Экспериментальное обоснование возможности применения комплексов трикарбонилтехнеция-99м и трикарбонилрения-188 в ядерной медицине 03. 01. 01 радиобиология 14. 01. 13 лучевая диагностика, лучевая терапия

  1   2   3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Проблема постановки своевременного и точного диагноза является одной из основных проблем клинической медицины. Для её решения используются достижения и конкретные результаты исследований в сфере многих фундаментальных наук: радиобиологии, радиохимии, радиофармацевтики. Именно таким симбиозом естественных и точных наук является такие направления ядерной медицины как радионуклидная диагностика и радионуклидная терапия. Технологии ядерной медицины играют важную роль в диагностике и терапии таких социально значимых заболеваний как онкологические. Чем больший выбор диагностических и лекарственных радиофармацевтических препаратов будет в арсенале у специалистов ядерной медицины, тем в более широко они могут быть применимы и в тем больших случаях будет возможно оказание своевременной, адекватной и эффективной помощи пациенту.

Генераторные радионуклиды технеций-99м и рений-188 обладают весьма полезными ядерно-физическими свойствами для диагностики и терапии злокачественных опухолей. Также немаловажным преимуществом этих радионуклидов является возможность их получения непосредственно в клинических условиях. Эти обстоятельства способствуют привлечению особого внимания к поиску, синтезу и изучению биологических свойств различных соединений, меченных как технецием-99м, так и рением-188. Далее на их основе разрабатываются лекарственные формы радиофармацевтических препаратов диагностического или терапевтического назначения.

Определенные трудности в получении новых радиофармацевтических препаратов на основе ^99mTc и ¹⁸⁸Re вносит невозможность прямого введения этих радионуклидов в структуру большинства тех веществ (например, аминокислот, пептидов, белков), которые могут стать "адресными носителями" в составе диагностического или лечебного РФП. Внимание исследователей, работающих в сфере ядерной медицины, привлекает металлоорганический фрагмент трикарбонилтехнеция-99м (рения-188), который входит в состав водорастворимого комплекса M(CO)₃(H₂O)₃⁺ и может быть использован для прямого мечения различных биологически активных молекул. Среди такого рода комплексов в настоящее время ведется активный поиск перспективных соединений, предназначенных для диагностики (^99mTc) или терапии (¹⁸⁸Re) различных, главным образом злокачественных, патологических состояний.

Более детальное исследование биологического поведения различных комплексов трикарбонилтехнеция-99м (рения-188) позволит оценить возможность их применения в ядерной медицине, как потенциальных диагностических или терапевтических агентов, что является крайне актуальным в настоящее время.

Цель исследования

Цель настоящего исследования заключается в экспериментальной оценке возможности использования комплексов ^99mTc-трикарбонила и ¹⁸⁸Re-трикарбонила с цитратом и октреотидом (синтетическим аналогом соматостатина) для получения диагностических и лечебных радиофармацевтических препаратов.

Задачи исследования:

1. Изучить специфичность и прочность связывания комплексов ^99mTc-трикарбонил цитрат, ^99mTc-трикарбонил октреотид, ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид опухолевыми клетками in vitro;
   
2. Изучить распределение комплексов ^99mTc-трикарбонил цитрат, ^99mTc-трикарбонил октреотид в организме животных–опухоленосителей;
   
3. Оценить возможность визуализации опухолевых очагов у лабораторных животных при использовании комплексов трикарбонилтехнеция-99м.
   
4. Изучить специфичность, прочность связывания и эффективность воздействия комплексов ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид на культуры опухолевых клеток по показателю их выживаемости;
   
5. Изучить распределение комплексов ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид у животных-опухоленосителей и дать прогноз относительно возможности достижения терапевтической дозы бета-излучения в экспериментальном опухолевом очаге;
   
6. Оценить влияние замены радионуклида технеций-99м на рений-188 в трикарбонильных комплексах цитрата и октреотида на их биологические характеристики.
   

