Лекции по курсу: биотехнология для студентов факультетов: ветеринарной медицины, биотехнологии подготовлен для печати

Вид материала

Лекции

Содержание Д.а. васильев, с.н.золотухин, а.а.щербаков, н.и. молофеева Данное учебное пособие подготовлено: д.б.н. Васильевым Д.А. Допастеровская эра Пастеровская эра Эра антибиотиков Постантибиотическая эра Эра новой биотехнологии Способы и особенности технологии промышленного культивирования микроорганизмов 1.1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними Антигенные свойства штаммов Иммуногенньхе свойства штаммов Безвредность (реактогенность) 1.2. Приготовление посевной микробной культуры 1.3. Приготовление и стерилизация питательных сред Сбор предварительных данных о ПО и составе ПС Оптимизация модели Схема. 1. Схема оптимизации ПС. 1.4. Подготовка биореактора к посеву 1.5. Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль за процессом культивирования 1.6. Периодические и хемостатные системы культивирования микроорганизмов ... Полное содержание

Подобный материал:

• Авторы: Белко А. А., Мацинович А. А., Маскалева Н. В., Касько, 84.67kb.
• Отчет оработе 84-й студенческой научной конференции факультета ветеринарной медицны, 147.52kb.
• Вопросы к курсовому экзамену по биотехнологии для студентов очной и заочной формы обучения, 112.17kb.
• Контрольная работа должна быть аккуратно, 636.18kb.
• Департамента Надежда Кондричева. Руководил подготовкой и проведением декан факультета, 36kb.
• Улица Академика Скрябина. График работы конференции Открытие конференции, регистрация, 799.7kb.
• «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени, 300.76kb.
• Грудопоясничного отдела позвоночника собак, 393.53kb.
• Пособие для врачей спортивной медицины и студентов факультетов спортивной медицины, 542.83kb.
• Проект «Информатизации системы образования» моу «Средняя общеобразовательная школа, 51.82kb.

Кафедра микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно санитарной экспертизы с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства

УЛЬЯНОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ


ЛЕКЦИИ ПО КУРСУ: БИОТЕХНОЛОГИЯ

ДЛЯ СТУДЕНТОВ ФАКУЛЬТЕТОВ: ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ, БИОТЕХНОЛОГИИ


Подготовлен для печати:

д.б.н. Васильевым Д.А.

к.в.н. Золотухиным С.Н.

д.б.н. Щербаковым А.А.

к.б.н. Молофеевой Н.И.





УЛЬЯНОВСК 2005


УДК 619 : 616


Д.А. ВАСИЛЬЕВ, С.Н.ЗОЛОТУХИН, А.А.ЩЕРБАКОВ, Н.И. МОЛОФЕЕВА


УЧЕБНО – МЕТОДИЧЕСКИЕ МАТЕРИАЛЫ ПО ПОДГОТОВКЕ К ЛАБОРАТОРНЫМ И СЕМИНАРСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО КУРСУ БИОТЕХНОЛОГИИ


Данное учебное пособие подготовлено: д.б.н. Васильевым Д.А.,

к.б.н. Золотухиным С.Н., д.б.н. Щербаковым А.А., к.б.н. Молофеевой Н.И.


Цель издания – восполнить существующий пробел в учебном процессе при изучении материала по лабораторному практикуму курса биотехнология. Некоторые разделы изложены более детально, а по некоторым дан описательный материал, что обусловлено лабораторными возможностями кафедры.

Рекомендовано к изданию кафедрой микробиологии, вирусологии, эпизоотологии ветеринарно – санитарной экспертизы для студентов факультета ветеринарной медицины. Рецензент - ст преподаватель, кбн, Афонин Э.А.


«Биотехнология знаменует собой еще одну рево­люцию в науке, которая может изменить жизнь и будущее... людей так же радикально, как это сдела­ла Промышленная революция два века назад и компьютерная революция в наши дни».

из отчета отдела по оцен­кам новых технологий США за 1987 г.


Лекция 1.

Введение. Знакомство с данным курсом. Природа и многообразие биотехнологических процессов.

В середине 1960-х гг. многие пророчили возникновение «новой биологии», развитие прикладных областей которой существенно изменило бы процедуры получения целого ряда химических и фармацевтических средств. Эта «революция» стала реальностью благодаря многочислен­ным открытиям последующего десятилетия в биохимии, в биологии клетки микробиологии, вирусологии и молекулярной биологии. Столь смелые надежды основывались в первую очередь на установлении структуры и функции определенных фер­ментов, их использовании в иммобилизованной форме — прежде всего микробиологами и энзимологами — в разно­образных производственных процессах, а также на том, что специалисты в области молекулярной генетики откры­ли способ модификации ДНК и перенесения ее из одних организмов в другие. Благодаря стреми­тельному прогрессу вирусологии (в исследованиях бакте­риофагов), микробиологии (в углубленном изучении физи­ологии, генетики и молекулярной биологии кишечной палочки (Escherichia coli), а также в изучении плазмид), молекулярной генетики (в установлении генетического кода) и энзимологии (в открытии ферментов рестрикции) были накоплены знания и разработаны методы генной инженерии. Одно­временно были по достоинству оценены и потенциальные возможности этих методов.

Термин «биотехнология» был придуман в 1917 г. венгерским инженером Карлом Эреки для опи­сания процесса крупномасштабного выращива­ния свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. По определению Эреки, био­технология — это «все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых орга­низмов производятся те или иные продукты». Однако это совершенно точное определение не получило широкого распространения. Долгое время термин «биотехнология» относился к двум очень разным дисциплинам. С одной стороны, его употребляли, говоря о промышленной фер­ментации, с другой — применительно к той обла­сти, которая сейчас называется эргономикой. Та­кой двойственности пришел конец в 1961 г., когда шведский микробиолог Карл Гёрен Хеден порекомендовал изменить название научного журнала "Journal of Microbiological and Biochemical Engineering and Technology" («Жур­нал микробиологической и биохимической инжене­рии и технологии»), специализирующегося на публикации работ по прикладной микробиоло­гии и промышленной ферментации, на "Biotechnology and Bioengineering" («Биотехноло­гия и биоинженерия»). С этого момента биотех­нология оказалась четко и необратимо связана с исследованиями в области «промышленного производства товаров и услуг при участии живых организмов, биологических систем и процессов» и встала на прочный фундамент микробиологии, биохимии и химической инженерии.

По классическому определению - биотехнология, это в сущности, не что иное, как использо­вание культур клеток бактерий, дрожжей, животных или растений, метаболизм и биосинтетические возможности которых обеспечивают выработку специфических ве­ществ. Согласно определению Европейской биотехнологической федерации, созданной в 1978 г., биотехнология на основе применения знаний и методов биохимии, молекулярной биологии, микробио­логии, генетики и химической техники позволяет извле­кать выгоду в технологических процессах из свойств микроорганизмов, макроорганизмов и клеточных культур. Она создает воз­можность получения с помощью легко доступных и возобновляемых ресурсов тех веществ и соединений, которые важны для жизни и благосостояния людей. Новейшее определение биотехнологии, предлагаемое академиком ВАСХНИЛ В.С. Шевелухи, это наука о генно-инженерных и клеточных методах и технологиях создания и использования генетически трансформированных биологических объектов для интенсификации производства или получения новых видов продуктов различного назначения.

