на 21,0 % по сравнению с аналогичными показателями в контроле.
Курсовое введение нефрофита крысам в дозе 150 мг/кг на фоне сулемовой нефропатии сопровождалось достоверным снижением уровня азотистых метаболитов в сыворотке крови и уменьшением протеинурии во все сроки наблюдения. Также под влиянием испытуемого средства наблюдали статистически значимое повышение диуреза, салуреза и скорости клубочковой фильтрации. Анализ динамики накопления продуктов пероксидации липидов показал, что введение нефрофита крысам сопровождается значительным снижением концентраций ДК и ТБК-активных продуктов, повышением активности каталазы по сравнению с данными в контрольной группе животных. При патоморфологическом исследовании на фоне введения нефрофита наблюдали увеличение площади и гиперклеточность клубочков, обусловленные умеренной пролиферацией и набуханием эндотелиальных клеток, присутствием нейтрофилов в просвете капиллярных петель, незначительной пролиферацией мезангиальных клеток. Морфометрические исследования показали, что средний размер клубочков на фоне введения животным нефрофита уменьшается на 12 %, количество мезингиальных клеток в клубочке -на 15 % по сравнению с таковыми у животных контрольной группы. Площадь мочевого пространства клубочка не отличалась от таковой у животных интактной группы.
При этом нефропротекторное влияние нефрофита по многим показателям превосходило таковое у препарата сравнения леспенефрила.
^ Исследование фармакотерапевтической эффективности фитоуросепта было проведено с использованием моделей повреждения почек ишемической, бактериальной этиологии и при гепаторенальном синдроме у крыс. Данные о влиянии испытуемого средства на функциональное состояние почек при колибациллярном пиелонефрите у крыс приведены в таблице 8.
Как следует из данных, приведенных в таблице, 8 курсовое введение фитоуросепта в экспериментально – терапевтической дозе 50 мг/кг сопровождается повышением диуреза на 7 сутки эксперимента на 30 % по сравнению с контролем и восстановлением данного показателя до уровня физиологической нормы на 14 сутки, тогда как у крыс контрольной группы диурез оставался достоверно ниже, чем у интактных животных. Также, на 14 сутки опыта у животных опытной группы отмечалась нормализация содержания азотистых метаболитов в сыворотке крови и достоверное уменьшение протеинурии. Под влиянием фитоуросепта наблюдали торможение процессов СРО и активацию эндогенной антиокислительной системы, о чем свидетельствует снижение содержания ТБК-активных продуктов, повышение активности каталазы в крови животных опытной группы.