Научная новизна исследования заключается в том, что впервые:

- исследованы динамика и характер накопления, а также получены количественные данные о специфическом связывании комплексов ^99mTc-трикарбонил цитрат, ^99mTc-трикарбонил октреотид, ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид с клетками меланомы В16 и аденокарциномы молочной железы MCF 7;

- по критерию выживаемости in vitro показана эффективность воздействия комплексов ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид на культуру опухолевых клеток меланомы B 16 и аденокарциномы молочной железы MCF 7. Для клеток меланомы B 16 и аденокарциномы молочной железы MCF 7 определены величины средней летальной объемной активности изученных комплексов рения-188 и средней летальной дозы бета-излучения, создаваемой данными соединениями в монослое опухолевых клеток;

- исследовано распределение комплексов ^99mTc-трикарбонил цитрат и ^99mTc-трикарбонил октреотид в организме животных с имплантированными меланомой и аденокарциномой молочной железы. Показана возможность визуализации указанных опухолей методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ);

- исследовано распределение комплексов ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид в организме животных с имплантированными меланомой и аденокарциномой молочной железы;

- показано значительное накопление комплексов ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид в экспериментальных опухолевых очагах, что свидетельствует о принципиальной возможности их использования в терапии злокачественных новообразований различной этиологии;

- по результатам проведенных экспериментов, показана возможность применения комплексов ^99mTc-трикарбонил цитрат, ^99mTc-трикарбонил октреотид, ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид в ядерной медицине.

Научно-практическая значимость исследования

Результаты исследований показывают, что комплексы ^99mTc-трикарбонил цитрат, ^99mTc-трикарбонил октреотид, ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид избирательно накапливаются клетками меланомы и аденокарциномы молочной железы in vitro и in vivo. Данные, полученные экспериментальным путем, свидетельствуют о возможности достижения терапевтической дозы бета-излучения в опухолевом очаге при использовании комплексов ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид. Показана возможность визуализации экспериментальных опухолевых очагов с помощью ^99mTc-трикарбонил цитрата и ^99mTc-трикарбонил октреотида методом ОФЭКТ. В перспективе изученные комплексы трикарбонилтехнеция-99м и трикарбонилрения-188 могут быть использованы для получения туморотропных радиофармацевтических препаратов диагностического и терапевтического назначения.

В процессе выполнения диссертационной работы, был выполнен полный объем исследований биологических характеристик комплекса ^99mTc-трикарбонил цитрат, соответствующий требованиям, предъявляемым к доклиническим испытаниям диагностических РФП. Данное соединение рекомендовано для дальнейшего клинического изучения.

Результаты исследований биологического поведения изучаемых соединений будут весьма полезны при разработке новых радиофармацевтических препаратов, предназначенных для диагностики и терапии ряда онкологических заболеваний.


Положения, выносимые на защиту:

1. В условиях in vitro ^99mTc-трикарбонил цитрат и ^99mTc-трикарбонил октреотид обладают тропностью к клеткам меланомы B 16 и аденокарциномы молочной железы MCF 7;

2. ^99mTc-трикарбонил цитрат и ^99mTc-трикарбонил октреотид проявляют выраженную туморотропность у животных с трансплантированными меланомой B 16 и аденокарциномой молочной железы Н⁺636;

3. С помощью ^99mTc-трикарбонил цитрат и ^99mTc-трикарбонил октреотид возможна визуализация экспериментальных опухолевых очагов у животных – опухоленосителей методом однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ);

4. Замена радионуклида технеций-99м на рений-188 в трикарбонильных комплексах не влияет на их тропность к клеткам злокачественных новообразований - меланомы B 16 и аденокарциномы молочной железы MCF 7 и фармакокинетику у животных-опухоленосителей;

5. Количественная оценка цитотоксического действия ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-три-карбонил октреотид на клетки меланомы B 16 и аденокарциномы молочной железы MCF 7;

6. Уровни поглощенных доз при воздействии ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид: на монослой опухолевых клеток, соответствующие 37% выживаемости в условиях in vitro и в опухолевых очагах меланомы B 16 и аденокарциномы молочной железы Н⁺636 у животных – опухоленосителей после внутривенного введения указанных комплексов.

Личный вклад автора

Экспериментальные данные диссертационной работы получены при непосредственном участии автора в исследовании биологического поведения изучаемых соединений in vitro и in vivo. Синтез изученных соединений осуществлен совместно со старшим научным сотрудником лаборатории технологии и контроля качества радиофармпрепаратов ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА РФ А.О. Малышевой. Оценка поглощенных доз в монослое клеток и опухолевых очагах у экспериментальных животных выполнена автором совместно с доктором технических наук, профессором, ведущим научным сотрудником отделения радиоизотопной диагностики РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН Б.Я. Наркевичем и кандидатом технических наук, старшим научным сотрудником отдела № 8 ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА РФ А.В. Тултаевым.