В промышленном масштабе биотехнология представляет собой уже биоиндустрию. Послед­няя включает в себя, с одной стороны, отрасли, в которых биотехнологические методы могут с успехом заменить широко используемые в настоящее время тради­ционные методы, а с другой — отрасли, в которых биотех­нология играет ведущую роль. Среди первых в области химической промышленности синтез искусствен­ных приправ, полимеров, сырья для текстильной про­мышленности, в области энергетики — получение метано­ла, этанола, биогаза и водорода, в области биометаллур­гии— извлечение некоторых металлов. Во второй группе отраслей биотехнология охватывает: производство продо­вольствия (широкомасштабное выращивание дрожжей, водорослей и бактерий для получения белков, аминокис­лот, витаминов, фермен­тов, продукты гибридомной технологии); увеличение продуктивности сельского хозяйства (клонирование и селекция сортов растений, исходя из тканевых и клеточных культур, производство биоинсекти­цидов); микробиологическую промышленность (разработка и производство вакцин, диагностических препаратов, синтез гормонов, интерферонов и антибиотиков); защиту окружающей среды и уменьшение ее загрязнения (очистка сточных вод, переработка хозяйственных отхо­дов, изготовление компоста, а также производство соеди­нений, поддающихся расщеплению микроорганизмами).

Эта эволюция биотехнологии неотделима от развития знаний об основополагающих механизмах жизнедеятельности. В 1953 г. Сэнгер установил полную структуру белка инсулина, а Уотсон и Крик доказали, что дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) построена из двух нитей. В 1963 г. Ниренберг расшифровал генетический код, кото­рый оказался универсальным как для бактерий, так и для высших организмов вплоть до человека. Тем самым генетическая информация и ее смысл, т. е. взаимосвязь между генетическим кодом и структурой белков, стали доступны для изучения. Важнейший этап был пройден в 60-х гг., когда появилась возможность автоматиче­ски определять структуру белков. Стали производиться приборы, установлены последовательности (первичные структуры) белков, которые составили «атлас белков», хранящийся в компьютерных системах. Вслед за изучением белков были достигнуты и в исследованиях нуклеиновых кислот. В 1976 г. Гилберт и Максам в Гарвардском университете разработали быстрый метод химического анализа ДНК; появилась реальная возможность опреде­лять последовательность нуклеотидов. В 1982—1985гг. стало возможно создать прибор для автоматического анализа нуклеиновых кислот. Анализ ДНК позволяет дедуцировать, основываясь на генетическом коде, аминокислотные последовательности белков, синтез которых находится под контролем соответствующих ге­нов. Следующий важнейший этап — это синтез биополимеров по установленной структуре. Первые коммерческие приборы, производящие автоматизированный синтез полипептидов, были разработаны на основе исследований Меррифилда в 1963 г. После определения структуры фенилаланиновой тран­спортной РНК (тРНК) Корана (первоначально в Висконсинском университете, а затем в Массачусетском техноло­гическом институте в 1970—1972 гг.) произвел синтез ДНК (иначе говоря, гена), соответствующей этой тРНК. Впоследствии Корана и его сотр. синтезировали ген предшественника тирозиновой тРНК Escherichia coli. Итакура с сотр. в Национальном медицинском центре «Хоуп» (Дуарте, Калифорния) в 1977 г. с успехом синтези­ровали ген соматостатина, а в 1979 г.— ген инсулина человека. Эти гены были введены в клетки бактерии Е. coli с использованием методов генной инженерии. Так впервые была продемонстрирована экспрессия гена человека в бактериальных клетках. Созданы автоматические «синтезаторы», позво­ляющие проводить более или менее автоматическое нара­щивание нуклеотидной цепи, связанной с носителем, а вся процедура в целом может контролироваться компьютером (т. е. программой, предус­матривающей хранение, дозировку, перекачивание, впры­скивание в реакционную камеру, отмывку растворителей и реагентов, а также контроль запрограммированной после­довательности операций). В 1980 г. Итакура создал первый синтезатор генов. Синтез фрагментов нуклеиновых кислот, который в 1981 г. проводили наращиванием нуклеотидов один к одному, был быстро усовершенствован за счет соединения заранее полученных более длинных последова­тельностей согласно заданной программе. Полный синтез ДНК, содержащей специфическую последовательность нуклеотидов, отличается от реплика­ции ДНК in vivo или in vitro, катализируемой ДНК-полимеразой. Последняя нуждается в матрице, которая представляет собой двунитевую молекулу ДНК и содер­жит точно воспроизводящуюся информацию, но не слу­жит источником новой информации. При химическом синтезе имеется возможность вносить изменения в после­довательность нуклеотидов и изучать их влияние на биологическую функцию синтезированной таким способом молекулы ДНК (или РНК). Химический синтез дает возможность изучения регуляции синтеза нуклеино­вых кислот, а также регуляции транскрипции РНК на матрице ДНК. В процессе транскрипции решающая роль принадлежит определенным нуклеотидным последователь­ностям, которые называются промоторами. Вводя различные нуклеотиды в после­довательность при химическом ее синтезе, т е, фактически получая точковые мутации, можно прос­ледить за изменениями функции такой последовательности в клетке. Именно таким способом в лаборатории Университет Луи Пастера в Страсбурге, в промоторном участке гена, кодирующего один из полипептидов белка куриного яйца, был заменен единичный нуклеотид. Эта мутация позволила установить роль специфической нуклеотидной последова­тельности в регуляции синтеза информационной РНК. Полученные в результате химического синтеза полинуклеотиды могут быть использованы для выделения с помощью гибридизации соответствующей информацион­ной РНК, кодирующей структуру белка.

Стремительный прогресс биологии, особенно ярко про­явившийся в бурном развитии биотехнологии, тесно связан с усовершенствованием аналитиче­ских методов (необходимисть в которых возникла в связи с развитием микробиологии и вирусологии), таких, как ультрацентрифугирование, введе­ние в молекулы радиоактивных изотопов, электрофорез, аффинная хроматография (например, разделение сложных молекул с помощью соответствующих моноклональных антител), двумерное электрофокусирование (позволяющее анализировать до 50 000 белков в одной клетке) и методы микроанализа (например, определение первичной структу­ры белка, исходя всего из 10 нг, а также определение структуры других биологических макромолекул, таких, как полисахариды, связанные с белками в составе гликопротеинов).

Таким образом, если развитие биологических знаний и в самом деле можно считать детищем технического прогресса, то в настоящее время биологическая наука, обогащенная достижениями энзимологии, микробиологии, вирусологии, молекулярной биологии в силах создать систему взаимосвязанных отраслей биотех­нологии, обладающих уникальным достоинством: они бу­дут основаны на функционировании природных (а не искусственных) систем, метаболические механизмы кото­рых будут подчинены интересам человечества.