Апробация диссертации

Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на следующих научных форумах: Всероссийская научно-техническая конференция "Современные проблемы ядерной медицины и радиофармацевтики" (Обнинск, 2002); конгресс Европейской ассоциации ядерной медицины (Амстердам, 2003 г.); IV Международная конференция по ядерной и радиационной физике (Алматы, 2003 г.); IV Российская конференция по радиохимии (Озерск, 2003 г.); Российская конференция "Современные проблемы ядерной медицины и радиофармацевтики" (Дубна, 2004 г.); XII Европейский симпозиум по радиофармацевтике и радиофармацевтическим препаратам (Сопот, 2004 г.); V Международная конференция "Ядерная и радиационная физика" (Алматы,2005); Международный симпозиум по технецию (Оараи, Япония, 2005 г.); III Всероссийский национальный конгресс лучевых диагностов и терапевтов "Радиология-2009" (Москва, 2009 г.); VII международная конференция "Ядерная и радиационная физика" (Алматы, 2009 г.); конгресс Европейской ассоциации ядерной медицины (Барселона, 2009 г.); VI Российская конференция по радиохимии "Радиохимия-2009" (Москва, 2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 работ, из них - 6 публикаций в отечественных и зарубежных журналах; 14 - в материалах международных (8) и Российских конференций, съездов и симпозиумов.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста. Состоит из введения, четырех глав, заключения и выводов. Данная научная работа иллюстрирована 22 рисунками и 15 таблицами. Библиографический указатель включает 119 источников, из них - 24 отечественных и 95 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы исследования; сформулированы цель и задачи; представлены защищаемые положения и научно-практическая значимость полученных результатов.

В первой главе проведён анализ литературы, посвящённой тематике диссертации. Анализ опубликованных работ показал актуальность развития стратегии "идеальной пары", которая направлена на получение диагностического и терапевтического препаратов на основе одного и того же вещества, меченного радионуклидами технеций-99м или рений-188 соответственно. Доказана значимость существующей проблемы всестороннего изучения биологического поведения различных комплексов трикарбонилтехнеция-99м и трикарбонилрения-188 как потенциальных диагностических или терапевтических агентов.

Во второй главе описаны материалы и методы, использованные в диссертационной работе.

В диссертационной работе изучены комплексы ^99mTc-трикарбонил цитрат (^99mTc-ТК Cit), ^99mTc-трикарбонил октреотид (^99mTc-ТК Окт), ¹⁸⁸Re-трикарбонил цитрат (¹⁸⁸Re-ТК Cit) и ¹⁸⁸Re-трикарбонил октреотид (¹⁸⁸Re-ТК Окт), синтезированные в лаборатории № 37 ФМБЦ им. А.И. Бурназяна.

В экспериментах in vitro использовали асинхронные культуры меланомы B 16, аденокарциномы молочной железы MCF 7, фибробластов кожи человека IMG-1635 и смешанную культуру лимфоцитов крови человека.

Связывание комплексов ^99mTc-ТК Cit, ^99mTc-ТК Окт, ¹⁸⁸Re-ТК Cit и ¹⁸⁸Re-ТК Окт опухолевыми и нормальными клетками изучали в условиях in vitro. Культуры клеток инкубировали в течение 30, 60, 90, 120, 180 мин после внесения раствора изучаемого комплекса с активностью комплексов технеция-99м - 2,1 ± 0,8 МБк и 2,8 ± 0,5 МБк рения-188. Накопленную клетками активность измеряли методом прямой радиометрии и нормировали в процентах от внесенной активности на 10⁶ клеток.

Прочность связывания комплексов со структурами опухолевых клеток изучали методом "вымывания". Клетки инкубировали до достижения максимального накопления изученных комплексов, далее радиоактивную среду удаляли. Затем в культуральные флаконы вносили, свежую среду, и продолжали процедуру инкубирования, по окончании которой определяли аккумулированную радиоактивность.

Вымывание рассчитывали по формуле: В = М_А - Ф_А, где:

М_А – максимальная активность, накопленная клетками;

Ф_А – фиксированная активность после реинкубирования.