В историческом смысле биотехнология возникла как прикладная микробиология тогда, когда дрожжи впервые были использованы для производства пива, а бактерии для производства кисломолочных продуктов. В пользу этого свидетельствует описание процесса приготов­ления пива, обнаруженное в 1981 г. при раскопках Вавило­на на дощечке, которая датируется примерно 6-м тысяче­летием до н. э. В 3-м тысячелетии до н. э. шумеры изготовляли до двух десятков видов пива. Совершенствование процессов сбраживания, увеличе­ние их эффективности, а также изучение многочисленных биохимических реакций, присущих микроорганизмам, шли параллельно с выделением из клеток бактерий и грибов веществ, которые все в большей степени вытесняли синтетические продукты, и противовоспалительные препараты и противопаразитарные средства. Что касается более современных биотехнологических процессов, то они основаны на методах рекомбинантных ДНК, а также на использовании иммобилизованных фер­ментов, клеток или клеточных органелл. При их рассмотрении предпочтительнее пользоваться терминами «генетическая рекомбинация in vitro» или «ис­пользование рекомбинантных ДНК», а не «манипулирова­ние генами» или «генная инженерия». Согласно определе­нию Национальных институтов здоровья США, рекомбинантными ДНК называются молекулы ДНК, полученные вне живой клетки, в пробирке, путем соединения природ­ных или синтетических фрагментов ДНК с молекулами, способными реплицироваться в клетке. Основу экспери­мента составляет встраивание природной или чужеродной ДНК в вектор, который представляет собой бактериаль­ную плазмиду или геном вируса; затем рекомбинантную молекулу ДНК вводят в клетку, где она реплицируется. Клетка, содержащая такую ДНК, размножается, образуя клон трансформированных клеток. Одна из целей биотех­нологии заключается в том, чтобы получить клоны трансформированных клеток, способных к экспрессии чужеродной генетической информации и образованию специфических белков в больших количествах. Предпосылкой прогресса в этой области послужило открытие в 1972 г. Арбером (Базель) и Смитом и Натансом (Университет Джона Гопкинса) — лауреатами Нобе­левской премии 1978 г.— ферментов рестрикции, которые расщепляют ДНК в специфических участках. Не менее важным оказалось открытие лигаз — ферментов, способ­ных «сшивать» фрагменты ДНК,— и обратной транскриптазы, синтезирующей ДНК на матрице РНК. Для встра­ивания одного или нескольких генов в ДНК с последу­ющим введением в клетки микроорганизма необходимы как рестрикционные эндонуклеазы, так и лигазы. Следует подчеркнуть, что генная инженерия чрезвы­чайно важна не только для биотехнологических разрабо­ток, но в не меньшей степени и для фундаментальных исследований, связанных с изучением структуры генов высших организмов, регуляции экспрессии генов, структу­ры белков, которую определяют по структуре кодиру­ющей их ДНК, а также перетасовки генов в эволюции. Технология иммобилизованных ферментов получила свое развитие в конце 60-х гг и с успехом применялась не только в промышленном производстве полусинтетических пенициллинов, получении концентрата фруктозы из крахмала зерновых культур, но и при проведении биохимических анализов. Еще эффективнее оказываются иммобилизованные клетки или клеточные органеллы, пос­кольку они содержат все необходимые гены для синтеза сложных соединений.

Таким образом, развитие биотехнологии в огромной степени определяется исследованиями в области микробио­логии, биохимии, энзимологии и генетики микроорганиз­мов, а также наличием коллекций культур микроорганизмов, надлежащим образом учтенных и постоянно изучаемых. Необходи­мо уделять внимание и таксономии микроорганизмов, так как биотехнологические разработки базируются на глубо­ком знании характеристик штаммов микробов. Более того, поскольку эти штаммы могут быть защищены патентами, они будут играть ключевую роль в развитии многих отраслей фундаментальных исследований, а также в прик­ладных исследованиях, в биотехнологии и промышленной микробиологии. История промышленной микробиологии, и ее современ­ное состояние позволяют проследить тесную связь фунда­ментальных и прикладных исследований. Столетие назад исследования Пастера, направленные на решение сугубо практических задач, привели к становлению микробиоло­гии, иммунологии и биохимии, а открытие в 1940-х гг. микробиологами-практиками антибиотиков обусловило создание методических приемов, сыгравших решающую роль в развитии молекулярной биологии, и одновременно дало толчок важнейшим изменениям в фармацевтической промышленности. Наконец, за последние 30 лет фунда­ментальные исследования в области генетики микроорга­низмов позволили разработать целый ряд новых методов для промышленного применения. Такая взаимосвязь науки и технологии является решающим условием дальнейшего прогресса промышленной микробиологии. Вместе с тем, хотя биотехнологические процессы прежде всего связаны с микробиологией и энзимологией, не менее существенную роль играет и использование клеток животных, например для культивирования вирусов, при производстве вакцин, для получения интерферона, а также при синтезе моноклональных антител клетками гибридом. С начала 1950-х гг. вирус полиомиелита для производ­ства вакцины выращивается в культурах клеток млекопи­тающих. С тех пор линии культур клеток человека стали незаменимыми для выделения и выращивания ряда других вирусов, при производстве высокоспецифичных белков (таких, как антитела и интерфероны), в исследованиях рака и в противовирусной химиотерапии. Суспензию отдельных клеток получают обработкой размельченной ткани эмбриона пищеварительным фермен­том, трипсином. Если клеткам в такой суспензии дать осесть на плоскую поверхность в сосуде с культуральной средой, то клетки становятся плоскими и делятся, образуя монослой. Рост клеток и выход биомассы можно увеличить, добавив к суспензии носи­тель— микроскопические гранулы из инертного синтети­ческого полимера, на которых клетки закрепляются и пролиферируют. Суспензионные культуры клеток получают объемом до 10 000 л. Деление клеток млекопитающих происходит при­мерно раз в сутки, тогда как клетки дрожжей делятся каждые 1,5—2 ч, а бактериальные клетки — каждые 20— 60 мин. Большинство культур клеток млекопитающих, в том числе и клеток человека, удается сохранять неопределенно долгое время замороженными в специальной среде при -180° С.

Развитие биотехнологии коснулось и растений, хотя и позднее: для широкомасштабного производства клонов растений используются меристемы, а культу­ры растительных клеток применяют для синтеза различ­ных веществ, как самых обычных (алкалоиды и другие вторичные метаболиты), так и экзотических (идиолиты). В 1937 г. Готере с успехом культивировал недифферен­цированную ткань моркови. Полученный при этом каллус, отделенный от родительского растения, удавалось фрагментировать и культивировать в новой культуральной среде, содержащей растительный гормон, ауксин. Такие культуры можно было поддерживать неопределенно долго. Некоторые линии, полученные Готере, поддержи­ваются в культуре до сих пор. В 1954 г. Мюир, Хильдебрандт и Рикер получили культуру из отдельных растительных клеток; этот метод затем усовершенствовал во Франции Лутс, а Бергманн для выращивания суспензионных культур растительных кле­ток воспользовался методами, разработанными для бакте­риальных культур. Еще в 1892 г. Клеркер выделил протопла­сты, однако лишь в 1960 г. Кокинг создал достаточно простой метод ферментативного получения протопластов в больших количествах. Слияние протопластов позволяет увеличивать число и разнообразие гибридов без примене­ния полового размножения В 1957 г. Скоог и Миллер, обработав каллус расти­тельными гормонами (ауксином и кинетином), добились образования корней и стеблей. Затем Морель показал, что другой растительный гормон — гиббереллин — индуцирует пролиферацию меристем и их дифференцировку с образованием в конечном счете целого растения. Этот процесс регенерации нашел важное применение в сельскохозяй­ственной практике— на нем основано получение безвирус­ных растений, а также размножение новых культурных разновидностей или видов, которые обычно не размножа­ются вегетативно. Биологическое многообразие культур растительных клеток и тканей открывает интересные перспективы изу­чения новых полезных соединений. Освоение методов массового культивирования позволит синтезировать такие молекулы. Начиная с 1970 г. исследователи нередко на­блюдали, что клетки, растущие в культуре, синтезируют вещества, которые не обнаруживаются в целом растении.

Так, клеточные культуры Catharanthus roscus синтезируют несколько десятков различных алкалоидов; из них иденти­фицированы лишь восемь, четыре не найдены в целом растении, а два оказались неизвестными дотоле веществами.

Решение таких проблем, как нехватка продуктов пита­ния и дефицит белка, будет найдено с помощью биотехнологии за счет снижения стоимости производства аминокислот — необходимого компонента корма домашних животных, благодаря разработке методов получения бел­ка одноклеточных (кормового белка), переработкой пара­финов или другого доступного сырья (целлюлозы, агро­промышленных или сельскохозяйственных отходов, сточ­ных вод), а также путем клонирования растений и отбора высокоэффективных разновидностей. В перспективе на основе методов рекомбинантных ДНК биотехнология поз­волит освоить синтез растительных белков и добиться искусственного фотосинтеза и фиксации азота.

Резюмируя выше изложенное обобщим понятия о сути биотехнологии и её задачах.

История становления биотехнологии может быть подразделена на пять основных этапов (периодов), которые вследствие их важ­ности для развития биотехнологии иногда не совсем строго назы­вают «эрами».

1. Допастеровская эра (до 1865 г.). В этот период биотехноло­гическими методами получали пиво, вино, сыр, хлеб, йогурт, ке­фир, разного рода ферментированную пищу.

2. Пастеровская эра (1865—1940 гг.). Стали известны микроор­ганизмы-продуценты, и это позволило создать производства этанола, бутанола, ацетона, глицерина, лимонной кислоты, многих вакцин, организовать процессы биологической очистки стоков аэробными микроорганизмами.

3. Эра антибиотиков (1940—1960 гг.). Были открыты пени­циллин, стрептомицин и многие другие антибиотики, разработа­на технология культивирования клеток животных и получение вирусных вакцин, технология биотрансформации стероидных гормонов.

4. Постантибиотическая эра (1960—1975 гг.). Созданы техно­логии аминокислот, микробиологического белка на парафинах нефти, ферментов, используемых в стиральных порошках. Разра­ботана технология иммобилизации ферментов (закрепления их на носителях) для получения глюкозо-фруктозных сиропов. К аэроб­ной обработке стоков добавилась анаэробная обработка твердых отходов с получением биогаза. Открыт микробиологический спо­соб получения полисахаридов (начиная от ксантана для увеличе­ния вязкости раствора нефтяных скважин до жевательной резин­ки). В этот период стали серьезно говорить о газохоле и вообще о техническом спирте как топливе для автомобилей.

Созданы микробиологические технологии витаминов В₃ и B₁₂, а также микопротеина — мицелиального микроскопического гри­ба, используемого как заменитель мяса. Ученые научились куль­тивировать изолированные растительные клетки, что положило начало биотехнологическому производству многих ценных лекар­ственных веществ с использованием огромного потенциала лекар­ственных растений. К этому же периоду относится зарождение биометаллургии — бактериального выщелачивания меди и цинка из руд.

5. Эра новой биотехнологии (после 1975г.). Характеризуется разработкой генной инженерии, которая позволяет целенаправ­ленно изменять геном микроорганизмов, переносить в него свойства, заимствованные из геномов растений и животных. Это позволило создать микробиологическую технологию человечес­кого инсулина, интерферона, соматотропного и ростовых гормо­нов и многого другого. Создана гибридомная технология, позволяющая получать мо-ноклональные антитела, являющиеся основой для огромного раз­нообразия диагностических препаратов. Появились так называе­мые «трансгенные» растения и животные, в которых осуществля­лось целенаправленное конструирование генома.

Как же понять термин биотехнология? Биотехнология — это целенаправленное получение ценных продуктов, в процессе которого используется биохимичес­кая деятельность микроорганизмов, изолированных клеток или их компонентов.

В этом определении скрыты некоторые «подводные камни», поэтому рассмотрим его более подробно на примерах. Наиболее часто биотехнологию путают с растениеводством или животноводством. Например, получение пшеницы из воды и удобрений на пер­вый взгляд — биотехнология. Однако здесь используется биохи­мическая деятельность не изолированных клеток, а целого расте­ния, макроорганизма, относящегося к высшим, многоклеточным организмам. Это — не биотехнология, а растениеводство. Точно так же получение лекарства из корня женьшеня — не биотехнология. А вот когда из этого корня берут отдельные клет­ки, отделяя их с помощью ферментов от многоклеточной расти­тельной ткани, и разводят эти отдельные, изолированные клетки на специальном питательном растворе, как дрожжи, получая биомас­су изолированных клеток женьшеня, из которой путем настаива­ния можно получить столь же ценное лекарство, как из целого корня, — это уже биотехнология.

Другой пример — производство молока. Молоко получают от коровы, овцы или другого млекопитающего животного, т. е. это — работа макроорганизма. Значит, это не биотехнология. А вот полу­чение из молока кефира, йогурта или другого кисло-молочного продукта основано на биохимической деятельности молочно-кислых бактерий — это вполне легитимная биотехнология. В производстве глюкозы из крахмала есть процесс гидролиза: раствор крахмала подкисляют, нагревают до определенной тем­пературы и выдерживают некоторое время. В результате крах­мал распадается на глюкозу, получается гидролизат — грязнова­тый раствор глюкозы с примесями. Это — химичес­кий, а не биотехнологический процесс. Есть другой процесс — процесс ферментативного гидролиза крахмала. В этом случае к суспензии крахмала добав­ляют фермент, и под его действием также происходит расщеп­ление крахмала до глюкозы, но в гораздо более мягких условиях и без образования нежелательных примесей, с меньшими поте­рями. Ферменты — это выделенные из клетки белковые веще­ства, компоненты клетки. Следовательно, по определению, этот процесс — биотехнология.

Во всех приведенных примерах в качестве основания для отне­сения процесса к биотехнологии или к химической технологии мы рассматривали то, посредством каких воздействий осуществляется обработка продукта.

Иногда обращают внимание на другое: какое сырье обрабатыва­ется — химическое или биологическое. Например, очень часто производство мясных продуктов отно­сят к биотехнологии, обосновывая это тем, что исходное сырье — туши забитых животных, сырое мясо и так далее — являются про­дуктами биологического происхождения. С этой точки зрения, например, приготовление котлет — это биотехнология, хотя рабочий процесс заключается в измельче­нии мяса и затем в его тепловой обработке, т. е. нет биохимичес­кой деятельности микроорганизмов или клеток, а значит, это не биотехнология. А вот обработка мясного фарша определенными заквасками и последующий режим созревания, используемый при приготовлении дорогих сортов колбас, — это, конечно, био­технология.

На практике часто не делают столь строгих различий, и многие процессы переработки сырья биологического происхождения на­зывают процессами биотехнологическими.

В дальнейшем мы увидим, что и строго биотехнологические производства, например микробиологическое получение спирта или антибиотиков, имеют в своем составе кроме биотехнологичес­ких также химико-технологические и физико-механические про­цессы.

Поскольку сырьем для каждого из этих процессов служит по­лупродукт биотехнологического происхождения, эти процессы вполне законно также называют биотехнологическими — как часть многостадийной технологии производства.

Обратим внимание еще на одно важное слово в определении биотехнологии — «целенаправленно». Действительно, с точки зре­ния человека микроорганизмы работают в природе не всегда целе­направленно. Например, многие болезни вызываются действием микроорганизмов, и наоборот, многие микроорганизмы, населяю­щие человеческое тело полезны. Вспомните, что после лечения антибиотиками, когда эти полезные микроорганизмы уничтожаются наряду с вредными, возникает та­кое заболевание, как дисбактериоз, которое приходится лечить вве­дением в организм бактерий (например, бифидобактерий или молочно-кислых бактерий). Это не биотехнология, а медицина.

Биотехнология — это организованная человеком деятельность микроорганизмов, направленная на получение определенного продукта.