Эффективность воздействия комплексов ¹⁸⁸Re-ТК Cit и ¹⁸⁸Re-ТК Окт на клетки меланомы B 16 и аденокарциномы молочной железы MCF 7 оценивали по критерию выживаемости. Опухолевые клетки инкубировали в течение трех часов с комплексами ¹⁸⁸Re-ТК Cit и ¹⁸⁸Re-ТК Окт, внесенными в культуральную среду в количестве, обеспечивающем создание объемной активности от 74 до 740 кБк/мл. Через 48 и 96 ч проводили оценку фракции выживших клеток с последующим построением кривых выживаемости, для которых определяли следующие параметры: уравнение, описывающее кривую и достоверность ее аппроксимации (R²), коэффициент корреляции (R), статистическую значимость (p). По полученным кривым определяли значения средней летальной объемной активности изученных комплексов.

В экспериментах in vivo использовали:

1. Мышей гибридов F1 (СВАхС57В1) самок весом 18 - 20 г. с перевитой пигментированной меланомой В16. Животных включали в эксперимент при достижении размера опухоли 8 - 12 мм в диаметре.

2. Мышей линии BALB/c Cit с трансплантированной аденокарциномой молочной железы Н⁺636. Перевивной материал получен из опухоли, спонтанно возникшей у самки (Н⁺636) в питомнике Института биоорганической химии РАН. В эксперимент были взяты животные с размером опухоли 8 - 12 мм в диаметре. Все работы с лабораторными животными, выполняли согласно правилам проведения экспериментальных работ*.

* Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ Минздрава СССР №755).

Поведение комплексов ^99mTc-трикарбонил и ¹⁸⁸Re-трикарбонил с цитратом и октреотидом в организме животных-опухоленосителей изучали путем оценки их распределения по органам и тканям животных. Растворы изученных комплексов с объемной активностью 37 МБк/мл вводили в хвостовую вену животных в объеме 0,1 мл. По прошествии 1, 3, 5 и 24 часов после инъекции животных умерщвляли. В пробах крови, мышечной и опухолевой тканей, а также всех жизненно важных органов (сердце, легкие, печень, почки, кишечник, желудок) методом прямой радиометрии определяли содержание радионуклидов.

Визуализация экспериментальных опухолевых очагов выполнена методом планарной сцинтиграфии. Процедуру проводили на клинической цифровой двухдетекторной гамма-камере "Toshiba" в матрицу 256 х 256 с использованием параллельного коллиматора, вращение детектора на 45° за 180 с.

Перед процедурой животным внутривенно вводили растворы ^99mTc-трикарбонил цитрат и ^99mTc-трикарбонил октреотид объемом 0,2 мл с активностью 74 МБк и фиксировали в специальном станке, мочевой пузырь экранировали свинцовым экраном.

Оценку тканевых доз облучения, расчет дозовых нагрузок и поглощенных доз осуществляли с применением MIRD-формализма – математического аппарата дозиметрии внутреннего облучения от инкорпорированных радиоактивных соединений. При расчетах поглощенной дозы в монослое клеток было принято, что геометрические размеры культурального флакона и высота среды, содержащей радиоактивный раствор, соответствуют понятию протяженного плоского источника.

В третьей и четвертой главах представлены результаты экспериментов и их обсуждение.


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение поведения комплексов ^99mTc-ТК Cit и ^99mTc-ТК-Окт in vitro

На рисунке 1 представлены данные о кинетике накопления указанных комплексов опухолевыми и контрольными клетками. В качестве препарата сравнения был использован пертехнетат натрия, ^99mТс (элюат генератора технеция-99м).




Максимальное накопление ^99mТс-TK Cit в клетках меланомы B 16 в 3,7 раза выше, чем в клетках контрольной культуры (фибробласты IMG 1635) и в 11,0 раз выше, чем пертехнетата натрия, ^99mТс. Для аденокарциномы молочной железы MCF 7 эти значения составляли 4,8 и 14,5 соответственно. Результаты экспериментов косвенно подтверждают рецепторный механизм связывания ^99mТс-ТК Окт с опухолевыми клетками, так как накопления данного комплекса лимфоцитами, лишенными рецепторов к соматостатину, практически не происходит. При анализе максимального накопления показано, что ^99mТс-ТК Окт накапливается клетками аденокарциномы молочной железы MCF 7 в 6,0 раз большем количестве по сравнению с контрольной культурой (лимфоцитами) и в 9,0 раз больше, чем пертехнетат натрия,^99mTc. Для меланомы В 16 эти значения составляли 4,0 и 12,0 соответственно.