Существует биогеохимическая деятельность бактерий, в ре­зультате чего происходит переработка растительности и деревьев в торф, уголь, нефть, выщелачивание металлов и многие другие гло­бальные процессы. Эти процессы нельзя называть биотехнологическимм, потому что они нецеленаправленные. Или, например, можно заметить, как после загрязнения почвы нефтью происходит естественное (не организованное человеком, т. е. не целенаправ­ленное) биовосстановление — через 5—10 лет под воздействием микроорганизмов почва самоочищается. А вот когда мы специаль­но организовываем технологию очищения почвы, вводя в нее до­полнительные микроорганизмы или усиливая питание естествен­ных почвенных микроорганизмов, — это уже биотехнология, био­технология очистки почвы от загрязнений.

В настоящее время достижения биотехнологии перспективны в следующих отраслях:

• в промышленности (пищевая, фармацевтическая, химичес­кая, нефтегазовая) — использование биосинтеза и биотрансфор­мации новых веществ на основе сконструированных методами ген­ной инженерии штаммов бактерий и дрожжей с заданными свой­ствами на основе микробиологического синтеза;

• в экологии — повышение эффективности экологизированной защиты растений, разработка экологически безопасных тех­нологий очистки сточных вод, утилизация отходов агропромыш­ленного комплекса, конструирование экосистем;

• в энергетике — применение новых источников биоэнергии, полученных на основе микробиологического синтеза и моделиро­ванных фотосинтетических процессов, биоконверсии биомассы в биогаз;

• в сельском хозяйстве — разработка в области растениевод­ства трансгенных агрокультур, биологических средств защиты ра­стений, бактериальных удобрений, микробиологических методов рекультивации почв; в области животноводства — создание эф­фективных кормовых препаратов из растительной, микробной биомассы и отходов сельского хозяйства, репродукция животных на основе эмбриогенетических методов;

• в медицине — разработка медицинских биопрепаратов, мо-ноклональных антител, диагностикумов, вакцин, развитие имму-нобиотехнологии в направлении повышения чувствительности и специфичности иммуноанализа заболеваний инфекционной и неинфекционной природы. Своеоб­разием и активностью ферментов определяются все жиз­ненные функции организмов.


ЛЕКЦИЯ 2.

СПОСОБЫ И ОСОБЕННОСТИ ТЕХНОЛОГИИ ПРОМЫШЛЕННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Для осуществления любого биотехнологического процесса необхо­димы:

культура микроорганизмов;

питательная среда;

аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций;

средства контроля и управления.

Культивирование является основной стадией технологического процесса и во многом определяет количественные и качественные ха­рактеристики производства биопрепаратов. На стадии культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микро­организмов.

Иногда, например, при производстве бактериальных препаратов, целевым продуктом является сама биомасса, в других случаях продук­ты, синтезируемые клеткой - антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.

В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, потребляя содержащиеся в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма, такой способ культиви­рования называют поверхностным.

При твердофазном культивировании клетки растут на поверхности твердой (плотной) среды, содержащей достаточное количество влаги и питательных веществ (чаще всего основу такой среды составляют пшеничные отруби).

При жидкофазном (глубинном) культивировании, микроорганизмы распределяются по всему объекту жидкой питательной среды, а ки­слород поступает к клеткам в результате интенсивной операции пере­мешивания.

Последний способ наиболее широко применяется в настоящее вре­мя в производстве большинства препаратов по следующим причинам:

1. Позволяет получить большое количество бактериальной массы за короткое время. Так, при культивировании микроорганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния покоя количество микробов не превышает 1-2 млрд см ^-3, а с применением принудительной аэра­ции урожайность, в зависимости от состава питательной среды, дости­гает 50 - 60 млрд см^-3. Это объясняется тем, что при аэрации практи­чески отсутствует начальная стационарная фаза, и бактерии сразу на­чинают интенсивно размножаться, переходя в логарифмическую фазу.

2. Процесс легко управляем. При глубинном выращивании имеются существенные различия в степени потребления углеродных и азоти­стых веществ. Они интенсивно потребляются при аэрации культураль-ной жидкости, поэтому, чтобы процесс роста и размножения не пре­кращался быстро, нужно в процессе культивирования дополнительно вводить углеродные и азотистые соединения, а при необходимости и другие стимуляторы роста микроорганизмов.

Добавление питательных веществ, особенно углеводных (глюкоза) и биологических стимуляторов усиливает интенсивность размноже­ния, что и приводит к увеличению концентрации микроорганизмов в момент съема их биомассы. Данный способ также позволяет легко корректировать рН среды в процессе культивирования, что очень важ­но для достижения максимальной интенсивности размножения.

3. Максимальная технологичность. Так, поверхностный метод ме­нее технологичен и в промышленных условиях применяется в исклю­чительных случаях, когда нельзя воспользоваться глубинным методом.

Технологический процесс глубинного выращивания микроорга­низмов в реакторах (ферментерах) так же как и при использовании плотных питательных сред, складывается из следующих этапов:

1. Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними.

2. Приготовление посевной микробной культуры.

3. Приготовление и стерилизация питательных сред.

4. Подготовка биореактора к посеву.

5. Выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль над про­цессом культивирования.

Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций:

> стерилизацию оборудования и коммуникаций;

> приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов и др. Остановимся на каждом из этапов культивирования.

1.1. ОТБОР ШТАММОВ МИКРООРГАНИЗМОВ И РАБОТА С НИМИ

Эталонные, или референтные, штаммы хранятся и поддерживаются на заданном уровне во ВГНКЙ ветеринарных препаратов. Эти штам­мы, в свою очередь, являются производственными, поскольку на их основе готовятся вакцины. При этом инактивированные вакцины, как правило, готовятся из высоковирулентных штаммов, а живые вакцины - из аттенуированных (ослабленных), авирулентных штаммов.

Наряду с производственными и эталонными штаммами во ВГНКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют для оценки каче­ства вакцинных препаратов. Эти штаммы должны быть генетически однородными популяциями микроорганизмов со стабильными морфо­логическими, специфическими и биологическими свойствами. Основ­ными требованиями к этим штаммам являются их высокие антигенные и иммуногенные свойства.

Антигенные свойства штаммов оцениваются по титру антител в сыворотке крови чувствительных животных через определенные сроки после введения им микроорганизмов.

Иммуногенньхе свойства штаммов определяются по устойчиво­сти привитых животных к заражению возбудителем болезни опреде­ленной дозой контрольного (вирулентного) штамма и выражают 50%-ной дозой иммуногенности или по нарастанию титра антител в сыво­ротке крови. При этом 80% привитых животных должны быть невос­приимчивы к инфекции, против которой их вакцинировали.

Безвредность (реактогенность) эталонного, производственного штамма проверяют по выраженности реакции у лабораторных и есте­ственно-восприимчивых животных на 5-10-кратное увеличение приви­вочной дозы.

Производственные, эталонные штаммы, должны сохранять генети­ческую стабильных антигенных, иммуногенных и других присущих им биологических свойств на протяжении 10-20 последовательных пере­севов как in vivo, так и in vitro.

1.2. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПОСЕВНОЙ МИКРОБНОЙ КУЛЬТУРЫ

Обычно производственное культивирование микроорганизмов при изготовлении вакцин осуществляют в больших объемах. Поэтому вна­чале из имеющегося эталонного штамма микроорганизма, находяще­гося, как правило, в лиофильно высушенном состоянии в ампуле, де­лают посевы в небольшие емкости, например во флаконы емкостью 100-200 см³, заполненные по 50-150 мл производственной средой. За­тем из флаконов делают высевы в большие емкости - бутыли объемом 18-20 литров.

При хорошем накоплении микроорганизмов такую культуру вно­сят в реактор и называют посевной (матрацной, матровой, маточной). При этом нужно предварительно рассчитать необходимое количество посевной культуры для производственного культивирования микроор­ганизмов, исходя из посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 10 % по объему. Посевные микробные культуры также контролиру­ются на сохранение ими типичных морфологических, культурально-биохимических, антигенных и иммуногенных свойств и отсутствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ).


1.3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ И СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Одним из этапов получения биопрепаратов является культивирова­ние микроорганизмов, которое невозможно без достаточного количе­ства разнообразных стандартных, эффективных и недорогих питатель­ных сред (ПС).

В этой связи представляется целесообразным рассмотреть основ­ные принципы, лежащие в основе конструирования ПС, к которым относятся:

- удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов;

- выбор сырьевых источников для конструирования ПС;

- дифференциация ПС по целевому назначению;

- оптимизация ПС;

- стандартизация ПС.

Удовлетворение питательных потребностей микроорганизмов

Основополагающим принципом конструирования ПС является полноценность, т.е. состав среды должен удовлетворять питательным потребностям культивируемых микроорганизмов.

В процессе роста микроорганизмы потребляют из окружающей их питательной среды целый ряд разнообразных химических веществ, составляющих основу энергетического и конструктивного обмена в клетках.

Поступление питательных веществ в цитоплазму может осуществ­ляться через всю поверхность клетки и связано с их диффузией, а так­же с действием специальных транспортных систем. Причем необходи­мые для роста и жизнедеятельности клетки элементы должны нахо­диться в определенной, легкоусваиваемой форме.

К основным компонентам, формирующим клеточное вещество, от­носятся: углерод, азот, кислород и водород. Содержание этих элемен­тов в различных микроорганизмах практически постоянно.

Синтетические возможности микроорганизмов и способы получе­ния ими энергии разнообразны, следовательно, и очень индивидуаль­ны их потребности в источниках питания.

Отсюда ясно, что универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов и клеток не существует.

Разнообразие микроорганизмов проявляется, прежде всего, в отно­шении к источникам углерода и азота. Эти элементы представлены в средах различными веществами, и именно они определяют специфич­ность сред.

В зависимости от формы, в которой микроорганизмы используют необходимые им питательные вещества, их подразделяют на две большие группы:

1. Автотрофы — микроорганизмы, которые могут синтезировать вещества своей протоплазмы из простых неорганических соединений. Например, они ассимилируют углерод из углекислоты воздуха, азот из аммиака.

2. Гетеротрофы - микроорганизмы, для которых источником угле­рода и азота служат органические вещества. Они усваивают органиче­ские углеродсодержащие соединения: углеводы, органические кисло­ты, спирты и углеводороды. Наиболее доступные из источников угле­родного питания-углеводы, такие как глюкоза, сахароза или мальтоза.

В зависимости от типов используемых азотистых соединений мик­роорганизмы разделяют на две группы:

1. Протеолитические, расщепляющие высокомолекулярные белко­вые вещества и пептиды;

2. Дезаминирующие, требующие присутствия в среде готовых ами­нокислот, расщепление которых сопровождается выделением аммиака.

Очень часто микроорганизмы и клетки нуждаются во многих при­родных аминокислотах, которые являются универсальными компонен­тами питания. Они целиком включаются в структуру клетки.

Из всех незаменимых аминокислот ключевая роль принадлежит глутамину, а также аргинину, который имеет принципиальное значе­ние для обезвреживания токсичных метаболитов незаменимых амино­кислот и аммиака.

Неорганические соли, входящие в состав ПС, удовлетворяют по­требности микроорганизмов в ионах К⁺, Mg²⁺, Мп²⁺ , Fe²⁺ или Fe³⁺, Р0₄^3-, S0₄^2-. Они же определяют необходимое осмотическое давление среды, величину рН и буферную емкость.

В ПС необходимо также наличие некоторых других ионов, в част­ности, Zn²⁺ Cu²⁺ , Co²⁺ ,Ca²⁺, СL^- и др. Обычно они присутствуют в дос­таточном количестве в виде примесей в питательных основах, мине­ральных компонентах среды или содержатся в водопроводной воде, используемой для приготовления ПС.

Функция необходимых микроорганизмам и клеткам ионов метал­лов заключается в том, что они служат активаторами и кофакторами

многих ферментов, кроме того, участвуют в регуляции синтеза белка, являются компонентами белковых комплексов.

Считается также, что в ПС должны присутствовать факторы роста, различные по химической природе соединения, главным образом, ор­ганические вещества (витамины, аминокислоты, жирные кислоты, пу-риновые и пиримидиновые основания), добавление которых в очень незначительных количествах стимулирует рост и размножение микро­организмов.

К факторам роста относят витамины группы В, гемин (фактор X), путресцин, олеиновую кислоту, козимазу (фактор Y) и ее ферменты, пуриновые основания (аденин, гуанин, ксантин, гипоксантин) и пири­мидиновые (цитозин, тиамин, урацил), гормоны и др.

Функции факторов роста разнообразны. Они участвуют в процес­сах обмена веществ. Отсутствие или недостаток их в среде приводит к бактериостатическому эффекту.


Выбор сырьевых источников для конструирования питательных сред

Другим наиболее важным принципом конструирования ПС являет­ся выбор сырьевых источников.

Качество ПС во многом определяется полноценностью состава пи­тательных субстратов и исходного сырья, используемого для их при­готовления. Большое разнообразие видов сырьевых источников ставит сложную задачу выбора наиболее перспективных, пригодных для кон­струирования ПС требуемого качества. Определяющую роль в данном вопросе играют, прежде всего, биохимические показатели состава сы­рья, от которых зависит выбор способа и режимов его переработки с целью наиболее полного и эффективного использования содержащих­ся в нем питательных веществ.

Для получения ПС с особо ценными свойствами применяют прежде всего традиционные источники белка животного происхождения, а именно мясо крупного рогатого скота (КРС), казеин, рыбу и продукты ее переработки. Наиболее полно разработаны и широко применяются ПС на основе мяса КРС.

Учитывая дефицит кильки каспийской, широко применяемой в не­далеком прошлом, для получения рыбных питательных основ стала использоваться более дешевая и доступная непищевая продукция рыб­ной промышленности - сухой криль, отходы переработки мяса криля, филетированный минтай и его перезрелую икру. Наибольшее же рас­пространение получила рыбная кормовая мука (РКМ), удовлетворяю­щая требованиям биологической ценности, доступности и относитель­ной стандартности.

Довольно широкое распространение получили ПС на основе казеи­на, который содержит все компоненты, имеющиеся в молоке: жир, лак­тозу, витамины, ферменты и соли. Однако необходимо отметить, что в связи с удорожанием продуктов переработки молока, а также повыше­нием спроса на казеин на мировом рынке, применение его носит не­сколько ограниченный характер.

Из непищевых источников белка животного происхождения в каче­стве сырья для конструирования полноценных ПС необходимо выде­лить кровь убойных животных, которая богата биологически активны­ми веществами и микроэлементами и, кроме того, содержит продукты клеточного и тканевого обмена. Гидролизаты крови сельскохозяйст­венных животных используются в качестве заменителей пептона в дифференциально-диагностических питательных средах.

К другим видам белоксодержащего сырья животного происхожде­ния, которые могут быть использованы для конструирования ПС, от­носятся: плацента и селезенка КРС, сухой белковый концентрат - про­дукт переработки мясных отходов, спилковая обрезь, получаемая при обработке кожи, эмбрионы домашних птиц - отход вакцинного произ­водства, кровезаменители с истекшим сроком годности, творожная сыворотка, мягкие ткани моллюсков и ластоногих.

Перспективно использование тушек пушных зверей из зверо-хозяйств, крови КРС, получаемой на мясокомбинате, обезжиренного молока и молочной сыворотки (отходы маслозаводов).