Изучение прочности связывания комплексов ^99mTc-ТК Cit и ^99mTc-ТК Окт с опухолевыми клетками

Вымывание ^99mTc-ТК Cit из клеток аденокарциномы молочной железы и меланомы не превышало 30%. Процесс вымывания ^99mTc-ТК Cit из опухолевых клеток имел моноэкспоненциальный характер. Время полувыведения ^99mTc из клеток MCF 7 составило 240 мин, из клеток меланомы B – от 16 до 180 мин. Аналогичные значения для комплекса ^99mTc-цитрат, полученного прямым мечением цитрата технецием-99м с использованием дихлорида олова в качестве восстановителя (РФП "Цитратех, ^99mTc"), составляли 40 и 50 минут соответственно. Определяющим туморотропность ^99mТс-ТК Cit, вероятнее всего, является наличие в составе комплекса трикарбонильной группы. Это предположение подтверждается тем фактом, что "Цитратех, ^99mTc" не связывается так же прочно со структурами опухолевой клетки, несмотря на то, что некоторое его накопление все-таки происходит. Полученные данные свидетельствуют о высвобождении до 55% ^99mТс-ТK Окт от максимально накопленной активности уже через 90 минут после начала реинкубирования, что характерно для комплексов, образующихся с мембранными рецепторами. При анализе кривых, отражающих динамику вымывания ^99mТс-ТК Окт, прослеживаются 2 фазы вымывания радиоактивной метки из опухолевых клеток. Первая, "быстрая" фаза, во время которой, вероятно, наблюдается отрыв меченого пептида от соматостатиновых рецепторов, расположенных на мембране опухолевых клеток. В течение следующей, "медленной", фазы наблюдается вымывание радиоактивных продуктов метаболизма и/или комплекса ^99mТс-ТК Окт из внутренних структур клеток. При решении уравнений, описывающих "быструю" и "медленную" фазы вымывания ^99mTc-ТК Окт из клеток MCF 7, время полувыведения составило 78 и 180 мин соответственно. Для клеток B 16 эти значения составляли 50 и 130 минут соответственно.

Изучение распределения комплексов ^99mTc-ТК Cit и ^99mТс-TK Окт в организме животных-опухоленосителей

В таблице 1 представлены данные о распределении комплекса ^99mТс-TK Cit ^99mTc-трикарбонил цитрата у животных с перевитыми меланомой В 16 и аденокарциномой молочной железы в сравнении с радиофармацевтическим препаратом "Цитратех, ^99mTc". Показано накопление комплексов в наиболее значимых органах и тканях в сроки, наиболее благоприятные для проведения сцинтиграфии.

Таблица 1 - Распределение ^99mTc-TK Cit и "Цитратех, ^99mTc", в организме мышей - опухоленосителей(% от введенной активности)

Органы и ткани	Меланома В 16		Аденокарцинома молочной железы		"Цитратех, 99mTc", меланома В 16
	1ч	3ч	1ч	3ч	1ч	3ч
Кровь, %/г	3,5 ± 0,7	1,7 ± 0,2	2,6 ± 0,1	1,2 ± 0,1	2,8 ± 1,1	1,2 ± 0,6
Печень	10,3 ± 1,0	8,6 ± 0,2	11,8 ± 0,3	10,1 ± 0,9	1,3 ± 0,2	0,8 ± 0,01
Почки	1,7 ± 0,3	1,5 ± 0,1	2,3 ± 0,2	3,1 ± 0,1	6,4 ± 0,8	5,3 ± 0,4
Кишечник	3,7 ± 0,3	3,6 ± 1,3	4,5 ± 0,4	6,8 ± 0,1	4,2 ± 0,3	3,9 ± 0,7
Моч. пузырь	40,0 ± 4,5	43,5 ± 17,0	30,5 ± 5,0	41,4 ± 0,3	58,0 ± 15,7	78,1 ± 1,4
Опухоль, %/г	7,6 ± 0,8	7,7 ± 1,0	2,6 ± 0,1	3,4 ± 0,9	1,0 ± 0,3	0,4 ± 0,08
Мышцы, %/г	1,0 ± 0,3	1,0 ± 0,3	1,0 ± 0,4	0,8 ± 0,4	0,5 ± 0,2	0,2 ± 0,06
опухоль/мышца	7,6	7,7	2,6	4,3	2,0	2,0