В целом же ПС, приготовленные из сырья животного происхожде­ния, имеют высокое содержание основных питательных компонентов, являются полноценными и сбалансированными по аминокислотному составу и достаточно хорошо изучены.

Из продуктов растительного происхождения в качестве белкового субстрата для ПС возможно использование кукурузы, сои, гороха, кар­тофеля, люпина и др. Однако, растительное сельскохозяйственное сы­рье содержит белок, несбалансированный состав которого зависит от условий выращивания культур, а также липиды в больших количест­вах, чем продукты животного происхождения.

Обширную группу составляют ПС, изготавливаемые из белкового сырья микробного происхождения (дрожжи, бактерии и т.д.). Амино­кислотный состав микроорганизмов, служащих субстратом для приготовления ПС, хорошо изучен, а биомасса используемых микроорга­низмов является полноценной по составу питательных веществ и ха­рактеризуется повышенным содержанием лизина и треонина.

Разработан целый ряд ПС комбинированного состава из белковых субстратов различного происхождения. К ним относятся дрожжевая казеиновая питательная среда, дрожжевая мясная и т.д.

Основой большинства известных ПС являются гидролизаты казеи­на, мяса КРС и рыбы (до 80%). Удельный же вес непищевого сырья в технологии конструирования ПС составляет всего 15% и в дальней­шем требует увеличения.

Используемое для получения питательной основы (ПС) непищевое сырье должно удовлетворять определенным требованиям, а именно быть:

полноценным (количественный и качественный состав сырья должен, в основном, удовлетворять питательным потребностям микро­организмов и клеток, для которых разрабатываются ПС);

доступным (иметь достаточно обширную сырьевую базу);

технологичным (затраты на внедрение в производство должны осуществляться с использованием имеющегося оборудования или су­ществующей технологии);

экономичным (затраты на внедрение технологии при переходе на новое сырье и его переработку не должны превосходить нормы за­трат для получения целевого продукта);

стандартным (иметь длительные сроки хранения без изменения физико-химических свойств и питательной ценности).

Дифференциация питательных сред по целевому назначению

Прежде чем приступить к разработке ПС, необходимо решить во­прос о предназначении будущей среды. Следовательно, дифференциа­ция ПС по целевому назначению также является одним из основных принципов их конструирования.

В соответствии с этим принципом среды подразделяют:

• на микробиологические (предназначенные для культивирования бактерий,

дрожжей, грибов);

• среды для культур клеток, часть из которых относят также к ви­русологическим средам.

По физическому состоянию ПС классифицируются на:

> жидкие

> жидкие концентрированные

> полужидкие

> твердые (плотные)

> сухие.

Жидкие среды лучше обогащать кислородом, в них легче изучить влияние на культуру различных факторов, определить бактериальную массу, образование веществ и побочных продуктов. Жидкие среды ис­пользуют для проведения более точных исследований, их составом проще варьировать.

Полужидкие среды получают путем добавления к жидким концен­трирующих примесей, например 0,5% агара, и используют, в частно­сти, для культивирования анаэробных микроорганизмов или при ди­агностике вирусов в чувствительных тканевых культурах.

Для культивирования клеток широко применяются жидкие концен­трированные среды, выпускаемые фирмами в виде 10-, 50- и 100-кратных концентратов.

К плотным ПС обычно относят агаризованные среды, но в качест­ве уплотняющих веществ могут использоваться желатина, силикагель, карбоксилметилцеллюлоза и другие. К ним можно отнести свернутую сыворотку, свернутый яичный белок, картофель, ломтики моркови, зерна, пшено, рис и отруби.

Плотные ПС, в отличие от жидких, более удобны в транспортиров­ке. На них легче проводить микроскопическое изучение культур, легче выявить заражение посторонней микрофлорой и выделить чистую культуру из отдельных колоний. Кроме того, для хранения микроорга­низмов, как правило, применяются именно плотные ПС. Однако, по­скольку плотные среды получают, главным образом, включением в их состав агара, то вместе с ним могут быть внесены в качестве примесей различные катионы, питательные вещества и ростовые факторы в ко­личестве, достаточном для проявления роста некоторых нежелатель­ных культур.

Очень удобны в работе и перспективны в использовании сухие ПС. Они стандартны, хорошо хранятся и транспортируются, быстро рас­творяются в воде при комнатной температуре. Их широко используют для получения диагностических ПС. Дифференциация ПС проводится также по сложности. По этому признаку среда подразделяются на:

< простые, или обычные (пептонная вода, мясо-пептонный буль­он, мясо-пептонный агар, питательная желатина и др.); их иногда на­зывают универсальными;

< сложные, политропные, или специальные (кровяной агар, асци-тический агар и бульон, мясо-пептонный сахарный бульон, сыворо­точный агар и бульон, свернутая сыворотка, кровяной бульон).

По происхождению и природе составных элементов среды подраз­деляются на:

> естественные (натуральные, комплексные);

> полусинтетические;

> синтетические.

Натуральные ПС - это природные, комплексные органические сре­ды неизвестного или неопределенного состава, которые включают ' продукты животного или растительного происхождения.

К ним относятся пептоны, кровь, отвары и экстракты, полученные из природных субстратов (мясо, рыба, навоз, почва, крупы), овощные или фруктовые соки, сусло, молоко, ткани и сыворотка животных, кар­тофель, соевые бобы и др.

На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорга­низмы, т.к. в них имеются, как правило, все компоненты, необходимые для их роста и развития. Но они имеют сложный непостоянный хими­ческий состав, т.е. нестандартны, что является их очевидным недос­татком. И поэтому мало пригодны для изучения физиологии обмена веществ микроорганизмов, т.к. не позволяют учесть потребление ряда компонентов среды и образование продуктов обмена по ходу развития.

Полусинтетические среды, кроме органических и неорганических веществ известного состава, содержат в незначительных количествах продукты природного происхождения. Эти ПС также отличаются не­стандартностью (хотя и более стандартны, чем натуральные). Приме­ром могут быть: картофельная среда с глюкозой, состав которой зави­сит от сорта и возраста картофеля; дрожжевая среда; мясо-пептонный бульон и др.

Синтетические ПС готовят из точно определённых количеств орга­нических и неорганических химических соединений известного соста­ва и воды. Преимущество синтетических сред — постоянный состав и воспроизводимость. Однако, как правило, в них требуется вносить различные добавки, в частности факторы роста.

Следует отметить, что среды, содержащие агар, нельзя рассматри­вать как синтетические из-за сложности и недостаточной определён­ности состава агара.

Возможность менять состав среды в нужном направлении делает синтетические среды весьма пригодными для систематического изуче­ния физиологии микроорганизмов путем широкого синтеза питатель­ных веществ из определённых составных частей.

Отдельные штаммы одного и того же вида бактерий по-разному относятся к различным химическим соединениям, и в связи с этим он получил практическое приложение в вопросах дифференциации от­дельных штаммов внутри групп.

По набору питательных веществ выделяют:

• минимальные среды, которые содержат лишь источники питания, достаточные для роста;

• богатые среды, в состав которых входят многие дополнительные вещества.

В зависимости от назначения ПС различают:

• дифференциально-диагностические

• элективные

• селективные

• ингибиторные

• среды для поддержания культуры

• накопительные (насыщения, обогащения)

• консервирующие

• контрольные.

Дифференциально-диагностические - это сложные среды, на кото­рых микроорганизмы разных видов растут по-разному, в зависимости от биохимических свойств культуры. Они предназначены для иденти­фикации видовой принадлежности микроорганизмов, широко исполь­зуются в клинической бактериологии и проведении генетических ис­следований.

Селективные, ингибиторные и элективные ПС предназначены для выращивания строго определенного вида микроорганизма. Эти среды служат для выделения бактерий из смешанных популяций и диффе­ренцирования их от сходных видов. В их состав добавляют различные вещества, подавляющие рост одних видов и не влияющие на рост дру­гих.

Например, для выделения грамотрицательных бактерий рода Brucella из зараженной почвы или навоза применяют питательный агар с добавлением некоторых антибиотиков и кристаллвиолета, которые подавляют большинство патогенных грибов и бактерий, но не влияют на рост бруцелл. В больших концентрациях хлорид натрия подавляет рост многих бактерий, но хорошо переносится стафилококками.

Для достижения избирательности употребляют также азид, цитрат, теллурит, лаурилсульфат и селенит натрия, йод и фенилэтанол. Для этих же целей используют натуральную желчь, очищенные желчные соли и их заменители.

Среду можно сделать селективной за счет величины рН. Примера­ми является среда Сабуро для культивирования дрожжей с низким рН, а также среды с рН от 8 до 9 для выделения холерного вибриона. В последнее время в качестве веществ, придающих средам селективный характер, применяют антимикробные агенты, такие как антибиотики и другие химиотерапевтические вещества.

Элективные ПС нашли широкое применение при выделении возбу­дителей кишечных инфекций. При добавлении малахитовой или брил­лиантовой зелени, солей желчных кислот (в частности, таурохолево-кислого натрия), значительного количества хлорида натрия или ли­моннокислых солей подавляется рост кишечной палочки, но рост па­тогенных бактерий кишечной группы не ухудшается. Некоторые элек­тивные среды готовят с добавлением антибиотиков.

Среды для поддержания культуры составляют так, чтобы в них не было селективных веществ, способных вызывать изменчивость куль­тур.

Накопительные ПС (обогащения, насыщения) — это среды, на кото­рых определенные виды культур или группы культур растут быстрее и интенсивнее сопутствующих. При культивировании на этих средах обычно не применяются ингибиторные вещества, а, наоборот, создают благоприятные условия для определенного присутствующего в смеси вида. Основой сред накопления являются желчь и ее соли, тетратионат натрия, различные красители, селенитовые соли, антибиотики и др.

Консервирующие среды служат для первичного посева и транспор­тировки исследуемого материала.

Выделяют также контрольные ПС, которые применяют для контро­ля стерильности и общей бактериальной обсемененности антибиоти­ков.

По масштабам использования ПС подразделяются на:

> производственные (технологические);

> среды для научных исследований с ограниченным по объему применением.

Производственные ПС должны быть доступными, экономичными, удобными в приготовлении и использовании для крупномасштабного культивирования. Среды для научных исследований, как правило, бы­вают синтетическими и богатыми по набору питательных веществ.

Прописи применяемых в настоящее время ПС очень многообразны. Особенно вариабельны по составу, как наиболее многокомпонентные системы, прописи для клеточных культур, которые могут включать более шестидесяти компонентов.

Оптимизация многокомпонентного состава питательной среды

Несмотря на наличие большого количества работ, посвященных вопросам питания микроорганизмов, не всегда с достоверной точно­стью удается определить количественные и качественные характери­стики необходимых для развития и метаболизма клеток питательных веществ. Поэтому при конструировании новых ПС необходимо прове­дение широких исследований по выбору ПС и оптимизации качест­венных и количественных компонентов среды с целью получения наи­более желаемого результата при ее использовании.

Культивирование микроорганизмов неразрывно связано с целесо­образностью выявления оптимальных условий ведения процесса. При этом приходится иметь дело с задачами определения оптимальных параметров процесса в зависимости от выбранного критерия оптими­зации. Их решение связано с необходимостью максимизации продук­тивности процесса по бактериальной массе и минимизации затрат.

Процессы культивирования микроорганизмов можно оптимизиро­вать методами, которые разделяются на две группы.

К первой группе относятся методы оптимизации по эксперимен­тальным данным. Они не требуют привлечения сложных математиче­ских расчетов, но связаны со значительными затратами времени, воз­никающими из-за необходимости проведения большого количества экспериментальных исследований.

Ко второй группе относятся методы с применением математиче­ских моделей.

В свою очередь последние подразделяются на две отличающиеся по сложности исполнения и точности описания реального процесса подгруппы.

К первой следует отнести методы, основанные на построении ма­тематической зависимости (уравнения регрессии) протекания ограни­ченных процессов с использованием традиционного метода планиро­вания эксперимента Бокса-Уилсона. Он позволяет строить поисковые модели, когда исследователь, не располагая сведениями о механизме соблюдаемого явления, имеет лишь информацию о реакции системы на возмущение.

Ко второй подгруппе относятся методы, основанные на построении моделей, базисом которых являются законы, описывающие протекание фундаментальных процессов микробиологии (например, процесс раз­множения и отмирания микроорганизмов). В этом случае принимается за основу положение, что комплекс всех изменений, происходящих в культуральной жидкости (изменение содержания компонентов ПС, образование и расходование промежуточных продуктов биосинтеза, выделение метаболитов и катаболитов, трансформация органических соединений) - это следствие процессов самовоспроизведения, а также результат реакций, связанных с адаптацией и саморегуляцией микроб­ной популяции.

Оптимизация процессов микробиологического синтеза, основанная на использовании методов второй подгруппы, является наиболее глу­бокой и точной, хотя и более трудоемка и длинна, т.к. требует основа­тельного изучения законов протекания элементарного акта на лабора­торном уровне с целью последующего создания математической моде­ли в форме кинетических уравнений. На основе этой модели идет дальнейшая балансировка состава ПС, а также поиск оптимума основ­ных режимов ведения процесса.

Задача оптимизации управляемого периодического процесса куль­тивирования по максимизации бактериальной массы или целевого про­дукта в общем виде выглядит следующим образом: определяется наи­более рациональный состав исходной ПС, а затем профили изменения основных технологических параметров, обеспечивающих значение выбранного критерия эффективности при заданных ограничениях.

Важнейшим элементом оптимизации технологического процесса является выбор критерия эффективности. В качестве критериев ис­пользуют такие показатели, как концентрация живых микробных кле­ток, съем целевого продукта с единицы объема среды и т.д. Обычно оптимизация процесса культивирования начинается с выбора ПС, обеспечивающей питательные потребности популяции микробов или синтез максимального количества продуктов метаболизма. Количество компонентов, входящих в ПС для выращивания микро­организмов, может превышать десяток элементов. Биологической роли каждого элемента, влияющего в целом ряде случаев в микродозах на активность метаболических превращений в клетке, посвящено боль­шое число исследований.

Сложность выбора определяется еще и тем, что на рост микроор­ганизмов влияет также взаимное соотношение компонентов.

Большое количество и взаимосвязь составляющих ПС ингредиен­тов обуславливает выбор методов экспериментального исследования. Обычно используемые методы однофакторного планирования в этих условиях малоэффективны. Использование же математических мето­дов многофакторного планирования экспериментов позволяет устано­вить необходимые концентрации компонентов питания с учетом их совместного влияния на скорость роста, качество биомассы и количе­ство целевого продукта.

Обычную схему оптимизации ПС можно представить следующими этапами (схема.1).

Сбор предварительных данных о ПО и составе ПС
Выбор критерия оптимизации
Постановка эксперимента по матрице планирования
Получение обобщающей зависимости (модели)
Проверка адекватности модели и значимости коэффициентов
Оптимизация модели
Экспериментальная проверка расчетных концентраций компонентов среды
Получение прописи оптимальной ПС